Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56201
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Plasticity & Disease Modelling, Department of Developmental & Stem Cell Biology, CNRS UMR 3738, Institut Pasteur

Summary

Burada senescent her ikisi de algılamak için detaylı bir protokol ve pluripotent kök hücre iskelet kas üzerine vivo içinde yeniden programlama inducing sırasında yaralanma mevcut. Bu yöntem doku yeniden oluşturma işlemi sırasında hücresel yaşlanma rolünün değerlendirilmesi ve in vivoyeniden programlama için uygundur.

Abstract

Hücresel yaşlanma kanser ve yaşlanma gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçler için önemlidir istikrarlı hücresel büyüme krizi ile karakterize bir stres yanıttır. Son zamanlarda, yaşlanma Ayrıca doku onarımı ve rejenerasyon karıştığı olmuştur. Bu nedenle, senescent hücreleri vivotanımlamak için giderek kritik haline gelmiştir. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-Gal) tahlil senescent hücreleri hem de kültür ve in vivoalgılamak için en çok kullanılan tahlil olduğunu. Bu tahlil senescent hücreleri artan lizozomal içeriğinde lizozomal β-galaktozidaz faaliyet histochemical algılanması suboptimum pH (6 veya 5.5) sağlayan temel alır. Akış Sitometresi gibi diğer deneyleri ile karşılaştırıldığında bu doku mimari, Morfoloji, ilgili konumu gibi değerli bilgiler sunan ikamet çevreleri senescent hücrelerde tanımlaması sağlar ve Kaplin immünhistokimya (IHC) üzerinden diğer imleçli olasılığı. Büyük SA-β-Gal tahlil taze veya dondurulmuş örnekler şartı kısıtlamasıdır.

Burada, nasıl hücresel yaşlanma anlamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut hücresel plastisite ve doku rejenerasyonu içinde vivoteşvik etmektedir. SA-β-Gal senescent hücreleri iskelet kas doku rejenerasyonu çalışmaya köklü bir sistemdir yaralanma üzerine algılamak için kullanır. Ayrıca, IHC MicroRNAs, bir işaretleyici pluripotent kök hücrelerin bir transgenik fare modelinde algılamak için kullanır. Bu iletişim kuralı incelemek ve hücresel yaşlanma indüklenen hücresel plastisite ve in vivo yeniden programlama bağlamında ölçmek sağlar.

Introduction

Hücresel yaşlanma stres yanıt istikrarlı hücre döngüsü tutuklama tarafından karakterize bir şeklidir. Son on yıl içinde araştırma sıkıca yaşlanma embriyonik geliştirme, fibrozis ve1,2yaşlanma organizma da dahil olmak üzere çeşitli biyolojik ve patolojik işlemlerle ilişkili olduğunu kurmuştur. Hücresel yaşlanma ilk3kısalma telomer tarafından tetiklenen ikileştirici onların ömrü sonundaki insan fibroblast tespit edilmiştir. İkileştirici stres yanı sıra, yaşlanma, DNA hasarı, oksidatif stres, oncogenic sinyalleri ve genomik/epigenomic değişiklikler, herhangi biri sonunda p53/p21 ve/veya pRB yolları etkinleştirebilir gibi neden olabilir birçok çekim gücü vardır kurmak ve kalıcı büyüme tutuklama1güçlendirmek. Senescent hücreleri önemli özelliklerinden biri olan metabolik olarak aktif kalır ve sağlam bir yaşlanma ilişkili salgı fenotip (SASP) hızlı: salgısı birçok inflamatuar sitokinlerin, büyüme faktörleri ve hücre dışı matriks faktör4. SASP faktörler arabuluculuk ve bağışıklık hücreleri çeken ve yerel ve sistemik doku ni1değiştiren güçlü etkileri nedeniyle yaşlanma etkisi yükseltecek önemli bir rol oynamak için önerilmiştir. İlginçtir, yaşlanma son zamanlarda doku onarımı ve yenilenme için5,6önemli olmak teklif edildi. Buna ek olarak, veri--dan bizim de dahil olmak üzere birkaç labs doku zarar indüklenen yaşlanma SASPs yenilenme7-9tanıtmak için üzerinden hücresel plastisite geliştirmek önerdi. Bu nedenle, tüm gelişmekte olan verileri yaşlanma içinde vivoeğitim önemini vurgulayın.

Yazı İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC) dönemde, hücresel plastisite bir hücrenin yeni bir kimlik edinme ve farklı uyaranların her iki kültür ve in vivo10maruz alternatif bir kader benimsemeye kapasitesidir. Tam yeniden programlama elde vivo içinde11,12, olabilir bilindiği nerede ifade dört Yamanaka faktör içeren kaset: Oct4, Sox2, Klf4ve c-Myc (OSKM) indüklenen vivo içinde birden fazla organ teratomas oluşumu teşvik olabilir. Bu nedenle, bir etiketteki fare modeli (i4F) güçlü bir sistemi kritik düzenleyiciler ve hücresel plastisite11için önemli yollar tanımlamak için kullanılabilir.

Uygun ve hassas vivo içinde sistem nasıl hücresel yaşlanma anlamak önemlidir doku rejenerasyonu bağlamında hücresel plastisite düzenler. Burada, sağlam bir sistem ve yaşlanma ve doku rejenerasyonu bağlamında hücresel plastisite arasındaki bağlantıyı değerlendirmek için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Cardiotoxin (CTX) indüklenen kombinasyonu kas hasarı Tibialis Anterior (TA) kas grubunda, doku rejenerasyonu ve i4F fare modeli çalışmaya iyi kurulmuş bir sistem hücresel yaşlanma ve içinde vivo algılanmasını sağlar kas yeniden oluşturma işlemi sırasında yeniden programlama.

Hücresel plastisite ile yaşlanma arasında bağlantı değerlendirmek için i4F fare CTX ile akut kas hasarı ikna etmek için yaralı ve in vivo yeniden programlama ikna etmek için Doksisiklin ile (0.2 mg/mL) 7 gün boyunca tedavi. Bir CTX akut kas hasarı indüklenen ve rejenerasyon Protokolü son yayınlanan13, etik nedenlerle oldu iken, bu yordamı geçerli iletişim kuralında atlanacak. Senescent hücreleri zirvesine daha önce gözlemlenmiştir ne zaman14TA kas örnekleri 10 gün sonrası yaralanma13' toplanacak. Burada, bu ayrıntılı protokolünü yaşlanma (yolu ile SA-β-Gal) düzeyini ve programlama (via IHC MicroRNAs boyama) değerlendirmek için gerekli olan adımları açıklar.

Yaşlanma ile ilişkili beta-galaktozidaz (SA-β-Gal) tahlil senescent hücreler kültür ve in vivo15içinde algılamak için en sık kullanılan tahlil olduğunu. Diğer deneyleri için karşılaştırıldığında, SA-β-Gal tahlil için in vivo çalışmada özellikle önemlidir sağlam doku mimarisi ile yerel onların ortamında senescent hücreleri tanımlaması sağlar. Ayrıca, SA-β-Gal tahlil IHC kullanarak diğer işaretleri ile çift mümkündür. Ancak, SA-β-Gal tahlil örnekleri, taze veya dondurulmuş olan büyük bir sınırlama kalır gerektirir. Donmuş TA kas numuneler gibi taze veya dondurulmuş dokular düzenli olarak kullanılabilir olduğunda, SA-β-Gal belli ki senescent hücreleri algılamak için en uygun tahlil olduğunu. MicroRNAs olduğunu reprogramed hücreleri iki nedenden dolayı algılamak için kullanılan işaretleyici: 1) pluripotency için; temel bir işaretleyicidir 2) daha da önemlisi, onun ifade Doksisiklin (dox) tarafından tahrik değil, bu nedenle Yamanaka kaset zorla ifade yerine İndüklenmiş Pluripotent algılar.

Bu çalışmada sunulan boyama iletişim kuralları ayrı ayrı miktar yordamı kolaylaştırmak için yapılan, ama da senescent her ikisi de görselleştirmek için ortak boyama bir yordam ve pluripotent kök hücreler aynı bölümünde yapılabilir unutmamak önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hayvanlar ele Avrupa toplum kuralları ve Etik Komitesi Institut Pasteur (CETEA) onaylı kurallarının başı olarak.

1. hisse senedi çözümleri hazırlıkları

  1. kas örnek fiksasyon için malzemeleri hazırlayın. 0.5 g tragacanth sakız kas fiksasyon için donma katıştırma orta yapmak RT 20 mL su ile çözülür.
  2. SA-β-Gal boyama için çözümleri hazırlayın.
    1. Hisse senedi çözümleri K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), anılan sıraya göre tozu distile su içinde eriterek tarafından MgCl 2 (1 M) hazırlayın.
    2. Suda sulandrarak %0,2 C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (Eozin) hisse senedi çözüm hazırlayın.
    3. Hisse senedi çözüm (X-gal) (50 mg/mL) C 14 H 15 BrClNO 6 C 3 H 7 X-gal toz çözülerek hazırlamak yok (dimethylformamide, DMF).
    4. Mağaza K 3 Fe(CN) 6 ve K 4 Fe(CN) 6 çözüm 4 ° C'de ve dik, MgCl 2
      Not: X-gal-20 ° C'de aliquot en fazla 6 ay saklanabilir. Eozin çözüm RT muhafaza ve gerekirse süzme sonra yeniden kullanılabilir. K 3 Fe(CN) 6 ve K 4 Fe(CN) 6 çözümleri protectedfromthe ışık vardır. X-gal çözüm suda sabit değil ve ışıktan korunması gerek.
  3. MicroRNAs boyama için hazırlanması çözümleri: %0,1 Na 3 C 6 H 5 O 7 (TRISODYUM sitrat), %0,1 C 14 H 22 O permeabilization çözüm içeren (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) distile su içinde hangi depolanması gereken 4'te ° C. RT. depolanan fosfat tamponlu tuz (PBS), % 5 fetal sığır serum (FBS) içeren engelleme çözüm hazırlamak

2. SA-β-Gal Staining TA kas bölümünde donmuş

  1. fiksasyon malzeme TA kas için tragacanth küçük bir miktar koyarak bir dilim mantar sakıza hazırlayın.
  2. Yaralandı fareler her iki cinsiyette (2 ay eski, C57/B6) cardiotoxin (CDX) ile 10 gün önce 13 daha önce açıklandığı gibi yaralandı. Aynı fare (PBS enjeksiyon) TA sigara yaralı negatif kontrol kullanın. Vivo yeniden programlama isterseniz, her fare Dox (1 mg/mL) ile içme suyu (ışıktan korunan), aynı gün şu CTX yaralanma sonra tedavi.
    Not: Dox çözüm 3 günde toplam tedavi süresi 7 gün için değiştirilmesi gerekir.
    1. ( şekil 1A) 13 daha önce açıklandığı gibi fare (yaralı ve kontrol) her iki TA kasları izole. Transvers kesitler sağlamak, TA kas distal tendon tragacanth sakız yerleştirin ve kas ( şekil 1B) dışında yaklaşık ¾ bölümünü terk ve doğrudan sıvı azot içinde dondurmak için isopentane için soğutmalı < 1 min.
      Not: dik bir pozisyonda ve mantar ortasına TA kas olduğundan emin olun. Örnekleri-80 ° C veya doğrudan cryosectioned 10 µm bölümlerinde depolanan.
  3. TA kas şekil 1B adımında açıklandığı gibi işlemek.
    1. Dağıt 1 st -10 inci bölümler her slaytın üst sol konumunda on farklı slaytlar üzerine doğru sırada. 11 inci Bölüm 1 st bölümüne bitişik ilk slaytta yer; 12 inci bölüm sağ yanı sıra ikinci slayt 2 nd bölümüne yerleştirilmesi için aynı sırada takip edecek. 10 bölümleri/slayt elde edilir kadar on slaytlar (toplamda 100 bölümleri) için ilk ve son bölümleri arasındaki mesafe en az 1 mm emin olmak için bu işlemi yineleyin.
  4. 4 dk %1 paraformaldehyde ve % 0.2 oxazolidin içeren PBS için bölümleri düzeltmek. PBS, 2 x 10 dk ile yıkayın. Ardından, PBS bölümlerde kuluçkaya (pH 5.5 =) için 30 dk. RT., tüm adımları
    Not: Fiksasyonun enzimatik aktivite korumak için hafif olmak zorunda. Başlık altında bu adımı gerçekleştirin. PBS pH önemlidir ve X-gal çözüm ışıktan korunmalıdır.
  5. X-gal solüsyon içeren içinde Incubate bölümler: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 ve 400 µg/mL X-Gal PBS, pH 5.5 =. Karanlıkta 24 h yıkama en az 37 ° C'de 3 x 10 min, dik, PBS, slaytlarla kuluçkaya
    Not: Kuluçka en az 24 saat gerektirir ve SA-β-Gal sinyal en üst düzeye çıkarmak 48 saat sürebilir. Çözüm kuluçka 24 saat sonra değiştirilmesi gerekiyor. Slaytları ışıktan korunmalıdır. Eğer sadece SA-β-Gal boyama isteniyorsa, 2.5 adımla devam edin. MicroRNAs ile birlikte boyama isterseniz, lütfen ileri 3.1 FrameRelay.
    6. PBS içinde
  6. düzeltme slaytlar %1 paraformaldehyde 30 dk yıkama için PBS ile 3 x 10 dk. Counterstain % 0,2 Eozin ile slaytlar. Eozin çözüm 1 dk. için slaytları bırakın ve kısaca distile su ile yıka. Son olarak, sulu Floresanda montaj orta slaytlarla mount (Tablo malzemeleri görmek).
    Not: Sonrası fiksasyon gerçekleştirmek için önemlidir. Başlık altında bu adımı gerçekleştirin. Tüm adımlar RT. gerçekleştirilir

3. İmmünhistokimya kullanarak Anti-MicroRNAs antikor

  1. %4 paraformaldehyde için 10 dk. yıkama ile PBS, 2 x 10 dk. eklemek 200 µL slayta doğrudan permeabilization çözüm içeren PBS ile slaytlar düzeltmek ve 5 min için kuluçkaya.
    1. Yıkama slaytlar PBS, 2 x 5 min ve son yıkama, kullanım 200 µL PBS % 0.25 BSA doğrudan slaytlarda içeren. Dik, tüm bu adımları gerçekleştirmek
      Dikkat: başlık altında fiksasyon adımıysa.
  2. Incubate slaytlar ile birincil anti-MicroRNAs antikor (son konsantrasyonu: 1,25 ug/mL) % 5 içeren PBS 4 ° C'de gecede FBS. PBS, 2 x 10 dk ile slaytlar yıkama ve son makinaya kullanım 200 µL PBS % 0.25 BSA 5 dk. gerçekleştir içeren tüm çamaşır dik adımlar
    Not: buharlaşma önlemek için ıslak kağıt havlu ile bir kutu içindeki slaytları kuluçkaya.
    3. RAb-HRP ikincil antikor 100 µL ile
  3. Incubate slaytlardan kullanıma hazır kit (Tablo malzemeleri görmek) 45 dk. yıkama için PBS ile 3 x 5 dk, slaytlar için ikincil antikor kaldırın. Işıktan koruma ile RT, tüm adımları gerçekleştirin.
  4. Görselleştirme
    1. ilk olarak, 3,3 seyreltik '-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) substrat arabelleği kit (1 mL substrat tampon çözeltisi için DAB, 20 µL) kullanıma hazır tarafından sağlanan. Her slayda doğrudan DAB çözeltinin 100 µL ekleyin ve en fazla 10 dk RT. az kuluçkaya
      Not: Seyreltilmiş DAB çözüm taze hazırlanmalı ve en fazla bir hafta 4 ° C'de depolanan Kuluçka süresi arka plan sinyal en aza indirmek için ayarlanabilir ama için tüm slaytlara aynı tutulmalıdır.
    2. Su ile durulama tarafından DAB çözüm kaldırın. Hızlı kırmızı çözüm (hazır kullanmak için Tablo reçetesi görmek) slaytlarla 20 dk. yıkama su kaydıraklı tekrar kısaca counterstain.
    3. Onları % 95 etanol için 5 m ile kurutmakBuna % 100 etanol tarafından 2 x 5 dk kadar takip ettim. Son olarak, hızlı sağlamlaştırma montaj orta slaytlarla mount (Tablo malzemeleri görmek).
    4. Gözlemlemek slayt arka plan önlemek için 20 X parlak alanındaki mikroskop altında.
      Not: Hızlı kırmızı çözüm olabilir RT muhafaza ve süzme sonra yeniden kullanılan.

4. Analiz ve miktar

  1. SA-β-Gal miktar
    1. slaytları inceden inceye gözden geçirmek ve elde edilen görüntüleri baz alınarak her bir slayt üzerinde en iyi bölümleri seçin. En az 2 bölümler/TA miktar için kullanın. Bölüm yargıç ' s Kalite tabanlı üzerinde doku bütünlüğü, boyama ve kalitesini counterstaining. Miktar için SA-β-Gal miktar tüm TA kas boyunca daha iyi gösterimini sağlar maksimum olası mesafe örnekleri arasında iki yüksek kaliteli bölümlerle seçin.
    2. Miktar SA-β-Gal pozitif hücrelerinin ( Şekil 2).
      1. Belirleme piksel boyutunu el ile en küçük ve en büyük pozitif SA-β-Gal hücreleri seçerek sırası.
        1. ImageJ yazılım kullanarak taranmış slayt dijital görüntü açın.
        2. Arabirim içinde tıklatın ' analiz ' > ' araçlar ' > ' ROI Yöneticisi ' > ' analiz ' > ' ayarla ölçüm ' > ' alan seçin '. Seçim aracını kullanın ve surround en küçük ve en büyük pozitif SA-β-hücre ve yatırım Getirisi müdürüne yanında tıkırtı üstünde eklemek Gal ' Ekle '. Kullanarak boyutlarını ölçmek ' ölçü ' düğme ve değerleri daha sonra kullanmak için kaydetmek.
      2. Görünür pozitif hücreler seçilir emin olmak için eşik değerin ayarlanmasını.
        1. Convert tıklayarak gri tonlama için görüntü ' görüntü ' > ' türü ' > ' 8-bit ' ( şekil 2A). Daha sonra gitmek ' resim ' > ' ayarla ' > ' eşik ', tüm olumlu SA-β-Gal hücreleri kırmızı ( şekil 2B) ile kaplıdır kadar ikinci ele alalım, o zaman tıkırtı ' Uygula '.
        2. Tıklatarak analiz parçacıklar ' analiz ' > ' parçacıklar analiz ' > ' boyutu (piksel ^ 2) ' ve 4.1.2.1. adımda tanımlanan değeri uygulamak, girin ' Döngüsellik ': ' 0.00 1.00 ','ı tıklatın ' tamam '; a özet-in tüm sayılan parçacıklar ( şekil 2B) ROI Yöneticisi'nde gösterilir.
      3. Tüm seçili parçacıklar özgün görüntü aktarmak. El ile doğru miktar emin olmak için seçim ayarlayın. Pozitif hücrelerinin (Yeşil ok, şekil 2E) eklemek ve/veya yanlış pozitif hücre (kırmızı ok, şekil 2E) kaldırma. Son olarak, tedbir alan bölümü ( şekil 2B) kullanılarak özetleyen tarafından ' seçim aracını '. ' I tıklatın ' ROI Yöneticisi ' > ' Ekle ' > ' ölçü '.
      4. Önemlisi, bölüm alanı tarafından pozitif hücre sayısı normale.
  2. MicroRNAs miktar
    1. parlak alanını el ile 20 X büyütme, mikroskop altında MicroRNAs pozitif hücreleri saymak.
      Not: Hızlı kırmızı counterstaining iyi değerlendirilmesi TA kas morfolojisi sağlar. Ancak, boyama çok hafif ve bölümün Seviyelendirmeyi Temizle'yi yoksun. Tarayıcı kez bölümleri kenarlığını tanımlamak başarısız olur ve doğru odak olamaz. Taramadan önce bölümleri kenarlarını daire veya bölüm algılamak için daha duyarlı bir tarayıcı kullanmak için işareti kullanmak mümkündür. Geçerli iletişim kuralı için el ile MicroRNAs pozitif hücreleri saymak en verimli yoldur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kas yaralanması indüklenen hücresel yaşlanma algılama

Son zamanlarda kas yaralanması geçici hücresel yaşlanma14indükler kanıtlanmıştır. 10 gün sonrası yaralanma (DPI), bozuk myofibers çoğunluğu yenilenme merkezi konuma sahip çekirdeklerin, myofibers, yenileyici bir hallmark ile geçiren ve kas mimarisini yeniden kurulur. İnfiltrating inflamatuar hücrelerin belirli bölgelerde görünür kalan süre önemli ölçüde azalır. 10 DPI daha az çürümüş ve inflamatuar hücre boyama ile müdahale için kas mevcut olduğundan senescent hücreleri tarafından SA-β-Gal, algılamak için iyi zaman noktasıdır. Boyama özgüllüğü belirlemek için PBS ile aynı fare (şekil 1A) enjekte TA kritik bir negatif kontrol kullanılır.

SA-β-Gal pozitif hücrelerinin daha iyi ve daha hassas bir değerlendirme sağlamak için farklı bölümlerden TA kas aynı slayt (şekil 1B) yerleştirilir. Eozin ile boyama sayaç SA-β-Gal pozitif hücrelerinin ImageJ yazılım tarafından otomatik miktar için önemlidir. Eozin sayaç boyama doğru odak bölümlerle algılamak dijital tarayıcı sağlar bölüm özetliyor. Dikkatle aralığı ve algılama (şekil 2A-D) eşik tanımlamak önemlidir. Buna ek olarak, el ile küratörlüğünde bir süreç daha doğru algılama ve miktar (şekil 2E) izin vermek için önemlidir.

Vivo kas yeniden şekillendirmek için hücresel yaşlanma kolaylaştırır

Etiketteki fare modeli (i4F) hücresel plastisite ve rejenerasyon yaşlanma etkilerini değerlendirmek için ideal bir sistem sağlar. Kas yaralanması, i4F fareler dox ile programlama vivo içindeikna etmek için kabul edilir. 7 gün dox (1 mg/mL) tedavi hala iyi fareler (şekil 3A) tarafından tolere süre hücresel düzeyde yeniden programlama ikna etmek yeterli olur. Bu nedenle, biz i4F fareler dox ile 7 gün süreyle tedavi üzerinden 10 DPIs yaralı kaslara hasat.

Co SA-β-Gal MicroRNAs ile boyama gerçekleştirmek mümkün olsa da, potansiyel boyama engel nedeniyle miktar için önerilmez. Yukarıda belirtildiği gibi sayaç boyama dijital tarayıcı algılama için çok önemlidir. SA-β-Gal ile birlikte MicroRNAs için boyama en iyi counter hızlı kırmızı orhematoxylin var. Ancak, sayaç boyama SA-β-Gal veya MicroRNAs sinyal üzerinde maske. Bu nedenle, daha doğru miktar için bunları ayrı ayrı arka arkaya slaytlar (şekil 3B) gerçekleştirmek daha iyidir. SA-β-Gal pozitif ve MicroRNAs pozitif hücreler bitişik slaytlardan miktarının tarafından yaşlanma hücresel plastisite ve rejenerasyon potansiyel katılımı düşündüren onları (şekil 3 c) arasında pozitif bir korelasyon kurulmuş.

Figure 1
Şekil 1: yaşlanma düzeyi kas yaralanması sonra değerlendirmek. (A) yaşlanma ikna etmek için kullanılan kas yaralanması strateji şematik gösterimi. (B) kas bölümüne hazırlık şematik gösterimi. (C) ile Eozin counterstained boyama SAβGal temsilcisi görüntülerini. Oklar SA-β-Gal+ hücreleri üzerine gelin. Ölçek çubukları = 50 µm. SA-β-Gal+ (D) miktar hücreleri yaralı ve yaralı olmayan TA-kas. Her nokta bireysel bir hayvana karşılık gelir. İstatistiksel anlamlılık iki kuyruklu Student´s t-testi ile tespit: *** p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Miktar SA-β-Gal+ hücre ImageJ yazılım tarafından. (A-D) ekran görüntüleri ImageJ yazılım arayüzü kas bölümünde. Görüntü Gri Ölçek (A)için bir kas bölümü görüntü dönüştürme; Sa nın seçme-β-Gal + hücreleri bölümünde (B); Seçili parçacıklar (C)analiz; ROI Yöneticisi (D)sayılan particals özetini. ((E)) ekran görüntüsünü el ile küratörlüğü işlemi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: vivo içinde kas yaralanması sonra yeniden şekillendirmek için değerlendirme. (A) şematik gösterim vivo içinde yeniden programlama ve yaşlanma düzeyi kas yaralanması sonra değerlendirmek için. (B) temsilcisi görüntüleri SA-β-Gal ve MicroRNAs hasarlı kas iskelet donmuş bölümlerinde boyama. Eozin (sol); counterstained boyama SAβGal immunohistokimyasal (sağda) hızlı kırmızı ile counterstained MicroRNAs, boyama. Sigara yaralı kasları üst ve yaralı kas üzerinde gösterilir. Ölçek çubukları 50 µm. (C) = miktar ve SA-β-Gal + ve MicroRNAs+ hücreleri ardışık bölümlerde (n = 9 fare, fare başına 2 bölüm ortalama değeri temsil eder). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Birim 50 mL için
100 mM hisse senedi K3Fe(CN)6 çözüm 2 mL
100 mM K4Fe(CN)6 çözüm stok 2 mL
1 M MgCl2 100 μL
50 mg/mL X-Gal 400 μL
PBS (pH 5.5) 45,50 mL

Tablo 1: 50 mL X-gal çözüm bileşimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, senescent her ikisi de algılamak için bir yöntem ve pluripotent kök hücre içinde Bilişim farelerin kas iskelet mevcut. Bu yöntem değerlendirmek ve her iki yaşlanma ölçmek ve hücresel plastisite vivo içindeikna etmek ve yaşlanma doku onarımı ve rejenerasyon rol incelemek için kullanılabilir.

Geçerli protokol, yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-Gal) tahlil içinde vivo senescent hücreleri kas iskelet algılamak için kullanılır. Bu tahlil Bu enzim aktivite asidik pH 4,516,17, genellikle ölçülür ise özellikle senescent hücreleri ile ilişkili suboptimum pH (6.0 veya 5.5), artan lizozomal β-galaktozidaz etkinlik algılar. Bu nedenle, pH ayarlamak önemlidir (pH = 6 veya 5.5) yaşlanma ilişkili etkinlik belirli bir tespiti sağlamaktır. Buna ek olarak, sayaç Eozin ile boyama için nerede zayıf ve diffüz sinyalleri sayılmaz SA-β-Gal+ hücrelerinin miktar otomatik esastır. Potansiyel değişkenlik önlemek için aynı kişi tüm sayım işlemi gerçekleştirir tercih edilir.

SA-β-Gal tahlil en yaygın olarak kullanılan ve senescent hücrelerin biyomarker kabul olsa da, yaşlanma için özel bir işaret değil. Aşırı birleşmesi hücre kültüründe SA-β-Gal18için yanlış pozitifliği neden olabilir sürülmüştür. Testin duyarlılığı hücre türü olabilir ve doku yazın bağımlı vivo içinde19. Bu nedenle, daha fazla onaylamak ve karakterize etmek için nükleer silahların yayılmasına karşı yaşlanma arabulucu (p16, ARF, p53, p21 ve p27) artan ifade ve çeşitli SASP faktörlerin salgılanmasını eksikliği gibi diğer bağımsız kurallı işaretçileri kullanmak gereklidir yaşlanma içinde vivo. Ayrıca, doğru negatif denetimleri özellikle için in vivo çalışmada sonuçları yorumlama için vazgeçilmezdir.

SA-β-Gal tahlil değil olmasına rağmen mükemmel, bunun için in vivo çalışmada özellikle değerli bilgiler sağlar. Senescent hücreleri daha fazla rolünün anlaşılması senescent hücreler farklı fizyolojik ve patolojik kolaylaştırmak için önemli bilgileri sağlayan sağlam doku yapı ile ikamet kendi ortamlarında tespiti izin verir bağlamlarda. Ayrıca, immunostaining senescent hücre hücresel kimliğini belirlemek için hücre yüzey işaretleyicileri gibi diğer işaretleri ile birleştiğinde; ya da yaşlanma rejenerasyon ve tumorigenesis olası katılımı incelemek için stemness işaretleri. Daha önce yaşlanma ve8yeniden programlama vivo içinde arasındaki olası bağlantıyı araştırmak için MicroRNAs aynı bölümünde veya yakın ve immunohistokimyasal boyama ile SA-β-Gal tahlil gerçekleştirilmiş. Bu iletişim kuralı iskelet kas üzerine odaklanmış iken, kesinlikle diğer dokulara genişletilebilir.

Son zamanlarda, hücresel yaşlanma doku onarımı ve rejenerasyon, via SASPs7,8,9büyük olasılıkla karıştığı olmuştur. Yaşlanma doku tamir ve yeniden oluşturma işlemi için nasıl katkıda bulunduğunu mekanizmaları anlama kesinlikle büyük etkisi rejeneratif tıp olması. Bu tahlil kimliği kolaylaştırmak için önemli ve değerli bir araç sağlar ve miktar senescent in vivohücreleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Biz onun mükemmel teknik destek için Clemire Cimper için borçlu bulunmaktadır. H.L. laboratuvar çalışmalarında Institut Pasteur, Merkezi Ulusal pour la Recherche bilimsel ve Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; tarafından finanse edildi ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) ve Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. ve A.C. doktora ve doktora sonrası Burslar canlandırmak Konsorsiyumu üzerinden tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K3Fe(CN)6 Sigma 13746-66-2 For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6 Sigma 14459-95-1 For SA-β Gal staining solution
MgCl2 Sigma 7786-30-3 For SA-β Gal staining solution
X-Gal Sigma B4252 For SA-β Gal staining solution
Doxycycline Sigma D3447 For inducing in vivo reprogramming
Cardiotoxin Lotaxan Valence, France L8102 For muscle injury
Glutaraldehyde Sigma 111-30-8 For Fixation solution
Paraformaldehyde Electron microscopy science 50-980-487 For Fixation solution
NaCitrate :
Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre		 Sigma 18996-35-5 For permeabilization solution
Triton Sigma 93443 For permeabilization solution
Bovine Serum Albumin Sigma A3608 Washing solution
Antibody anti- Nanog Cell signalling 8822S Rabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) Dako K4010 For Nanog revelation
Eosin 1% Leica 380159EOF Counterstainning
Fast red Vector Laboratories H-3403 Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount Fisher scientific 9990402 Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® Sigma 25608-33-7 Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives Olympus CKX41 Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-A Abad et al., 2013 N/A Reprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide Scanner Zeiss Axio Scan Z1 slides scanning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
  2. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  3. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  4. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  5. Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
  6. Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  7. Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
  8. Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
  9. Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
  10. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
  11. Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
  12. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  13. Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
  14. Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  16. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
  19. Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

Tags

Gelişim biyolojisi sorunu 128 hücresel yaşlanma vivo içinde yeniden programlama pluripotent kök hücreler etiketteki fare modeli kas yaralanması cardiotoxin rejenerasyon yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz boyama
Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve <em>In Vivo</em> kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cazin, C., Chiche, A., Li, H.… More

Cazin, C., Chiche, A., Li, H. Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (128), e56201, doi:10.3791/56201 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter