Summary
Человека Сетчатка состоит из функционально и молекулярно различных регионов, включая фовеа, макулы и периферийных сетчатки. Здесь мы описываем метод, с помощью биопсии удара и ручного удаления слоев ткани от человеческого глаза вскрыть и собирать эти собственный сетчатки регионов для вниз по течению протеомного анализа.
Abstract
Сетчатки человеческого состоит из чувств neuroretina и базовой сетчатки пигментированной эпителия (ПЭС), который твердо complexed сосудистой сосудистое слой. Различные регионы сетчатки отличаются анатомически и молекулярно, содействуя уникальных функций и демонстрации дифференциального восприимчивости к болезням. Протеомного анализа каждого из этих регионов и слоев может обеспечить жизненно понимание молекулярных процесса многих заболеваний, в том числе возрастной макулярной дегенерации (AMD), сахарный диабет и глаукома. Однако разделение сетчатки регионов и слоев важно, прежде чем количественные протеомного анализа может быть достигнуто. Здесь мы описываем метод вскрытия и коллекции фовеа, макулы и периферийных регионов сетчатки и лежащие в основе комплекс ПЭС хориоидея, с участием региональных удар биопсии и ручного удаления слоев ткани от человеческого глаза. Одномерный SDS-PAGE, а также ниже по течению протеомного анализа, например жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS), может использоваться для идентификации белков в каждом расчлененных слое сетчатки, выявление молекулярных биомаркеров для сетчатки заболевания.
Introduction
Сетчатка, НПП и сосудистое являются сложные ткани, которые демонстрируют важные региональные различия в выражение протеина, физиологические функции и патологических восприимчивости1,2. Например таких заболеваний, как возрастной макулярной дегенерации (AMD), пигментный ретинит и Центральной серозной ретинопатии продемонстрировать характерный локализации в фовеа, макулы или сетчатки периферии1,3, 4,6. Здесь мы представляем метод демонстрирует как собственный сетчатки, регионы самостоятельно предложат. Общая цель данного метода должна служить надежным ориентиром для коллекции образцов ткани из фовеа, макулы и периферийных регионов человеческого сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа. Обоснование для разработки и использования этой методики является то, что помощью протеомного анализа этих конкретных регионов сетчатки, важно, что молекулярные исследования могут быть взяты в физиологических и патофизиологические функции этих регионов.
Этот подход обещает раскрыть proteomic основой для относительного регионального болезни восприимчивости и для облегчения идентификации новых конкретных терапевтических целей. Действительно протеомических исследований стекловидного тела и его взаимодействия с сетчатки предоставили понимание ключевых молекулярного состава и функции здоровые и больные ткани5,,78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Однако, отсутствуют четкие сравнительные протеомных анализов различных регионов сетчатки. Этот метод поможет поддержать эти столь необходимые исследования, обеспечивая преимущества по сравнению с другими методами, продемонстрировав подход к сбору надежных и воспроизводимых ткани. Более того подход является очень доступным, воспользовавшись удар стандартного размера и легко доступны ткань биопсии инструменты. Наша техника подчеркивает соответствующие сбора и хранения тканей для протеомных обработки, что делает важные соображения для стабильности белка и деградации. Таким образом этот метод является наиболее подходящим для следователей, учитывая течению молекулярный анализ proteomic факторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
это исследование было одобрено в университете штата Айова ' s институциональных Наблюдательный Совет и придерживается принципов, изложенных в Хельсинкской декларации.
1. Foveal и макулярной биопсии удар
- открытым и бабочка человеческих глаз, таким образом, что он состоит из 4 отдельных закрылки тканей, как описано в предыдущей публикации. 5
- начиная с butterflied человеческий глаз, в чашке Петри, центр инструмент биопсии удара 4-мм над фовеа, нажмите вниз и нежно рулон до тех пор, пока надрез вокруг фовеа.
- Затем создать разрез вокруг макулы, центрирование и нажав вниз инструмент биопсии кожи 8-мм удар в аркады макулы, применяя мягкое давление и прокатки. Это будет производить второй, внешнее кольцо тканей, окружающих первый.
2. Периферических сетчатки биопсии удар
- использования удар 4-мм кожи биопсии инструмент сделать серию ударов в периферийных сетчатки, просто за пределами аркада. Здесь, сделать два Пробойники для каждого квадранта лоскут.
Примечание: После того, как сделаны все пунши, глаз будет иметь два концентрических ударов в центре, представляя фовеа и макулы, и двух ударов на базе каждая на общую сумму лоскут 8 ударов в периферийных сетчатки.
3. Фовеа и макулы биопсии коллекции
- как ткани теперь готова к коллекции, собрать все биопсии ткани в отдельном отцентрифугировать трубы и заморозить, с использованием жидкого азота для последующей обработки. Хранить все образцы-80 ° c до утилизации.
- Использовать изогнутые 0.12 Colibri пинцет, чтобы захватить края полупрозрачных тканей сетчатки фовеа. Собирать, поднять и отделить фовеа ткани от базового ПЭС сосудистое.
- Аналогично, используйте 0.12 щипцы Colibri понять внешнее кольцо полупрозрачные макулы ткани. Если ткани до сих пор подключен к основной или прилегающих тканей, используйте Уэсткотт ножницы для тщательно обрежьте края, захват только сетчатки компонента и рассекает прочь любую ткань зрительного нерва, включены в Пунсе.
4. Периферические сетчатки коллекции
- используют изогнутые 0.12 Colibri щипцами осторожно отделить периферических тканей сетчатки диски от базовых ПЭС сосудистое и в рамках отдельных отцентрифугировать трубы.
- В случае остаточного стекловидное тело гель, используйте щипцы для подъема и отдельный гель от как можно больше перед коллекции ткани сетчатки. После того, как был удален сетчатки, пигментированные ПЭС сосудистое остается ниже.
5. Фовеа и макулы ПЭС-Хориоидея коллекции
- использования 0,12 Colibri щипцы понять края темные ПЭС Хориоидея ткани, которая лежит под области удалены фовеа. Осторожно отделить этой ткани от склеры и собирать.
- С использованием же щипцы, понять края наружного кольца темные ткани ПЭС хориоидея, лежащие в основе удалены макулярной области. Тщательно отделяют этой ткани от склеры, схватив края в различных точках вокруг кольца и слегка потянув. В конце концов, кольцо ПЭС Хориоидея ткани будет выбили и могут быть собраны.
Примечание: Вторичные щипцами в противоположной стороны может быть полезным в манипулировании ПЭС Хориоидея ткани во время удаления. Как ткани сетчатки, Wescott ножницы может использоваться для оказания помощи в устранении любой ткани, которая не была полностью резаная, используя средство Панч.
6. Периферических сетчатки ПЭС-Хориоидея коллекции
- использовать 0.12 Colibri щипцы для удаляйте ПЭС сосудистое в 8 районах периферийных Панч.
- Как и ранее, место ПЭС Хориоидея ткани в пробирках, отцентрифугировать и заморозить, с использованием жидкого азота для последующей обработки. Держите все образцы в-80 ° C до утилизации.
7. Ножничные рассечение
Примечание: Если лезвие биопсии удара скучно или инструмент биопсии удара не помещается достаточно трудно, могут не существовать четкие очертания окружающих тканей.
- В этих случаях ткани тронуться насколько это возможно и затем использовать Уэсткотт ножницы для обрезки и отделить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тканей ПЭС-сосудистой оболочки и сетчатки могут быть обработаны различными способами, чтобы удовлетворить отдельные расследования. После сбора исследователь будет обладать образцы сетчатки и ПЭС Хориоидея ткани от фовеа региона, внешняя макулы и периферийных сетчатки (рис. 1). В частности удар фовеа региона будет включать фовеа, parafovea и небольшое количество соседних perifovea. Макулы удар включает оставшуюся часть perifoveal региона, а также небольшое количество прилегающие вблизи периферической региона. Наконец периферийных штампы образец середине периферической и далеко периферийных регионов. В представительных эксперименте, образцы тканей были трипсина-усваивается организмом и проанализированы с использованием одномерного SDS-PAGE визуализировать содержание белка (рис. 2A). Результаты этого анализа свидетельствуют о различных белков среди различных регионов сетчатки. Анализ по жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS)6 правильно определены пептидов из родопсина, белок очень обильные и уникальный сетчатки. Представитель родопсин спектра, полученные из макулярной области показано на рисунке 2B. Дальнейший анализ содержания белка будет обеспечить понимание молекулярных функции анатомически отдельных регионов сетчатки. В случае, что вскрытие не производится тщательно, и сетчатки должным образом не отделены от НПП Хориоидея различия в содержании белка между этими двумя ткани не будет заметной.
Рисунок 1 . Сетчатки регионы. Представитель изображение здорового человека сетчатки. Сетчатки регионам выделяются пунктирной окружности, и регионов, отведать удар биопсий обозначаются закрашенные круги. Желтая пунктирная круги представляют фовеа региона, в том числе фовеа, parafovea и perifovea (путешествуя наружу из центра), а желтый сплошной круг представляет фовеа удар 4 мм. Синий круг пунктирной представляет регионе анатомические макулы, а синий твердых круг представляет макулярной удар 8 мм. Наконец розовый пунктирная круги представляют вблизи сетчатки периферийной области (около P), середины сетчатки периферийной области (середине P) и далеко периферийной области (далеко P). Розовый закрашенные круги представляют 4 мм периферийных сетчатки ударов, которые содержат в середине P и P далеко регионах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Идентификация белков сетчатки. Периферические сетчатки, макулы и фовеальное регионов были биопсию и используется для протеомного анализа. (A) одномерные SDS-PAGE и Серебряные пятная визуализирована белков в каждом регионе сетчатки. (B) образцы тканей сетчатки были предметом анализа жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Представитель спектра показано является белка родопсина, выявленных в регионе макулы. Этот спектр представляет собой один из пяти уникальных родопсин пептиды, выявленных в макуле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
После ткани коллекции, пробами и лечение являются важнейшим соображения14. Сохранение в жидком азоте отдается предпочтение перед химической фиксации, как последний может привести к повреждению структуры белков, которая может наклонять вниз по течению анализа. Кроме того сохранение жидкого азота является предпочтительным для методов, которые не предусматривают замораживание образцов. В частности, Феррер et al. показали значительные различия между образцов мозга, сохранились на 4 ° C или комнатной температуры, по сравнению с теми температуре 0 ° C15уровня белка. Кроме того важно проявлять осторожность при обработке образцов, как конкретных химических и физических лечения перед замораживанием имеет потенциал, чтобы изменить уровни белка и столб-поступательные изменения16,17. Этот момент подчеркивает важность рассмотрения предполагаемого течению анализ проб. Отдельно посмертные сроков уборки ткани является еще одним фактором, который может повлиять на уровень и стабильность специфических белков. Деградация может произойти в образце протеома в зависимости от времени хранения и посмертные температура18,19,20. Кроме того контроль за время посмертные деградации, таких как путем использования механизмов внутреннего контроля между болезнью ткани и здоровых тканей, имеет решающее значение. Если фактор времени игнорируется, деградация может исказить результаты. Как правило раньше ткани является анализируемого посмертные, тем меньше риск деградации изменить результаты изучения.
Несколько процедурных можно внести изменения в этот протокол лучше подходят для конкретных исследований вопрос. Одна модификация является, что удар биопсии кожи разного размера инструменты могут использоваться для сбора различное количество образцов ткани. Больше или меньше ткани могут потребоваться для вниз по течению proteomic обработки в зависимости от количества или стабильность специфических белков интерес. Кроме того размер штампа биопсия тканей можно определить как грубо будут отбираться конкретных регионов сетчатки или ПЭС хориоидея. Например если требуются конкретные, тонкой регионы патологической ткани, меньше кожи удар биопсии инструменты могут быть необходимы. Кроме того если раздел так хорошо, что он падает ниже возможности удар биопсии инструменты, microdissection может быть требуется21. Кроме того использование наглядных пособий, например рассечения область или увеличительное стекло, может помочь ткани коллекции процесса особенно в случае небольших размеров шара, таких как с инфантильный глазных тканей.
Наконец важно отметить, что, хотя этот метод группы ПЭС и сосудистое тканей как единый комплекс, эти ткани по-прежнему молекулярно и функционально различных. Действительно протеомов заметно отличаются между этими двумя тканей. Однако несмотря на эти различия, НПП и сосудистое остаются анатомически, функционально и клинически связаны2,6,7. Таким образом любой течению протеомного анализа ПЭС Хориоидея комплекса следует иметь в виду это ключевое различие.
Эта рукопись демонстрирует простой, надежный, низкими издержками подход к проб протеомного анализа фовеа, макулы и периферийных сетчатки и ПЭС Хориоидея ткани в глаза человека. По усмотрению следователя можно внести изменения на процесс сбора или ткани, обработка, предварительного сбора и после сбора, в зависимости от предполагаемого течению протеомного анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов объявил.
Acknowledgments
ВБМ-при поддержке грантов NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 и R21AG050437], Дорис Дьюк благотворительного фонда Грант #: 2013103 и исследования для предотвращения слепоты (ОБН), Нью-Йорк, Нью -Йорк. MT и GV поддерживаются NIH Грант T32GM007337.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759 (2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
