Biochemistry

تشريح RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين

Published: November 12, 2017 doi: 10.3791/56203

Thiago Cabral*^1,2,7,8, Marcus A. Toral*^3,4, Gabriel Velez^3,4, James E. DiCarlo^1,2, Anuradha M. Gore³, MaryAnn Mahajan³, Stephen H. Tsang^1,2, Alexander G. Bassuk^5,6, Vinit B. Mahajan^3,9

¹Barbara & Donald Jonas Stem Cell Laboratory, and Bernard & Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Pathology & Cell Biology, Institute of Human Nutrition, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, ²Edward S. Harkness Eye Institute, New York-Presbyterian Hospital, ³Omics Laboratory, Byers Eye Institute, Department of Ophthalmology, Stanford University, ⁴Medical Scientist Training Program, University of Iowa, ⁵Department of Pediatrics, University of Iowa, ⁶Department of Neurology, University of Iowa, ⁷Department of Ophthalmology, Federal University of Sao Paulo (UNIFESP), ⁸Department of Ophthalmology, Federal University of EspÍrito Santo (UFES), ⁹Palo Alto Veterans Administration, Palo Alto, CA

* These authors contributed equally

Summary

ويتألف من مناطق متميزة وظيفيا وجزيئيا، بما في ذلك منتظمة، والبقعة، والشبكية الطرفية شبكية العين البشرية. هنا، يمكننا وصف أسلوب استخدام الخزعات لكمه والإزالة اليدوية لطبقات الأنسجة من عين بشرية لتشريح وجمع هذه المناطق الشبكية متميزة لتحليل البروتين المتلقين للمعلومات.

Abstract

شبكية العين البشرية تتألف من نيوروريتينا الحسية والكامنة وراء ظهارة المصطبغة الشبكية (RPE)، الذي الرصاصية بشدة على الطبقة تشورويد الأوعية الدموية. مناطق مختلفة من الشبكية تختلف تشريحيا وجزيئيا، تسهيل مهام فريدة من نوعها، ومما يدل على وضعية للمرض. تحليل البروتين لكل من هذه المناطق والطبقات يمكن أن توفر أفكاراً حيوية في العملية الجزيئية للعديد من الأمراض، بما في ذلك ضمور بقعي أجيريلاتيد (AMD) ومرض البول السكري والزرق. ومع ذلك، فصل مناطق الشبكية وطبقات ضروري قبل أن يمكن إنجاز تحليل كمية البروتين. هنا، نحن تصف طريقة للتشريح وجمع المناطق الشبكية نقري والقرنية، والأجهزة الطرفية والكامنة وراء مجمع RPE-المشيمية، والتي تنطوي على خزعات لكمه الإقليمية والإزالة اليدوية لطبقات الأنسجة من عين بشرية. يمكن استخدام صفحة الحزب الديمقراطي الصربي أحادي الأبعاد، فضلا عن تحليل البروتين المتلقين للمعلومات، مثل السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS)، لتحديد البروتينات في كل طبقة الشبكية تشريح، الكشف عن المؤشرات الحيوية الجزيئية لأمراض الشبكية.

Introduction

الشبكية و RPE المشيمية هي الأنسجة المعقدة التي توضح الاختلافات الإقليمية الهامة في التعبير البروتين والوظيفة الفسيولوجية والمرضية مخطوطا¹^،². على سبيل المثال، تظهر الأمراض مثل تنكس بقعي أجيريلاتيد (AMD)، والتهاب الشبكية الصباغي، واعتلال الشبكية المصلي وسط كل الترجمة مميزة داخل منتظمة أو البقعة الشبكية الطرفية¹^،³^، ⁴^،⁶. نقدم هنا، طريقة تثبت الشبكية متميزة كيف يمكن تذوق المناطق بشكل مستقل. والهدف العام لهذا الأسلوب تقديم دليل موثوق به لجمع عينات الأنسجة من المناطق نقري والقرنية والطرفية RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين. الأساس المنطقي لتطوير واستخدام هذا الأسلوب أنه من خلال تحليل البروتين هذه المناطق الشبكية محددة، قد اكتسبت رؤى الجزيئية في الوظائف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية لهذه المناطق الهامة.

وعود هذا النهج الكشف عن أساس البروتين مخطوطا المرض الإقليمي النسبي، وتيسيرا لتحديد أهداف علاجية محددة جديدة. وفي الواقع، وفرت التحقيقات البروتين الجسم الزجاجي وتفاعلاته مع الشبكية أفكاراً رئيسية في التركيب الجزيئي ووظيفة الأنسجة السليمة والمريضة⁵^،^،من⁷⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³-ومع ذلك، تفتقر إلى تحليل البروتين مقارنة واضحة لمناطق الشبكية متميزة. التقنية سوف تساعد على دعم هذه الدراسات اللازم، وتوفير مزايا أكثر من غيرها من الأساليب بإظهار نهج جمع أنسجة يمكن الاعتماد عليها واستنساخه. أكثر من ذلك، النهج الوصول للغاية، مع الاستفادة من الحجم العادي ومتاحة بسهولة الأنسجة لكمه أدوات خزعة. ويؤكد لدينا تقنية مناسبة جمع وتخزين الأنسجة للبروتين التجهيز، مما يجعل من الاعتبارات الهامة للبروتين الاستقرار وتدهور. وهكذا، هذا الأسلوب الأنسب للمحققين النظر في المصب التحليل الجزيئي لعوامل البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذه الدراسة تمت الموافقة بجامعة آيوا ' s "مجلس المراجعة المؤسسية"، وتتمسك بالمبادئ المنصوص عليها في "إعلان هلسنكي".

1-فوفيل والقرنية خزعة لكمه

المفتوحة وفراشة العين البشرية، مثل أن تتكون من 4 اللوحات المنفصلة من الأنسجة، كما هو موضح في منشور سابق. ⁵
بدءاً بعين بشرية بوتيرفليد توضع في طبق بتري، مركز أداة خزعة لكمه 4 ملم أكثر منتظمة، اضغط لأسفل، ولفه بلطف حتى يتم إجراء شق حول منتظمة.
شق حول البقعة بالتوسيط والضغط أسفل أداة خزعة لكمه جلد 8 مم داخل الأروقة البقعة، وتطبيق ضغط لطيف والمتداول. هذا وسوف تنتج الطوق الخارجي، والثانية من الأنسجة المحيطة بالأول-

2. لكمه خزعة الشبكية الطرفية

استخدام لكمه الجلد 4 مم خزعة أداة لجعل سلسلة من اللكمات في الشبكية المحيطية، خارج الممرات. هنا، جعل اللكمات اثنين لكل رفرف رباعي-
ملاحظة: بعد أن تصنع جميع اللكمات والعين سوف يكون اثنين من اللكمات متحدة المركز في الوسط، تمثل منتظمة والبقعة، واللكمات اثنين في قاعدة كل رفرف مجموعها 8 اللكمات في الشبكية المحيطية.

3. منتظمة وجمع خزعة البقعة

الأنسجة جاهز الآن لجمع وجمع جميع خزعات الأنسجة في منفصلة [ميكروفوج] أنابيب وتجميد استخدام النتروجين السائل للتجهيز النهائي. تخزين جميع العينات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
استخدام ملقط Colibri منحنى 0.12 للاستيلاء على حواف أنسجة شفافة منتظمة الشبكية. جمع ورفع وفصل الأنسجة نقري من RPE-المشيمية الأساسية-
الملقط Colibri 0.12 إلى فهم الحلقة الخارجية لانسجة البقعة شفافة. إذا كان يزال مربوطا الأنسجة للأنسجة المجاورة أو المصدر، استخدام مقص وستكوت بعناية تقليم الحافة، التقاط مجرد عنصر الشبكية وتشريح بعيداً من أي أنسجة العصب البصري وشملت لكمه.

4. جمع الشبكية الطرفية

استخدام الملقط Colibri 0.12 منحنية بلطف فصل الأقراص نسيج الشبكية المحيطية RPE-المشيمية ومكان داخل الفردية [ميكروفوج] أنابيب الأساسية-
في حالة جل الزجاجي المتبقية، استخدام الملقط رفع وفصل هلام بعيداً بقدر الإمكان قبل جمع نسيج الشبكية. مرة واحدة قد أزيلت الشبكية، RPE-المشيمية المصطبغة لا يزال أدناه.

5. نقري وجمع RPE-المشيمية البقعة

الاستخدام 0.12 Colibri الملقط لفهم حواف الأنسجة المشيمية RPE الظلام التي تقع تحت مجال منتظمة إزالة. فصل هذا النسيج بعناية من الصلبة وجمع-
استخدام الملقط نفسه، فهم حواف الطوق الخارجي للأنسجة المشيمية RPE الظلام الكامنة في مجال إزالة البقعة الصفراء. عناية منفصلة هذا النسيج من الصلبة العينية باستيعاب الحواف في نقاط مختلفة حول الحلبة وسحب خفيفة. في نهاية المطاف، سوف تكون أخرجت حلقة الأنسجة المشيمية RPE ويمكن الحصول عليها-
ملاحظة: الملقط الثانوية في الجهة المقابلة يمكن أن تكون مفيدة في معالجة الأنسجة المشيمية RPE أثناء الإزالة. مقص ويسكوت مثل نسيج الشبكية، يمكن أن تستخدم للمساعدة في إزالة أي أنسجة كان غير قطعي تماما باستخدام الأداة لكمه.

6. جمع المشيمية RPE الشبكية الطرفية

استخدام الملقط Colibri 0.12 قشر بعيداً RPE-المشيمية في المناطق الطرفية لكمه 8-
وضع الأنسجة المشيمية RPE في [ميكروفوج] أنابيب كما في السابق، وتجميد استخدام النتروجين السائل للتجهيز النهائي. تبقى جميع العينات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

7. مقص التشريح

ملاحظة: إذا كانت شفرة خزعة لكمه مملة أو أداة خزعة لكمه لم يدفع ما يكفي من الثابت، قد لا توجد في الأنسجة المحيطة عمليات التطهير قطع.

في هذه الحالات، سيتم سحب الأنسجة بعيداً بقدر الإمكان، ومن ثم استخدام مقص وستكوت تقليم وفصل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن معالجة الشبكية والأنسجة المشيمية RPE بطرق مختلفة لتناسب تحقيق فردية. بعد جمع، والباحث سوف تمتلك عينات من الشبكية والأنسجة المشيمية RPE من منطقة نقري والبقعة الخارجي، والشبكية الطرفية (الشكل 1). على وجه التحديد، سوف تشمل لكمه المنطقة نقري منتظمة وبارافوفيا وكمية صغيرة من بيريفوفيا المجاورة. لكمه القرنية يشمل ما تبقى من منطقة بيريفوفيل، فضلا عن كمية صغيرة من منطقة قرب الطرفية المتاخمة. وأخيراً، عينة اللكمات المحيطية في المناطق الطرفية منتصف والمتطرف-الطرفية. في تجربة تمثيلية، كان يهضم التربسين عينات الأنسجة وتحليلها باستخدام صفحة الحزب الديمقراطي الصربي أحادي البعد لتصور محتوى البروتين (الشكل 2A). وتوحي نتائج هذا التحليل البروتينات متميزة بين مختلف مناطق الشبكية. وحدد التحليل بالسائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS)⁶ بشكل صحيح الببتيدات من رهودوبسن, بروتين شبكية وفرة عالية وفريدة من نوعها. ويبين الشكل 2Bطائفة رودوبسين تمثيلية التي تم الحصول عليها من منطقة البقعة الصفراء. ستوفر المزيد من التحليل لمحتوى البروتين ثاقبة وظائف الجزيئية لمناطق متميزة تشريحيا الشبكية. في الحالة التي لا يتم التشريح بعناية، وعدم فصل الشبكية بشكل صحيح عن RPE-المشيمية، الاختلافات في محتوى البروتين بين هذه الأنسجة اثنين لن يكون ملموسا.

الشكل 1 . مناطق الشبكية. صورة تمثيلية للشبكية البشرية الصحية. يلقي الضوء على مختلف مناطق الشبكية دوائر منقط، ومناطق عينات من خزعات لكمه المشار إليها بواسطة دوائر صلبة. أصفر منقط دوائر تمثل منطقة نقري، منها منتظمة وبارافوفيا، وبيريفوفيا (السفر إلى الخارج من مركز)، بينما دائرة صفراء صلبة يمثل لكمه نقري 4 مم. دائرة زرقاء منقطة يمثل منطقة القرنية التشريحية، في حين يمثل دائرة زرقاء صلبة لكمه القرنية 8 مم. أخيرا، تمثل دوائر منقط وردي المنطقة المحيطية الشبكية القريب (قرب ف)، منتصف المنطقة المحيطية الشبكية (منتصف ف)، والمنطقة المحيطة الآن (ف الآن). وتمثل دوائر صلبة الوردي اللكمات الشبكية المحيطية 4 مم، التي تحتوي على منطقتي ف منتصف والآن ف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 . تحديد البروتينات الشبكية. وكانت الشبكية المحيطية، والبقعة، ومناطق نقري فحص والمستخدمة لتحليل البروتين. (أ) One-Dimensional الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وتلطيخ فضية تصور البروتينات في كل منطقة الشبكية. (ب) تخضع عينات الأنسجة الشبكية لتحليل السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS). الطيف الممثل سيظهر من البروتين رودوبسين المحددة في منطقة البقعة الصفراء. هذا الطيف يمثل واحدة من خمس الببتيدات رودوبسين الفريدة المحددة في البقعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بعد الأنسجة يتم جمع ومعالجة عينة ومعالجة الاعتبارات الحاسمة¹⁴. يفضل حفظها في النتروجين السائل على التثبيت الكيميائي، كما هذا الأخير قد ينتج عنه تلف لهيكل البروتين، التي يمكن أن تحرف تحليل المتلقين للمعلومات. بالإضافة إلى ذلك، يفضل الحفاظ على النتروجين السائل للأساليب التي لا تنطوي على تجميد عينات. جدير بالذكر أن فيرير et al. أظهرت فروق كبيرة في مستويات البروتين بين العينات الدماغ الحفاظ على 4 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة، مقارنة بتلك التي تخزن في 0 ° ج¹⁵. علاوة على ذلك، من المهم أن تكون حذراً عند تجهيز العينات، كمعالجة كيميائية وفيزيائية محددة قبل تجميد لديه القدرة على تغيير مستويات البروتين والتعديلات بوستترانسلاشونال¹⁶^،¹⁷. وتؤكد هذه النقطة أهمية النظر في تحليل العينات المتلقين المقصودين. كل على حدة، هو توقيت الجثة من حصاد الأنسجة عامل آخر يمكن أن يؤثر على مستويات والاستقرار لبروتينات محددة. يمكن أن يحدث تدهور للبروتين العينة تبعاً للوقت بعد الوفاة وتخزين الحرارة¹⁸^،¹⁹^،²⁰. وعلاوة على ذلك، التحكم بالوقت تدهور بعد الوفاة، كما هو الحال باستخدام الضوابط الداخلية بين أمراض الأنسجة والأنسجة السليمة، أمر حاسم. إذا كان يتم تجاهل عامل التوقيت، يمكن أن تحرف تدهور النتائج. وكقاعدة عامة، كلما الأنسجة هو تحليل الجثة، خطر أقل للتدهور إلى تغيير نتائج الدراسة.

يمكن جعل هذا البروتوكول عدة تعديلات إجرائية يناسب سؤال محدد لبحث بشكل أفضل. تعديل واحد أن حجم مختلف الجلد لكمه خزعة أدوات قد تستخدم لجمع كميات مختلفة من عينات الأنسجة. الأنسجة أقل أو أكثر قد يكون مطلوباً للبروتين المتلقين للمعلومات المعالجة تبعاً للكمية أو الاستقرار لبروتينات محددة من الفائدة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد حجم الأنسجة خزعة لكمه صارخ كيف سيتم أخذ عينات مناطق محددة من الشبكية أو RPE-المشيمية. على سبيل المثال، إذا كانت مطلوبة من مناطق محددة، وغرامة من أنسجة مرضية، لكمه الجلد أصغر خزعة أدوات قد تكون ضرورية. وعلاوة على ذلك، إذا كان مقطع على ما يرام حتى أنها تنخفض قدرات أدوات خزعة لكمه، قد يكون ميكروديسيكشن المطلوب²¹. بالإضافة إلى ذلك، استخدام المعينات البصرية، مثل نطاق أو المكبرة، تشريح قد المعونة جمع الأنسجة عملية لا سيما في حالات أحجام أصغر من أنحاء العالم، كما هو الحال مع أنسجة العين عند الأطفال.

وأخيراً، من المهم أن نلاحظ أنه رغم هذا الأسلوب جماعات RPE والأنسجة choroid كمجمع واحد، لا تزال هذه الأنسجة متميزة جزيئيا ووظيفيا. وفي الواقع، بروتيوميس تختلف بشكل ملحوظ بين هذه الأنسجة اثنين. ومع ذلك، وبالرغم من هذه الاختلافات، RPE والمشيميه تظل تشريحيا ووظيفيا، وسريريا مرتبطة²^،^،من⁶⁷. وبالتالي أي تحليل البروتين المصب مجمع RPE-المشيمية ينبغي أن تضع في اعتبارها هذا التمييز الرئيسية.

هذه المخطوطة يدل على نهج مباشرة، ويمكن الاعتماد عليها، منخفضة-النفقات العامة لجمع العينات لتحليل البروتين منتظمة، والبقعة، والشبكية الطرفية والأنسجة RPE-المشيمية في العين البشرية. في السلطة التقديرية للمحقق، يمكن إجراء تعديلات على عملية جمع أو الأنسجة المناولة، جمع ما قبل وما بعد جمع، واعتماداً على تحليل البروتين المتلقين المقصودين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

VBM تدعمها المنح المعاهد الوطنية للصحة [K08EY020530، R01EY024665، R01EY025225، R01EY024698، و R21AG050437], "دوريس ديوك الخيرية منحة من مؤسسة" #: 2013103، وإجراء البحوث لمنع العمى (تجمع الشعب البوروندي)، نيويورك، نيويورك. طن متري وغف معتمدة من قبل المعهد الوطني للصحة منح T32GM007337.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]