Biochemistry

人视网膜解剖与 RPE-脉络膜的蛋白质组分析

Published: November 12, 2017 doi: 10.3791/56203

Thiago Cabral*^1,2,7,8, Marcus A. Toral*^3,4, Gabriel Velez^3,4, James E. DiCarlo^1,2, Anuradha M. Gore³, MaryAnn Mahajan³, Stephen H. Tsang^1,2, Alexander G. Bassuk^5,6, Vinit B. Mahajan^3,9

¹Barbara & Donald Jonas Stem Cell Laboratory, and Bernard & Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Pathology & Cell Biology, Institute of Human Nutrition, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, ²Edward S. Harkness Eye Institute, New York-Presbyterian Hospital, ³Omics Laboratory, Byers Eye Institute, Department of Ophthalmology, Stanford University, ⁴Medical Scientist Training Program, University of Iowa, ⁵Department of Pediatrics, University of Iowa, ⁶Department of Neurology, University of Iowa, ⁷Department of Ophthalmology, Federal University of Sao Paulo (UNIFESP), ⁸Department of Ophthalmology, Federal University of EspÍrito Santo (UFES), ⁹Palo Alto Veterans Administration, Palo Alto, CA

* These authors contributed equally

Summary

人类视网膜由功能和分子的不同区域组成, 包括黄斑、黄斑和外周视网膜。在这里, 我们描述了一个方法使用穿孔活检和手工清除组织层从人眼解剖和收集这些不同的视网膜区域的蛋白质组分析。

Abstract

人视网膜由感觉 neuroretina 和底层的视网膜色素上皮 (RPE) 组成, 它与血管脉络膜层紧密地复合。视网膜的不同区域是解剖学上和分子上的区别, 促进独特的功能和证明差异易感性的疾病。蛋白质组分析的每个区域和层可以提供重要的洞察力的分子过程中的许多疾病, 包括年龄相关的黄斑变性 (AMD), 糖尿病和青光眼。然而, 在进行定量蛋白质组分析之前, 视网膜区域和层的分离是必不可少的。在这里, 我们描述了解剖和收集的中心, 黄斑, 和周边视网膜区域和底层 RPE-脉络膜复合体的方法, 涉及区域穿孔活检和手工清除组织层从人眼。一维 SDS 页以及下游蛋白质组学分析, 如液相色谱-串联质谱 (LC-ms), 可用于识别每个解剖视网膜层的蛋白质, 揭示视网膜疾病的分子标志物。

Introduction

视网膜、RPE 和脉络膜是复杂的组织, 在蛋白质表达、生理功能和病理敏感性方面表现出重要的区域差异¹^,²。例如, 与年龄相关的黄斑变性 (AMD)、视网膜色素变性和中央浆液性视网膜病变等疾病都表现出在凹、黄斑或视网膜周围的特征定位¹^,³^, ⁴^,⁶。在这里, 我们提出了一个方法来演示如何独立取样的视网膜区域。该方法的总体目标是提供一个可靠的指南, 收集的组织样本从中心, 黄斑, 周边地区的人视网膜和 RPE-脉络膜的蛋白质组分析。这一技术的发展和应用的基本原理是, 通过对这些特定的视网膜区域的蛋白质组分析, 可以获得重要的分子洞察力, 这些区域的生理和病理功能。

这种方法有望揭示相关区域疾病敏感性的蛋白质组基础, 并有助于确定新的具体治疗目标。事实上, 蛋白质组学对玻璃体及其与视网膜相互作用的研究为健康和患病组织的分子组成和功能提供了重要的洞察力⁵^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³. 然而, 对不同的视网膜区域缺乏明确的比较蛋白质组分析。该技术将有助于支持这些急需的研究, 提供比其他方法的优势, 通过展示一个可靠的和可再生的组织收集方法。更重要的是, 该方法是非常容易获得的, 利用标准和现成的组织穿孔活检工具。我们的技术强调适当的收集和储存组织的蛋白质组处理, 使重要的考虑蛋白的稳定性和降解。因此, 这种方法是最适合的研究者考虑下游分子分析蛋白质的因素。

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Protocol

这项研究是由爱荷华大学和 #39 的机构审查委员会批准的, 并遵循《赫尔辛基宣言》中所规定的原则.

1. 中心和黄斑活检穿孔

打开和蝶形人眼, 如前一出版物所述, 它由4独立的组织瓣组成. ⁵
开始时, butterflied 人眼放置在培养皿中, 将一个 4 mm 的穿孔活检工具放在凹窝上, 向下按压, 然后轻轻滚动, 直到在凹腹周围进行切口.
接下来, 在黄斑的拱廊内, 通过居中并按下一个 8 mm 的皮肤穿孔活检工具, 在黑点周围产生切口, 施加柔和的压力和滚动。这将产生第二个外环的组织周围的第一.

2。外周视网膜活检穿孔

使用 4 mm 的皮肤穿孔活检工具在外围视网膜上进行一系列击打, 就在拱廊外。在这里, 为每个象限襟翼做两拳.
注: 在所有的拳打后, 眼睛将有两个同心拳在中心, 代表中央凹和黄斑, 两个拳在底部的每瓣-总计8拳在周边视网膜.

3。凹和黄斑活检收集

当组织现在准备好收集, 收集所有组织活检在分开的离心管和冷冻使用液氮为下游处理。将所有样品存储在-80 和 #176; C 直到使用.
使用弯曲的 0.12 Colibri 钳抓住视网膜凹的半透明组织的边缘。从底层视网膜色素上皮中收集、提升和分离中心组织.
同样, 使用 0.12 Colibri 钳来抓住半透明的黄斑组织的外环。如果组织仍然连接到基础或相邻组织, 使用一副保罗·韦斯科特剪刀仔细修剪边缘, 捕获只是视网膜成分和解剖的任何视神经组织包括在冲床.

4。周边视网膜采集

使用弯曲的 0.12 Colibri 钳将周围的视网膜组织瓣轻轻分开, 从底层的 RPE-脉络膜, 并在单个离心管中放置.
在残留的玻璃体凝胶的情况下, 使用镊子解除和分离的凝胶尽可能多之前收集的视网膜组织。一旦视网膜被移除, 色素 RPE-脉络膜仍在下方.

5。中心和黄斑视网膜色素上皮集合

使用 0.12 Colibri 钳来抓住暗 RPE-脉络膜组织的边缘, 位于所移除凹区的下方。仔细分离这个组织从巩膜和收集.
使用同样的钳子, 抓住边缘的黑暗 RPE-脉络膜组织的基础上清除黄斑区。仔细地把这个组织从巩膜上分离出来, 抓住环周围不同点的边缘, 轻轻地拉。最终, RPE-脉络膜组织的环会脱落, 并可能被收集.
注意: 相反手上的二次钳在去除视网膜色素上皮组织的过程中可以起到帮助作用。像视网膜组织, Wescott 剪刀可以用来帮助删除任何组织, 没有完全切割使用冲床工具.

6。外周视网膜 rpe-脉络膜集合

使用 0.12 Colibri 钳将 RPE-脉络膜剥离到8外围冲头区域.
如前所述, 将 RPE-脉络膜组织置于离心管中, 并使用液氮进行下游加工。将所有样品保持在-80 和 #176; C 直到使用.

7。剪刀解剖

注意: 如果穿孔活检刀片是钝的或穿孔活检工具不够用力, 可能不会有一个 clean-cut 周围的组织.

在这些情况下, 尽可能地将组织拉离, 然后使用保罗·韦斯科特剪刀修剪和分离.

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Representative Results

视网膜和 RPE-脉络膜组织可以以各种方式进行处理, 以适应个人的调查。收集后, 研究员将拥有视网膜和 RPE-脉络膜组织从中心地区, 外黄斑和周边视网膜 (图 1) 的样本。具体来说, 中心区域冲床将包括凹, parafovea, 和少量的相邻 perifovea。黄斑冲头包括 perifoveal 区的其余部分以及邻近近周边区域的少量。最后, 对 mid-peripheral 和远外围区域进行了外围冲压。在一个代表性的实验中, 组织样本的胰蛋白酶消化和分析使用 one-dimensional SDS 页, 以可视化蛋白质含量 (图 2A)。这一分析的结果表明, 不同区域的视网膜中有明显的蛋白质。液相色谱-串联质谱分析 (LC-ms)⁶正确识别出视中的多肽, 一种非常丰富和独特的视网膜蛋白。从黄斑区获得的有代表性的视谱显示在图 2B中。对蛋白质含量的进一步分析将提供对视网膜解剖上不同区域的分子功能的洞察。在不仔细进行解剖的情况下, 视网膜与 RPE-脉络膜没有适当分离, 这两个组织之间的蛋白质含量差异将无法辨别。

图 1.视网膜区域.一个健康的人类视网膜的代表形象。不同的视网膜区域被点状圆所突出, 而用穿孔活检取样的区域用实心圆圈表示。黄色的虚线圆圈代表中心区域, 包括凹、parafovea 和 perifovea (从中心向外移动), 而黄色实心圆圈代表 4 mm 中心冲床。蓝色的斑点圆圈代表解剖黄斑区, 而蓝色实心圆圈代表8毫米黄斑穿孔。最后, 粉红色的虚线圆圈代表近视网膜周边区域 (近 p)、视网膜中部周边区域 (中 p) 和远周边区域 (远 p)。粉红色实心圆圈代表4毫米外周视网膜穿孔, 其中包含中 p 和远 p 区域。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2.视网膜蛋白的鉴定.外周视网膜、黄斑和中心区活检, 用于蛋白质组学分析。(A)一维 SDS 页和每一个视网膜区域的银染色可视化蛋白。(B)视网膜组织样品受液相色谱-串联质谱法 (LC-ms) 分析。所示的代表性光谱是在黄斑区发现的视蛋白。这个光谱代表了五种独特的视肽中的一种。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

组织收集后, 样品处理和处理是至关重要的考虑因素¹⁴。液氮的保存优于化学固定, 因为后者可能导致蛋白质结构的破坏, 这可能会扭曲下游分析。此外, 液氮保存是首选的方法, 不涉及冻结样品。值得注意的是, 与0° c¹⁵相比, Ferrer et al.在4° c 或室温下保存的脑样品的蛋白质水平有显著差异。此外, 重要的是要小心, 当处理样品, 由于特定的化学和物理治疗前冷冻有可能改变蛋白质水平和修饰修改¹⁶^,¹⁷。这一点强调了考虑预期的下游样品分析的重要性。另外, 组织收获的验尸时间是影响特定蛋白质水平和稳定性的另一个因素。根据时间剖验和存储温度¹⁸^、¹⁹^、²⁰, 对样本蛋白质组可能会发生降级。此外, 控制时间的事后降解, 如通过使用内部控制疾病组织和健康组织, 是至关重要的。如果忽略计时因子, 则降级可能会扭曲结果。通常情况下, 组织的解剖越早, 对研究结果的降解风险就越小。

可以对该协议进行一些程序性修改, 以更好地适应特定的研究问题。一个修改是, 不同大小的皮肤穿孔活检工具可以用来收集不同数量的组织样本。根据感兴趣的特定蛋白的数量或稳定性, 可能需要较少或更多的组织来进行蛋白质组的下游处理。此外, 组织穿孔活检的大小可以确定如何严重的特定区域的视网膜或 RPE-脉络膜将被取样。例如, 如果需要特定的、精细的病理组织区域, 则可能需要更小的皮肤穿孔活检工具。此外, 如果一个部分是如此之细, 它低于的穿孔活检工具的能力, 切割可能需要²¹。此外, 使用视觉辅助, 如解剖范围或放大镜, 可能有助于组织收集过程-特别是在较小的全球大小的情况下, 如婴儿眼部组织。

最后, 重要的是要注意, 虽然这项技术组的视网膜色素上皮和脉络膜组织作为一个单一的复杂, 这些组织保持分子和功能不同。事实上, 这两种组织之间的蛋白质有明显差异。然而, 尽管有这些差异, RPE 和脉络膜仍然是解剖学上的, 功能上和临床上的链接²^,⁶^,⁷。因此, 任何下游蛋白质组分析的 RPE-脉络膜复合体应牢记这一关键的区别。

这份手稿证明了一个简单的, 可靠的, 低的方法, 样本收集蛋白质分析的凹, 黄斑, 外周视网膜和 RPE-脉络膜组织的人眼。根据调查人员的判断, 可以对收集过程或组织处理、pre-collection 和 post-collection 进行修改, 具体取决于预期的下游蛋白质组分析。

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Disclosures

未声明任何利益冲突。

Acknowledgments

VBM 得到 NIH 的资助 [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 和 R21AG050437], 桃乐丝杜克慈善基金会补助金: 2013103, 并研究, 以防止失明 (填料), 纽约, 纽约州。MT 和 T32GM007337 得到 NIH 的资助。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]