Dissektion af menneskelige nethinde og RPE-choroidea proteom analyse

Summary

Den menneskelige nethinde består af funktionelt og molekylært forskellige regioner, herunder fovea, gule plet og perifere retina. Her, beskriver vi en metode ved hjælp af punch biopsier og manuel fjernelse af væv lag fra en menneskelige øje at dissekere og indsamle disse særskilte retinal regioner for downstream proteom analyse.

Abstract

Den menneskelige nethinde er sammensat af de sensoriske neuroretina og den underliggende retinal pigmenteret epitel (ÅV), som er fast kompleksbundet til vaskulær plexus lag. Forskellige områder af nethinden er anatomisk og molekylært adskilte, lette unikke funktioner og demonstrere differential modtagelighed for sygdom. Proteom-analyse af hver af disse regioner og lag kan give afgørende indsigt i de molekylære proces af mange sygdomme, herunder aldersbetingede Macula Degeneration (AMD), diabetes mellitus og grøn stær. Adskillelse af retinale regioner og lag er imidlertid afgørende, før kvantitative proteom analyse kan opnås. Her, beskriver vi en metode til dissektion og samling af foveal, makulært og perifere retinale regioner og underliggende ÅV-choroidea kompleks, der inddrager regionale punch biopsier og manuel fjernelse af væv lag fra en menneskelige øje. Endimensional SDS-PAGE samt downstream proteom analyse, såsom liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS), kan bruges til at identificere proteiner i hvert dissekeret retinal lag, afslørende molekylære markører for retinal sygdom.

Introduction

Nethinden, ÅV og årehinden er komplekse væv, der viser vigtige regionale forskelle i protein udtryk, fysiologiske funktion og patologiske modtagelighed^1,2. For eksempel, vise sygdomme som aldersbetingede Macula Degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, og central serøs retinopati hver karakteristiske lokalisering i fovea, gule plet eller nethinden periferien^{1,3, 4,6}. Her præsenterer vi en metode viser, hvordan forskellige retinal regioner kan udtages uafhængigt. Det overordnede mål med denne metode er at give en pålidelig guide til samling af vævsprøver fra foveal, makulært og perifere regioner i den menneskelige nethinde og RPE-choroidea proteom analyse. Begrundelsen for udvikling og anvendelse af denne teknik er der gennem proteom analyse af disse specifikke retinal regioner, vigtige molekylære indsigt kan opnås i de fysiologiske og patofysiologiske funktioner i disse regioner.

Denne tilgang lover at afsløre proteom grundlaget for relative regionale sygdom modtagelighed, og til at lette identifikationen af nye specifikke terapeutiske mål. Faktisk, proteom undersøgelser af glaslegemet og dens samspil med nethinden har givet indsigt i de molekylære sammensætning og funktion af sund og syge væv^{5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. imidlertid klart sammenlignende proteom analyser af forskellige retinal regioner mangler. Teknikken, der vil bidrage til at støtte disse meget nødvendige undersøgelser, giver fordele i forhold til andre metoder ved at demonstrere en pålidelig og reproducerbar væv samling tilgang. Mere så er tilgangen meget tilgængeligt, at drage fordel af standardstørrelse og let tilgængelige væv punch biopsi værktøjer. Vores teknik understreger passende indsamling og opbevaring af væv til proteom behandling, at gøre vigtige overvejelser for protein stabilitet og nedbrydning. Således, denne metode er mest hensigtsmæssige for efterforskerne overvejer downstream Molekylær analyse af proteom faktorer.

Protocol

denne undersøgelse blev godkendt ved University of Iowa ' s institutionelle Review Board og overholder de grundsætninger, der er anført i Helsinki-erklæringen.

1. Foveal og makulært biopsi Punch

1. åben og butterfly menneskelige øje, således at det består af 4 separate sildelapper af væv, som beskrevet i en tidligere publikation. ⁵
2. begynder med en butterflied menneskelige øje anbringes i en petriskål, centrere en 4-mm punch biopsi værktøj over fovea, Tryk ned, og rul forsigtigt indtil et snit er lavet omkring fovea.
3. Næste, generere et snit omkring den gule plet af centrering og at trykke ned en 8-mm hud punch biopsi værktøj i arkaderne i den gule plet, blid pressionsmiddel og rullende. Dette vil producere en anden, ydre ring af vævet omkring første.

2. Perifer Retinal biopsi Punch

1. Brug 4-mm hud punch biopsi værktøj til at lave en serie af slag i den perifere retina, lige uden for arcade. Her, at to slag for hver kvadrant flap.
   Bemærk: Efter alle slag er lavet, øjet vil have to koncentriske slag i midten, der repræsenterer fovea og gule plet, og to slag i bunden af hver klap-sammentælling 8 slag i den perifere nethinde.

3. Fovea og Macula biopsi indsamling

1. som væv er nu klar til afhentning, indsamle alle væv biopsier i separate mikrofuge rør og fryse ved hjælp af flydende nitrogen til downstream forarbejdning. Gemme alle prøver på-80 ° C indtil udnyttelse.
2. Bruge en buet 0,12 Colibri pincet til at få fat i kanterne af det gennemsigtige væv af den retinale fovea. For at indsamle, ophøje og adskille de foveal væv fra den underliggende ÅV-årehinden.
3. På samme måde, bruge 0,12 Colibri pincet til at forstå den ydre ring af det gennemskinnelige macula væv. Hvis væv er stadig knyttet til underliggende eller tilstødende væv, bruger et par Westcott saks omhyggeligt trimme kanten, erobrede bare komponenten retinal og dissekere væk alle optiske nervevæv inkluderet i punch.

4. Perifere Retina indsamling

1. Brug de buede 0,12 Colibri pincet til at forsigtigt adskille perifere retinale væv diske fra den underliggende ÅV-årehinden og sted i enkelte mikrofuge rør.
2. For resterende glasagtige gel, bruge pincet til at løfte og adskille gel væk så meget som muligt før samling af den retinale væv. Når nethinden er blevet fjernet, den pigmenterede ÅV-choroidea forbliver nedenfor.

5. Foveal og gule plet ÅV-choroidea indsamling

1. Brug 0,12 Colibri pincet til at forstå kanterne af mørke ÅV-choroidea væv, der ligger under området af den fjernede fovea. Forsigtigt adskille dette væv fra sclera og indsamle.
2. Ved hjælp af den samme pincet, forstå kanterne af den ydre ring af mørke ÅV-choroidea væv ligger til grund for den fjernede makulært område. Omhyggeligt adskille dette væv fra sclera ved at gribe fat i kanterne på forskellige punkter rundt i ringen og let at trække. Til sidst, ringen af ÅV-choroidea væv vil blive fortrængt og kan indsamles.
   Bemærk: Sekundære pincet i den modsatte side kan være nyttige i at manipulere ÅV-choroidea væv under fjernelse. Ligesom den retinale væv, Wescott saks kan bruges til at hjælpe med at fjerne alle væv, der ikke var fuldt indsnit ved hjælp af værktøjet punch.

6. Perifere Retina ÅV-choroidea indsamling

1. bruge 0,12 Colibri pincet til at skrælle væk ÅV-choroidea i områderne 8 perifere punch.
2. Som tidligere placere ÅV-choroidea væv i mikrofuge rør og fryse ved hjælp af flydende nitrogen til downstream forarbejdning. Holde alle prøver på-80 ° C indtil udnyttelse.

7. Saksen dissektion

NOTE: Hvis punch biopsi blade er kedelig eller værktøjet punch biopsi er ikke presset hårdt nok, kan der ikke være en clean-cut omkringliggende væv.

1. i disse tilfælde trække væv væk så meget som muligt, og derefter bruge Westcott saks til at trimme og adskille.

Representative Results

Retinal og RPE-choroidea væv kan behandles på forskellige måder der passer til en individuel undersøgelse. Efter samling, vil forskeren besidder prøver af retinal og RPE-choroidea væv fra foveal region, ydre macula og perifere retina (figur 1). Specifikt, vil foveal region punchen omfatte fovea, parafovea og en lille mængde af de tilstødende perifovea. Den makulært punch omfatter resten af regionen perifoveal samt en lille mængde af de tilstødende nær perifere region. Endelig, de perifere slag prøve midten perifere og langt-perifere regioner. I et repræsentativt eksperiment, vævsprøver blev trypsin-fordøjet og analyseret ved hjælp af endimensional SDS-PAGE til at visualisere proteinindhold (figur 2A). Resultaterne af denne analyse foreslår forskellige proteiner blandt de forskellige regioner i nethinden. Analyse af liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS)⁶ identificeret korrekt peptider fra rhodopsin, et protein, der meget rigelige og unikke nethinden. En repræsentant rhodopsin spektret opnået fra regionen Macula er vist i figur 2B. Yderligere analyse af proteinindhold vil give indsigt i de molekylære funktioner i de anatomisk adskilte områder af nethinden. I tilfælde af at dissektion ikke er udført omhyggeligt, og nethinden ikke er ordentligt adskilt fra ÅV-årehinden, vil forskelle i proteinindhold mellem disse to væv ikke være mærkbar.

Figur 1 . Retinal områder. Et repræsentativt billede af en sund menneskelige nethinde. Forskellige retinal regioner er fremhævet af punkteret kredse og regioner samplet af punch biopsier angives ved hjælp af udfyldte cirkler. Den gule punkteret cirkler repræsenterer den foveal region, herunder fovea, parafovea og perifovea (rejser udad fra centrum), mens den gule massiv cirkel repræsenterer 4 mm foveal punch. Den blå prikkede cirkel repræsenterer anatomiske makulært regionen, mens den blå massiv cirkel repræsenterer 8 mm makulært punch. Endelig, de lyserøde punkterede cirkler repræsenterer den i nærheden af retinale randområde (nær P), midten af retinale perifere region (midt P) og langt randområde (langt P). De lyserøde udfyldte cirkler repræsenterer 4 mm perifere retina slag, som indeholder regionerne midt P og langt P. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 . Identifikation af retinale proteiner. Perifere nethinden, macula og foveal regioner var biopsi og anvendes til proteom analyse. (A) One-Dimensional SDS-PAGE og sølv farvning visualiseret proteiner i hver retinal region. (B) nethinden vævsprøver blev underlagt liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) analyse. Det repræsentative spektrum vist er af rhodopsin protein identificeret i regionen Macula. Dette spektrum repræsenterer en af fem unikke rhodopsin peptider identificeret i den gule plet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Efter væv er indsamling, prøve håndtering og behandling afgørende betragtninger¹⁴. Opbevaring i flydende nitrogen foretrækkes frem for kemiske fiksering, da sidstnævnte kan resultere i skader til protein struktur, som kunne vride downstream analyse. Derudover er flydende kvælstof bevarelse foretrækkes frem for metoder, som ikke indebærer indefrysning af prøver. Navnlig Ferrer et al. viste betydelige forskelle i protein niveauer mellem hjernen prøver bevaret på 4 ° C eller stuetemperatur, i forhold til dem, der opbevares ved 0 ° C¹⁵. Yderligere, er det vigtigt at være forsigtig, når behandling af prøver, som særlige kemiske og fysiske behandling før frysning har potentiale til at ændre protein niveauer og posttranslationelle modifikationer^16,17. Dette punkt understreger vigtigheden af at overveje den tilsigtede downstream analyse af prøver. Separat, er post mortem timingen af væv høst en anden faktor, der kan påvirke niveauer og stabilitet af specifikke proteiner. Nedbrydning kan forekomme at prøve proteomet afhængigt af tid post mortem og opbevaring temperatur^18,19,20. Desuden er kontrollerer for tiden post mortem nedbrydning, som ved brug af interne kontrolelementer mellem sygdom væv og raske væv, afgørende. Hvis timingen faktor ignoreres, kan nedbrydning forvrænge resultater. Som en generel regel, jo hurtigere er væv analyseret slagtning, mindre risiko for nedbrydning til at ændre undersøgelsens resultater.

Række proceduremæssige ændringer kan foretages i denne protokol der passer bedre til et bestemt problemformulering. En ændring er, at forskellige størrelse hud punch biopsi værktøjer kan bruges til at indsamle forskellige beløb af vævsprøver. Mere eller mindre væv kan være nødvendigt for downstream proteom behandling afhængig af mængde eller stabilitet af specifikke proteiner af interesse. Endvidere, størrelsen af væv punch biopsi kan bestemme, hvor groft de bestemte områder af nethinden eller ÅV-choroidea vil udtages. For eksempel, hvis specifikke, fine regioner af patologisk væv er påkrævet, kan mindre hud punch biopsi værktøjer behov. Desuden, hvis en sektion er så fint, at det falder til under kapaciteter af punch biopsi værktøjer, microdissection kan være påkrævet²¹. Desuden kan brug af visuelle hjælpemidler, såsom et dissekere muligheder eller Forstørrelsesglas, støtte samlingen væv proces-især i tilfælde af mindre globe størrelser, såsom med infantile øjenvæv.

Endelig er det vigtigt at bemærke, at mens denne teknik grupper ÅV og plexus væv som et enkelt kompleks, disse væv forbliver molekylemæssigt og funktionelt adskilte. Faktisk, proteomes varierer markant mellem disse to væv. Dog, på trods af disse forskelle, ÅV og årehinden forblive anatomisk, funktionelt og klinisk i forbindelse med^2,6,7. Således bør enhver downstream proteom analyse af ÅV-choroidea kompleks huske på denne vigtige skelnen.

Dette manuskript viser en ligetil, pålidelige, lav overhead tilgang til prøvetagning for proteom analyse af fovea, gule plet, og perifere nethinde og RPE-choroidea væv i menneskets øjne. Skøn af investigator, kan være foretaget ændringer enten samling proces eller væv håndtering, før samling og efter samling, afhængigt af den påtænkte downstream proteom-analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]