Summary
Het menselijke netvlies is samengesteld uit functioneel en moleculair verschillende regio's, met inbegrip van de fovea, macula en perifere retina. Hier beschrijven we een methode met behulp van punch biopsieën en handmatig verwijderen van de lagen weefsel van een menselijk oog te ontleden en deze verschillende retinale regio's voor downstream Proteoom analyse te verzamelen.
Abstract
Het menselijke netvlies is samengesteld uit de sensorische neuroretina en de onderliggende retinale pigment epitheel (RPE), die is stevig complexvorm aan de vasculaire choroideus laag. Verschillende regio's van het netvlies zijn anatomisch en moleculair verschillend, vergemakkelijking van unieke functies en demonstreren van differentiële gevoeligheid voor ziekte. Proteoom analyse van elk van deze regio's en lagen kan belangrijke inzicht verwerven in de moleculaire proces van vele ziekten, waaronder Age-Related macula degeneratie (LMD), diabetes mellitus en glaucoom. Scheiding van retinale regio's en lagen is echter noodzakelijk voordat kwantitatieve Proteoom-analyse kan worden bereikt. Hier beschrijven we een methode voor dissectie en verzameling van de foveal, macula en perifere Retina regio's en onderliggende RPE-vaatvlies complex, waarbij regionale punch biopsieën en handmatig verwijderen van de lagen weefsel van een menselijk oog. Eendimensionale SDS-pagina evenals downstream Proteoom analyse, zoals vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS), kan worden gebruikt voor identificatie van eiwitten in elke ontleed retinale laag, moleculaire biomarkers voor retinale ziekte onthullen.
Introduction
Het netvlies, vaatvlies en RPE zijn complexe weefsels waaruit belangrijke regionale verschillen in eiwit expressie, fysiologische functie en pathologische gevoeligheden1,2. Bijvoorbeeld, tonen ziekten zoals Age-Related macula degeneratie (LMD), retinitis pigmentosa en centrale sereuze retinopathie elke karakteristiek localisatie binnen de fovea, macula of netvlies periferie1,3, 4,6. Hier presenteren we een methode aan te tonen hoe verschillende retinal regio's kunnen onafhankelijk worden bemonsterd. Het algemene doel van deze methode is een betrouwbare gids om te verzamelen van weefselmonsters uit de foveal, macula en perifere gebieden van de menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse. De reden voor de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is dat door middel van Proteoom analyse van deze specifieke retinale gebieden, belangrijke moleculaire inzichten kunnen worden verkregen tot de functies van het fysiologische en pathofysiologische van deze regio's.
Deze aanpak belooft te onthullen de proteomic-basis voor relatieve regionale ziekte gevoeligheden, en de identificatie van nieuwe specifieke therapeutische doelen te vergemakkelijken. Inderdaad, proteomic onderzoeken van het glasvocht en zijn interacties met het netvlies hebben verstrekt belangrijke inzichten in de moleculaire samenstelling en functie van gezonde en zieke weefsel5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. echter, duidelijke vergelijkende proteomic analyses van verschillende retinale gebieden ontbreken. De techniek helpt ter ondersteuning van deze broodnodige studies, bieden voordelen ten opzichte van andere methoden door het tonen van een betrouwbare en reproduceerbare weefsel collectie aanpak. Meer nog, de aanpak is heel toegankelijk, profiteren van standaardformaat en gemakkelijk beschikbaar weefsel punch biopsie tools. Onze techniek benadrukt de juiste inzameling en opslag van weefsels voor proteomic verwerking, waardoor belangrijke overwegingen voor eiwitstabiliteit en afbraak. Dus, deze methode is meest geschikt voor onderzoekers downstream moleculaire analyse van proteomic factoren te overwegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
deze studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Iowa ' s institutionele Review Board en houdt zich aan de beginselen die zijn uiteengezet in de verklaring van Helsinki.
1. Foveal en Macula Biopsy Punch
- Open en vlinder het menselijk oog, zodanig dat het bestaat uit 4 aparte flappen van weefsel, zoals beschreven in een eerdere publicatie. 5
- beginnen met een butterflied menselijk oog geplaatst in een petrischaal, een 4-mm punch biopsie tool centreren over de fovea druk naar beneden en zachtjes rollen totdat een incisie rond de fovea gemaakt.
- Genereren vervolgens een incisie rond de macula door centreren en te drukken op down een 8-mm huid punch biopsie instrument binnen de arcades van de macula, zachte druk uit te oefenen en rollen. Dit zal een tweede, de buitenste ring van weefsel rondom de eerste produceren.
2. Perifere Retina Biopsy Punch
- Gebruik de punch 4-mm huid biopsie hulpmiddel om een serie van stoten in de perifere retina, net buiten de arcade. Hier, maken twee stoten voor elk kwadrant klep.
Opmerking: Nadat alle de stoten zijn gemaakt, het oog twee concentrische stoten in het midden hebben zal, die de fovea en macula, vertegenwoordigt en twee aan de basis van elke klep-totaal stoten 8 stoten in de perifere retina.
3. Fovea en Macula biopsie collectie
- zoals het weefsel nu klaar voor inzamelen is, verzamelen van alle weefsel biopsieën in aparte microfuge buizen en bevriezen met behulp van vloeibare stikstof voor downstream processing. Alle monsters bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
- Gebruiken een gebogen 0,12 Colibri pincet te grijpen van de randen van het doorschijnend weefsel van de retinale fovea. Verzamelen, verheffen en de foveal weefsels scheiden van de onderliggende RPE-vaatvlies. De verlostang Colibri 0,12
- ook gebruiken om te begrijpen van de buitenste ring van het doorschijnende macula weefsel. Als het weefsel is nog steeds gekoppeld aan onderliggende of aangrenzende weefsel, kunt u een paar van schaar Westcott zorgvuldig trim de rand, net het netvlies onderdeel vastleggen en ontleden weg een weefsel van de oogzenuw opgenomen in de punch.
4. Perifere Retina collectie
- gebruiken de gebogen 0,12 Colibri pincet voorzichtig de perifere retinale weefsel schijven te scheiden van de onderliggende RPE-vaatvlies en plaats binnen de afzonderlijke microfuge buizen.
- In het geval van residuele glasvocht gel, gebruikt u de verlostang om te heffen en te scheiden van de gel weg zoveel mogelijk vóór de verzameling van het netvlies weefsel. Zodra het netvlies is verwijderd, de gepigmenteerde RPE-vaatvlies blijft onder.
5. Foveal en Macula RPE-vaatvlies collectie
- Gebruik de 0.12 Colibri pincet te begrijpen van de randen van het donkere RPE-vaatvlies weefsel dat onder het gebied van de verwijderde fovea ligt. Zorgvuldig scheiden dit weefsel van de sclera en verzamel.
- Met behulp van de verlostang dezelfde, begrijpen de randen van de buitenste ring van donkere RPE-vaatvlies weefsel ten grondslag liggen aan het verwijderde macula gebied. Zorgvuldig dit weefsel van de sclera door grijpen de randen op verschillende punten rond de ring en licht trekken te scheiden. Uiteindelijk, de ring van RPE-vaatvlies weefsel zal worden verdreven en mogen worden verzameld.
Opmerking: Secundaire pincet in de tegengestelde hand kunnen nuttig zijn in het manipuleren van de RPE-vaatvlies weefsel tijdens de verwijdering. Zoals het netvlies weefsel, Wescott schaar kan worden gebruikt om te helpen bij het verwijderen van alle weefsel dat was niet volledig ingesneden met het gereedschap stempel.
6. Perifere Retina RPE-vaatvlies collectie
- gebruik van de verlostang Colibri 0,12 schil weg de RPE-vaatvlies in de 8 gebieden van de perifere punch.
- Zoals eerder, plaats het weefsel RPE-vaatvlies in microfuge buizen en bevriezen met behulp van vloeibare stikstof voor downstream processing. Houden van alle monsters bij-80 ° C tot benutting.
7. Scissor dissectie
Opmerking: als het blad van de biopsie punch saai is of de punch biopsie tool is niet hard genoeg geduwd, kan niet er een clean-cut rondom het weefsel.
- In deze gevallen, trek het weefsel weg zoveel mogelijk, en gebruik vervolgens Westcott schaar te trimmen en aparte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retina en RPE-vaatvlies weefsel kunnen op verschillende manieren aan een afzonderlijk onderzoek worden verwerkt. Na het verzamelen bezitten de onderzoeker monsters van de retina en RPE-vaatvlies weefsel uit de foveal regio, buitenste macula en perifere retina (Figuur 1). In het bijzonder zal de foveal regio punch omvatten de fovea, de parafovea en een kleine hoeveelheid van de aangrenzende perifovea. De macula punch omvat de rest van de perifoveal-regio evenals een kleine hoeveelheid van de aangrenzende in de buurt van-perifere regio. Tot slot, proef de perifere stoten de mid perifere en ver-perifere regio's. In een representatieve experiment, weefselsteekproeven waren trypsine-verteerd en geanalyseerd met behulp van eendimensionale SDS-pagina te visualiseren eiwitgehalte (figuur 2A). De resultaten van deze analyse suggereren verschillende eiwitten onder de verschillende regio's van het netvlies. Analyse door vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)6 naar behoren geïdentificeerd van rodopsine, een zeer overvloedige en unieke netvlies eiwit peptiden. Een representatieve rhodopsine spectrum verkregen uit de macula regio wordt weergegeven in figuur 2B. Nadere analyse van het eiwitgehalte zal inzicht verwerven in de moleculaire functies van de anatomisch verschillende regio's van het netvlies. In het geval dat de dissectie niet zorgvuldig wordt uitgevoerd en het netvlies niet goed gescheiden is van de RPE-vaatvlies, zal verschillen in gehalte aan andere melkeiwitten tussen deze twee weefsels niet waarneembaar.
Figuur 1 . Netvlies gebieden. Een representatief beeld van een gezonde menselijke netvlies. Verschillende retinale regio's zijn gemarkeerd door de gestippelde cirkels, en regio's bemonsterd door punch biopten worden aangeduid met gevulde cirkels. De gele gestippelde cirkels de foveal regio vertegenwoordigen, met inbegrip van de fovea, parafovea en perifovea (reizen naar buiten vanuit middelpunt), terwijl de gele gevulde cirkel vertegenwoordigt de foveal punch van 4 mm. De blauwe gestippelde cirkel vertegenwoordigt de anatomische maculaire regio, terwijl de blauwe gevulde cirkel de macula punch van 8 mm vertegenwoordigt. Tot slot vertegenwoordigen de roze gestippelde cirkels de in de omgeving van retinale perifere regio (in de buurt van P), mid retinale perifere regio (midden P), en veel perifere regio (veel P). De roze gevulde cirkels vertegenwoordigen de 4 mm perifere retina stoten, waarin de regio's Mid P en veel P. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Identificatie van retinale eiwitten. Foveal regio's, perifere retina en macula waren biopsied en gebruikt voor proteoom-analyse. (A) Eendimensionele SDS-pagina en zilveren kleuring gevisualiseerd eiwitten in elke retinale regio. (B) netvlies weefselsteekproeven werden onderworpen aan de analyse van de vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Het representatieve spectrum komt te staan is van het eiwit van rodopsine geïdentificeerd in de macula regio. Dit spectrum is een van de vijf unieke rhodopsine peptiden geïdentificeerd in de macula. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Na weefsel zijn collectie, sample handling en behandeling cruciaal overwegingen14. Behoud in vloeibare stikstof heeft de voorkeur boven chemische fixatie, zoals de laatste kan resulteren in schade aan eiwitstructuur, die stroomafwaarts analyse kan scheeftrekken. Daarnaast is de vloeibare stikstof behoud aangenamer zijn wanneer u de methoden die geen bevriezing van monsters. Met name Ferrer et al. toonde significante verschillen in eiwitniveaus tussen hersenen monsters bewaard bij 4 ° C of kamer temperatuur, vergeleken met die opgeslagen bij 0 ° C15. Verder, is het belangrijk om voorzichtig te zorgen bij de verwerking van de monsters, als specifieke chemische en fysische behandeling voordat invriezen heeft het potentieel om eiwitniveaus en posttranslationele modificaties16,17te wijzigen. Dit punt benadrukt het belang rekening te houden met de beoogde downstream analyse van monsters. Afzonderlijk, is post mortem timing van weefsel oogsten een andere factor die niveaus en de stabiliteit van specifieke proteïnen kan beïnvloeden. Afbraak kan optreden aan het monster Proteoom afhankelijk van tijd post mortem en opslag temperatuur18,19,20. Bovendien is regelen voor de aantasting van het post mortem van de tijd, zoals door gebruik van interne controles tussen ziekte weefsel en gezond weefsel, van cruciaal belang. Als de timing factor wordt genegeerd, kan aantasting resultaten scheef. Als algemene regel, hoe eerder is het weefsel geanalyseerde post-mortem, het minder risico voor aantasting te wijzigen van de studieresultaten.
Verschillende procedurele wijzigingen kunnen worden aangebracht bij dit protocol aan een specifieke onderzoeksvraag aanpassen. Een wijziging is dat verschillende grootte huid punch biopsie hulpmiddelen mogen worden gebruikt voor het verzamelen van verschillende hoeveelheden van weefselmonsters. Minder of meer weefsel kan worden verlangd voor downstream proteomic verwerking afhankelijk van aantal of stabiliteit van specifieke proteïnen van belang. Bovendien kan de grootte van de biopsie van weefsel punch bepalen hoe zwaar de specifieke regio's van het netvlies of RPE-vaatvlies zal worden bemonsterd. Bijvoorbeeld, als specifieke, fijne regio's van pathologische weefsel vereist zijn, kunnen kleinere huid punch biopsie tools nodig zijn. Bovendien, als een sectie zo fijn is dat het daalt hieronder de mogelijkheden voor punch biopsie tools, microdissection mogelijk vereiste21. Bovendien, kan het gebruik van visuele hulpmiddelen, zoals een ontleden scope of Vergrootglas, steun de weefsel collectie proces-met name in gevallen van kleinere bol, zoals met infantiele oogbeschadigingen en/of weefsel.
Tenslotte is het belangrijk op te merken dat terwijl deze techniek de RPE en choroideus weefsels als een enkel complex groepen, deze weefsels moleculair en functioneel verschillend blijven. Inderdaad, de proteomes verschillen sterk tussen deze twee weefsels. Echter, ondanks die deze verschillen en het vaatvlies en RPE anatomisch, functioneel en klinisch blijven gekoppeld2,6,7. Dus mogen elke stroomafwaartse Proteoom analyse van het complex RPE-vaatvlies niet vergeten dit belangrijke onderscheid.
Dit manuscript toont een eenvoudige, betrouwbare, lage overhead benadering van sample collectie voor proteoom-analyse van de fovea en perifere retina en macula, RPE-vaatvlies weefsel in menselijke ogen. Goeddunken van de onderzoeker, kunnen wijzigingen worden aangebracht bij het proces van het verzamelen of weefsel behandeling, pre-collectie en na collectie, afhankelijk van de beoogde downstream Proteoom-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
VBM is ondersteund door subsidies van de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 en R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 en onderzoek te voorkomen blindheid (RPB), New York, NY. MT en GV worden ondersteund door de NIH T32GM007337 verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759 (2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
