Summary
La rétine humaine est composée de régions fonctionnellement et moléculairement distinctes, y compris la fovéa, la macula et la rétine périphérique. Nous décrivons ici une méthode à l’aide de biopsies punch et élimination manuelle des couches de tissu d’un œil humain de disséquer et recueillir ces régions rétiniennes distinctes pour l’analyse protéomique en aval.
Abstract
La rétine humaine se compose de la neuroretina sensorielle et le sous-jacent épithélium pigmentaire rétinien (RPE), qui est fermement complexé à la couche choroïde vasculaire. Différentes régions de la rétine sont anatomiquement et moléculairement distinctes, faciliter les fonctions uniques et montrant la différence de susceptibilité à la maladie. Analyse protéomique de chacune de ces régions et couches peut fournir des informations vitales dans le processus moléculaire de nombreuses maladies, notamment la dégénérescence maculaire de l’Age (DMLA), diabète sucré et le glaucome. Toutefois, la séparation des régions rétiniennes et des couches est essentielle avant l’analyse protéomique quantitative peut être effectuée. Nous décrivons ici une méthode de dissection et collection des régions rétiniens fovéale, maculaires et périphériques et sous-jacent pre-choroïde complexe, impliquant des biopsies punch régional et élimination manuelle des couches de tissus de l’oeil humain. Unidimensionnel SDS-PAGE, mais aussi l’analyse protéomique en aval, comme la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS), peut servir à identifier les protéines dans chaque couche rétinienne disséqué, révélant des biomarqueurs moléculaires de la maladie de la rétine.
Introduction
La rétine, RPE et choroïde sont des tissus complexes qui démontrent des différences régionales importantes dans l’expression de la protéine, une fonction physiologique et pathologique de susceptibilités1,2. Par exemple, les maladies comme la dégénérescence maculaire de l’Age (DMLA), rétinite pigmentaire et Rétinopathie séreuse centrale chaque démontrent localisation caractéristique dans la fovéa, macula ou rétine périphérie1,3, 4,6. Nous présentons ici une méthode démontrant comment distincte rétinienne régions peuvent être dégustées de façon indépendante. L’objectif général de cette méthode est de fournir un guide fiable pour la collecte des échantillons de tissu des centrale, maculaires et les zones périphériques de la rétine humaine et pre-choroïde pour l’analyse protéomique. La raison d’être pour le développement et l’utilisation de cette technique est que par le biais de l’analyse protéomique de ces régions rétiniennes spécifiques, importantes aperçus moléculaires peuvent être acquise dans les fonctions physiologiques et physiopathologiques de ces régions.
Cette approche promet de révéler le fondement de la protéomique de susceptibilités de maladie régionale relative et pour faciliter l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques. En effet, enquêtes de protéomique du corps vitré et ses interactions avec la rétine ont permis de mieux comprendre clés la composition moléculaire et la fonction des tissus sains et malades5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Toutefois, les analyses protéomique comparative claire des régions distinctes de rétiniens manquent. La technique vous aidera à soutenir ces études indispensables, offrant des avantages par rapport aux autres méthodes en présentant une collection tissus fiables et reproductibles. Plus encore, l’approche est très accessible, profitant du poinçon de taille standard et facilement accessibles des tissus outils de biopsie. Notre technique met l’accent sur la collection appropriée et le stockage des tissus pour la protéomique traitement, faire des considérations importantes pour la stabilité des protéines et de la dégradation. Ainsi, cette méthode est plus appropriée pour les enquêteurs, considérant en aval analyse moléculaire des facteurs de la protéomique.
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Protocol
cette étude a été approuvée par l’Université de l’Iowa ' s Institutional Review Board et adhère aux principes énoncés dans la déclaration d’Helsinki.
1. Foveal et maculaire Punch biopsie
- ouvert et butterfly l’oeil de l’homme, telle qu’elle se compose de 4 volets distincts du tissu, comme décrit dans une publication précédente. 5
- en commençant par un œil humain papillon placé dans une boîte de Pétri, centrez un outil de biopsie de poinçon de 4 mm sur la fovéa, appuyez vers le bas et rouler doucement jusqu'à ce qu’une incision est faite autour de la fovéa.
- Générer ensuite une incision autour de la macula de centrage et enfonçant un outil de biopsie de poinçon de peau de 8 mm dans les arcades de la macula, exerçant une pression modérée et rouler. Cela produira un deuxième anneau externe du tissu qui entoure le premier.
2. Punch de biopsie rétinienne périphérique
outil biopsie- utiliser le poinçon de 4 mm peau de faire une série de coups de poing dans la rétine périphérique, juste à l’extérieur de l’arcade. Ici, faire deux coups de poing pour chaque volet du quadrant.
Remarque : Après tous les coups sont faits, l’oeil aura deux poinçons concentriques dans le centre, ce qui représente la fovéa et la macula, et deux poinçons à la base de chaque rabat-totalisant 8 perce dans la rétine périphérique.
3. Fovéa et Macula biopsie Collection
- comme le tissu est maintenant prêt pour la collecte, recueillir toutes les biopsies de tissus dans des microtubes distinct et congeler à l’aide d’azote liquide pour le traitement en aval. Conserver tous les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Utilisez une pince courbe de Colibri 0,12 pour saisir les bords du tissu translucide de la fovéa rétinienne. Collecter, élever et séparer les tissus fovéale de la pre-choroïde sous-jacente.
- De même, utiliser la pince Colibri 0,12 à saisir la bague extérieure du tissu translucide macula. Si le tissu est encore attaché au tissu adjacent ou sous-jacent, utiliser une paire de ciseaux Westcott pour couper avec précaution le bord, capturant le composant rétiniens et dissection de loin n’importe quel tissu de nerf optique inclus dans le punch.
4. Collection de rétine périphérique
- utiliser la pince courbée de Colibri 0,12 pour séparer doucement les disques du périphérique de tissu rétinien de la pre-choroïde sous-jacente et dans des microtubes individuels.
- En cas de gel vitréen résiduel, utiliser la pince pour soulever et séparer le gel là autant que possible avant le prélèvement du tissu rétinien. Après avoir retiré la rétine, la choroïde-RPE pigmentée demeure au-dessous de.
5. Fovéale et Macula pre-choroïde Collection
- pince Colibri utilisation la 0,12 à saisir les bords du tissu pre-choroïde sombre qui se trouve sous la zone de la fovéa supprimée. Séparez avec précaution ce tissu de la sclérotique et la collect.
- à l’aide de la pince même, saisissez les bords de l’anneau externe du tissu de pre-choroïde sombre qui sous-tendent la zone maculaire supprimée. Séparez avec précaution ce tissu de la sclère en saisissant les bords en différents points autour de l’anneau et en tirant légèrement. Finalement, l’anneau de pre-choroïde tissu va être délogé et peuvent être obtenu.
NOTE : Secondaire pince dans la main opposée peut être utiles pour manipuler le tissu pre-choroïde au moment du retrait. Comme le tissu rétinien, Wescott ciseaux peut être utilisé pour faciliter le retrait de tous les tissus qui n’était pas entièrement incisés à l’aide de l’outil de perforation.
6. Collection de pre-choroïde rétine périphérique
- utiliser la pince Colibri 0,12 à se pour décoller de la pre-choroïde dans les zones périphériques poinçon 8.
- Comme auparavant, placez le tissu pre-choroïde dans des microtubes et congeler à l’aide d’azote liquide pour le traitement en aval. Conserver tous les échantillons à-80 ° C jusqu'à utilisation.
7. Ciseaux de Dissection
Remarque : si la lame de biopsie de poinçon est terne ou l’outil de biopsie de punch n’est pas poussé assez dur, il peut être pas un le tissu environnant épuré.
- Dans ces cas, le tissu écarter autant que possible, puis utilisez les ciseaux Westcott pour couper et séparer.
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Representative Results
Rétinienne et tissu pre-choroïde peuvent être traitées de différentes façons pour répondre à une enquête individuelle. Après le prélèvement, le chercheur possédera des échantillons de la rétine et pre-choroïde du tissu la région fovéale, extérieur macula et rétine périphérique (Figure 1). Plus précisément, le poinçon de la région centrale comprendra la fovéa, le parafovea et une petite quantité de la perifovea adjacent. Le poinçon maculaire englobe le reste de la région de perifoveal, mais aussi une petite quantité de la région de près de-périphérique adjacente. Enfin, les coups de poing périphériques déguster les régions Mid- périphériques et de loin-périphérique. Dans une expérience représentative, échantillons de tissus ont été digérés par la trypsine et analysées à l’aide unidimensionnel SDS-PAGE pour visualiser le contenu en protéines (Figure 2 a). Les résultats de cette analyse suggèrent des protéines distinctes entre les différentes régions de la rétine. Analyse par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS)6 correctement identifiés de peptides de la rhodopsine, une protéine de la rétine très abondant et unique. Un spectre de rhodopsine représentatifs provenant de la région maculaire est illustré à la Figure 2 b. Une analyse plus approfondie de la teneur en protéines fournira un aperçu des fonctions moléculaires des régions anatomiquement distinctes de la rétine. Dans le cas où la dissection n’est pas exécutée avec soin, et la rétine n’est pas correctement séparée de la RPE-choroïde, teneur en protéines des différences entre ces deux tissus ne sera pas perceptibles.
Figure 1 . Les régions rétiniennes. Une image représentative de la rétine humaine en bonne santé. Différentes régions rétiniennes sont mises en évidence par les cercles en pointillés, et régions échantillonnées par biopsies punch sont indiquées par des cercles pleins. Le jaune les cercles en pointillés représentent la région centrale, y compris la fovéa, parafovea et perifovea (voyage vers l’extérieur du centre), tandis que le cercle solid jaune représente le poinçon fovéale de 4 mm. Le cercle en pointillé bleu représente la région maculaire anatomique, tandis que le cercle solid bleu représente le poinçon maculaire de 8 mm. Enfin, les roses cercles en pointillés représentent la région rétinienne périphérique (près de P), proche mi région périphérique rétinienne (milieu P) et région périphérique loin (loin P). Les roses cercles pleins représentent les poinçons de rétine périphérique de 4 mm, qui contiennent les régions Mid P et P jusqu'à maintenant. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Identification des protéines rétiniennes. Les régions centrale, macula et rétine périphérique ont été biopsiés et est utilisé pour l’analyse protéomique. (A) système SDS-PAGE et coloration à l’argent visualisé protéines dans chaque région de la rétine. (B) des échantillons de tissus rétine ont été soumis à l’analyse de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS). Le spectre représentatif indiqué est de la protéine rhodopsin identifiée dans la région maculaire. Cette partie du spectre constitue l’un des cinq peptides rhodopsine uniques identifiés dans la macula. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Après le tissu manipulation des échantillons, de collecte et de traitement sont des considérations essentielles14. Conservation dans l’azote liquide est préférable à une fixation chimique, car ce dernier peut causer des dommages à la structure des protéines, qui puisse fausser l’analyse en aval. En outre, préservation de l’azote liquide est préférable aux méthodes qui n’impliquent pas la congélation des échantillons. Notamment, Ferrer et coll. ont montré des différences significatives dans les taux de protéines entre cerveau échantillons conservés à 4 ° C ou à température ambiante, par rapport à ceux qui sont stockés à 0 ° C15. En outre, il est important d’être prudent lors du traitement des échantillons, comme le traitement chimique et physique spécifique avant le gel a le potentiel de modifier les taux de protéines et de modifications post-traductionnelles16,17. Ce point met l’accent sur l’importance de considérer l’analyse prévue en aval des échantillons. Séparément, calendrier post-mortem de la récolte de tissus est un autre facteur qui peut affecter les niveaux et la stabilité des protéines spécifiques. Dégradation peut se produire pour le protéome échantillon selon temps post-mortem et stockage température18,19,20. Par ailleurs, le contrôlant dégradation du temps post-mortem, comme par l’utilisation de contrôles internes entre la maladie et le tissu sain, est crucial. Si le facteur temps est ignoré, la dégradation pourrait fausser les résultats. En règle générale, plus le tissu est analyse post mortem, le moins de risques de dégradation de modifier les résultats de l’étude.
Plusieurs modifications procédurales sont possibles au présent protocole pour mieux satisfaire à une question de recherche spécifiques. Une modification est qu’outils de taille différente peau punch biopsie peuvent servir à recueillir les différentes quantités d’échantillons de tissus. Tissu moins ou plus peut-être être nécessaire pour la protéomique en aval de traitement selon la quantité ou la stabilité des protéines spécifiques d’intérêt. En outre, la taille de la biopsie tissulaire peut déterminer comment grossièrement les régions spécifiques de la rétine ou pre-choroïde seront échantillonnées. Par exemple, si des régions spécifiques, fines du tissu pathologique sont nécessaires, des outils plus petits peau punch biopsie peuvent être nécessaire. En outre, si une section est si fine qu’elle tombe en dessous les fonctionnalités des outils de punch biopsie, microdissection peut être requis21. En outre, l’utilisation de supports visuels, comme une dissection étendue ou loupe, peut aider la collection de tissus processus, en particulier en cas de plus petite taille du globe, comme avec les tissus oculaires infantiles.
Enfin, il est important de noter que, bien que cette technique regroupe les RPE et la choroïdes tissus comme un seul complexe, ces tissus restent moléculairement et fonctionnellement distinctes. En effet, les protéomes diffèrent considérablement entre ces deux tissus. Cependant, malgré que ces différences, la RPE et choroïde restent anatomiquement et fonctionnellement, cliniquement liée2,6,7. Ainsi, toute analyse protéomique en aval du complexe pre-choroïde devrait garder à l’esprit cette distinction essentielle.
Ce manuscrit montre une approche simple, fiable, peu de charge de prélèvement d’échantillons pour l’analyse protéomique de la fovéa, macula et rétine périphérique et tissu pre-choroïde de l’oeil humain. À la discrétion de l’enquêteur, les modifications peuvent être effectuées sur le processus de collecte ou sur tissu manutention, pré-collecte et après le prélèvement, selon l’analyse protéomique en aval prévue.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
VBM est soutenue par des subventions de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 et R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 et la recherche pour prévenir la cécité (RPB), New York, NY. MT et GV sont pris en charge par les NIH grant T32GM007337.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
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