Summary
Die menschliche Netzhaut besteht aus funktional und molekular verschiedene Regionen, einschließlich der Fovea, der Makula und der peripheren Netzhaut. Hier beschreiben wir eine Methode mit Stanzbiopsien und manuelle Entfernung von Gewebeschichten von einem menschlichen Auge zu zerlegen und diese verschiedenen retinalen Regionen für nachgeschaltete Proteomic Analysen zu sammeln.
Abstract
Die menschliche Netzhaut besteht aus der sensorischen Neuroretina und die zugrunde liegenden Netzhaut pigmentierten Pigmentepithels (RPE), ist fest auf die vaskuläre choroid Schicht komplexiert. Verschiedene Regionen der Netzhaut unterscheiden sich anatomisch und molekular, einzigartige Funktionen zu erleichtern und zeigen unterschiedliche Anfälligkeit für Krankheiten. Proteomic Analysen der einzelnen Regionen und Schichten bieten wichtige Einblicke in den molekularen Prozess von vielen Krankheiten, einschließlich altersbedingter Makula-Degeneration (AMD), Diabetes Mellitus und Glaukom. Trennung von retinalen Regionen und Schichten ist jedoch unerlässlich, bevor quantitative Proteomik Analyse erreicht werden kann. Hier beschreiben wir eine Methode zur Präparation und Sammlung von der Fovea, Makula und peripheren Netzhaut Regionen und RPE-Aderhaut-Komplex zugrunde, an denen regionalen Stanzbiopsien und manuelle Entfernung von Gewebeschichten von einem menschlichen Auge. Eindimensionale SDS-PAGE als auch nachgelagerte Proteomic Analysen, wie z.B. flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), lässt sich Proteine in jeder seziert retinalen Schicht zu identifizieren enthüllt molekularen Biomarker für Netzhauterkrankung.
Introduction
RPE, Netzhaut und Aderhaut sind komplexe Gewebe, die wichtige regionale Unterschiede in pathologischen Empfindlichkeiten1,2Proteinexpression und physiologische Funktion zu demonstrieren. Beispielsweise zeigen Krankheiten wie altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa und zentrale seröse Retinopathie charakteristische Lokalisation innerhalb der Fovea, der Makula oder der Netzhaut Peripherie1,3, 4,6. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zeigen, wie unterschiedliche Retinal Regionen unabhängig verkostet werden können. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, einen zuverlässigen Kompass für die Sammlung von Gewebeproben aus der fovealen, Makula und peripheren Regionen der menschlichen Netzhaut und RPE-Aderhaut für Proteomic Analysen zur Verfügung zu stellen. Die Gründe für die Entwicklung und Nutzung dieser Technik ist, dass durch Proteomic Analysen dieser spezifischen retinalen Regionen wichtig, dass molekulare Erkenntnisse kann über die physiologische und pathophysiologischen Funktionen dieser Regionen.
Dieser Ansatz verspricht die Proteomik-Basis für relative regionale Krankheit Empfindlichkeiten zu offenbaren und die Identifizierung von neuen spezifischen therapeutischen Ziele zu erleichtern. In der Tat boten Proteomic Untersuchungen des Glaskörpers und seine Wechselwirkungen mit der Netzhaut wichtige Einblicke in die molekularen Zusammensetzung und Funktion von gesundem und krankem Gewebe5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. klar vergleichende Proteomic Analysen aus verschiedenen retinalen Regionen fehlen jedoch. Die Technik hilft, um diese dringend notwendigen Studien, bietet Vorteile gegenüber anderen Methoden durch eine zuverlässige und reproduzierbare Gewebe Sammlung Ansatz zu unterstützen. Um so mehr, ist der Ansatz sehr gut erreichbar, unter Ausnutzung der Standardgröße und leicht verfügbare Gewebe Punch Biopsie Werkzeuge. Unsere Technik betont entsprechende Erhebung und Speicherung von Geweben für die Proteomik Verarbeitung, so dass wichtige Überlegungen für die Proteinstabilität und Abbau. Daher ist diese Methode am besten geeignet für Ermittler in Anbetracht nachgelagerten molekulare Analyse der Proteomik Faktoren.
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Protocol
diese Studie wurde von der University of Iowa genehmigt ' s Institutional Review Board und hält sich an den Grundsätzen, die in der Deklaration von Helsinki festgelegten.
1. Foveal und Makula Biopsie-Punch
- öffnen und Schmetterling, das menschliche Auge, so dass es besteht aus 4 separaten Klappen des Gewebes, wie in einer früheren Publikation beschrieben. 5
- beginnend mit butterflied menschlichen Auge in einer Petrischale gelegt, zentrieren Sie eine 4-mm-Stanzwerkzeug-Biopsie über die Fovea, nach unten drücken und sanft Rollen, bis ein Einschnitt, um die Fovea gemacht wird.
- Generieren als nächstes einen Einschnitt in der Makula durch Zentrierung und eine 8 mm Haut Biopsie Stanzwerkzeug in den Arkaden der Makula herunterdrücken, leichtem Druck und Rollen. Dies erzeugt einen zweiten, äußeren Ring des Gewebes rund um die erste.
2. Peripheren Netzhaut-Biopsie-Punch
- Verwendung der 4-mm-Haut-Punch Biopsie Werkzeug, um eine Reihe von Schlägen in der peripheren Netzhaut, vor den Toren der Arkade. Hier machen zwei Schläge für jeden Quadranten Klappe.
Hinweis: Nachdem die Schläge gemacht, das Auge werden zwei konzentrische Schläge in der Mitte, Vertretung der Fovea und Makula, und zwei an der Basis des jeweils in Höhe von Klappe Schläge 8 Schläge in der peripheren Netzhaut.
3. Fovea und Makula Biopsie Sammlung
- wie das Gewebe jetzt abholbereit, sammeln alle Gewebebiopsien in separaten Microfuge Röhren und Einfrieren mit flüssigem Stickstoff für downstream-Processing. Speichern Sie alle Proben bei-80 ° C bis Nutzung.
- Verwenden eine gebogene 0,12 Colibri Zange um die Kanten des lichtdurchlässigen Gewebes der Netzhaut Fovea greifen. Um zu sammeln, zu erheben und trennen die Fovea Gewebe von der zugrunde liegenden RPE-Aderhaut.
- Verwenden ebenso die 0,12 Colibri-Zange, um den äußeren Ring des transluzenten Makula Gewebes zu erfassen. Wenn das Gewebe noch mit zugrunde liegenden oder angrenzenden Gewebe verbunden ist, Westcott Schere verwenden, um den Rand, erfassen nur die Netzhaut Komponente und seziert entfernt Sehnerv Gewebe im Stempel enthalten sorgfältig trimmen.
4. Peripheren Netzhaut Sammlung
- die gebogene 0,12 Colibri Zange verwenden, um vorsichtig die peripheren Netzhaut-Gewebe-Scheiben aus dem zugrunde liegenden RPE-Aderhaut und innerhalb einzelner Microfuge Rohre trennen.
- Bei restliche Glaskörper, die Zange verwenden, um heben und trennen das Gel entfernt so weit wie möglich vor der Abholung des retinalen Gewebes. Sobald die Netzhaut entfernt wurde, bleibt der pigmentierten RPE-Aderhaut unter.
5. Fovea und Makula RPE-Aderhaut Sammlung
- Gebrauch der 0,12 Colibri Zange, die Ränder des dunklen RPE-Aderhaut Gewebes zu erfassen, die unter den Bereich der Fovea entfernt liegt. Sorgfältig trennen dieses Gewebe die Sklera und sammeln.
- Mit der gleichen Pinzette fassen Sie die Kanten des Außenrings der dunklen RPE-Aderhaut-Gewebe zugrunde liegenden Bereich entfernten makularen. Sorgfältig trennen dieses Gewebe von der Sklera durch fassen die Kanten an verschiedenen Stellen rund um den Ring und leichtes ziehen. Schließlich, der Ring des RPE-Aderhaut Gewebe wird verdrängt und kann gesammelt werden.
Hinweis: Sekundäre Zange in der gegenüberliegenden Hand kann helfen bei der Manipulation der RPE-Aderhaut-Gewebe bei der Entnahme. Wie das Netzhautgewebe Wescott Schere einsetzbar, bei der alle Gewebe, die nicht vollständig eingeschnitten wurde mit dem Stempel-Werkzeug entfernt.
6. Peripheren Netzhaut RPE-Aderhaut Sammlung
- verwenden die 0,12 Colibri-Zange zum Abschälen der RPE-Aderhaut im Bereich 8 peripheren Punsch.
- Wie zuvor die RPE-Aderhaut-Gewebe in Microfuge Röhren und frieren mit flüssigem Stickstoff für downstream-Processing. Bewahren Sie alle Proben bei-80 ° C bis Nutzung.
7. Schere Dissektion
Hinweis: Wenn die Durchschlag Biopsie Klinge stumpf ist oder das Stanzwerkzeug Biopsie ist nicht hart genug geschoben, es möglicherweise keine saubere Umgebung das Gewebe.
- In diesen Fällen wegziehen des Gewebes so weit wie möglich und verwenden Sie dann Westcott Schere zu schneiden und zu trennen.
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Representative Results
Retinal und RPE-Aderhaut Gewebe können auf verschiedene Weise eine individuelle Untersuchung entsprechend verarbeitet werden. Nach der Entnahme verfügen die Forscher Proben von Retinal und RPE-Aderhaut-Gewebe aus der fovealen Region, äußere Makula und peripheren Netzhaut (Abbildung 1). Insbesondere gehören die Fovea Region Punch der Fovea, der Parafovea und eine kleine Menge der angrenzenden Perifovea. Der Makula Stempel beinhaltet den Rest von der Perifoveal-Region, sowie eine kleine Menge der angrenzenden in der Nähe von peripheren Region. Zu guter Letzt probieren die peripheren Schläge Mitte peripheren und weit peripheren Regionen. In einem repräsentativen Experiment Gewebeproben wurden Trypsin verdaut und analysiert mit eindimensionalen SDS-PAGE, um Eiweißgehalt (Abbildung 2A) zu visualisieren. Die Ergebnisse dieser Analyse deuten unterschiedliche Proteine unter den verschiedenen Regionen der Netzhaut. Analyse durch flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)6 identifiziert richtig Peptide aus Rhodopsin, eine sehr reiche und einzigartige Netzhaut-Protein. Abbildung 2 bzeigt eine repräsentative Rhodopsin-Spektrum aus der Makula Region gewonnen. Weitere Analysen des Eiweißgehalts bieten Einblicke in die molekularen Funktionen der anatomisch unterschiedlichen Regionen der Netzhaut. Im Fall, den der Dissektion ist nicht sorgfältig durchgeführt, und die Netzhaut ist nicht richtig getrennt von der RPE-Aderhaut werden Protein inhaltliche Unterschiede zwischen diesen beiden Geweben nicht erkennbar.
Abbildung 1 . Netzhaut Regionen. Ein repräsentatives Bild der gesunden menschlichen Netzhaut. Verschiedene retinale Regionen sind deutlich durch den gepunkteten Kreisen und Regionen von Stanzbiopsien entnommen werden durch solide Kreise angezeigt. Die gelb gepunkteten Kreise stehen für die Fovea Region, einschließlich die Fovea, Parafovea und Perifovea (Reisen nach außen vom Zentrum), während der gelbe feste Kreis steht die 4 mm fovealen Punch. Die blau gestrichelte Kreis stellt die anatomische Makula Region, während blau gefüllter Kreis den Makula Stempel 8 mm. Schließlich repräsentieren die rosa gepunkteten Kreise in der Nähe von retinalen Umfangsbereich (in der Nähe von P), Mitte retinalen Randgebiet (Mitte P) und weit Randgebiet (weit P). Die rosa solide Kreise stehen für die 4 mm peripheren Netzhaut Schläge, die die Regionen Mitte P und weit P enthalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Identifikation von retinalen Proteinen. Peripheren Netzhaut, Makula und fovealen Regionen wurden biopsiert und für die Proteomik-Analyse verwendet. (A) eindimensionale SDS-PAGE und silberne Färbung visualisiert Proteine in jeder Netzhaut Region. (B) Netzhaut Gewebeproben wurden flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Analyse unterzogen. Das repräsentative Spektrum gezeigt ist das Rhodopsin-Protein in der Makula Region identifiziert. Dieses Spektrum ist eine der fünf einzigartige Rhodopsin-Peptide in der Makula identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Nach Gewebe sind Sammlung, Probenbehandlung und Behandlung wichtige Überlegungen14. Konservierung in flüssigem Stickstoff wird über chemische Fixierung, bevorzugt, da Letzteres beschädigt, Protein-Struktur kann die nachgelagerte Analyse verzerren könnten. Darüber hinaus ist flüssiger Stickstoff Erhaltung bevorzugt, Methoden, die keine Einfrieren der Proben beinhalten. Vor allem, Ferrer Et Al. zeigten erhebliche Unterschiede im Proteingehalt zwischen Gehirn Proben bei 4 ° C oder Raumtemperatur, im Vergleich zu den gespeicherten bei 0 ° C15erhalten. Darüber hinaus ist es wichtig, seien Sie vorsichtig bei der Verarbeitung von Proben, als bestimmte chemische und physikalische Behandlung vor Einfrieren das Potenzial hat, Proteingehalt und post-translationalen Modifikationen16,17zu ändern. Diesem Punkt betont, wie wichtig es ist, unter Berücksichtigung der beabsichtigten nachgelagerten Analysis von Proben. Separat, ist Post-Mortem-Timing der Gewebe zu ernten ein weiterer Faktor, der Ebenen und Stabilität der spezifischen Proteine beeinflussen können. Abbau kann zum Beispiel Proteom je nach Zeit Post Mortem und Lagerung Temperatur18,,19,20auftreten. Darüber hinaus ist es entscheidend, controlling für Zeit Post-Mortem-Abbau, z. B. durch Verwendung von internen Kontrollen zwischen Krankheit Gewebe und gesundem Gewebe. Wenn die Timing-Faktor außer acht gelassen wird, könnte Abbau Ergebnisse verzerren. Als Faustregel je früher ist das Gewebe analysiert Post Mortem, desto geringer das Risiko für den Abbau, Studienergebnisse zu ändern.
Mehrere Verfahrensänderungen können dieses Protokolls erfolgen, um eine spezifische Fragestellung besser zu entsprechen. Eine Änderung ist, dass unterschiedliche Größe Haut Biopsie Stanzwerkzeuge verwendet werden, um unterschiedliche Mengen an Gewebeproben zu sammeln. Mehr oder weniger Gewebe kann für nachgeschaltete Proteomic Verarbeitung je nach Menge oder Stabilität der spezifischen Proteine des Interesses erforderlich. Darüber hinaus bestimmen die Größe der die Stanzbiopsie Gewebe wie grob die spezifische Regionen der Netzhaut oder des RPE-Aderhaut abgetastet werden. Wenn bestimmte, feine Regionen des pathologischen Gewebes erforderlich sind, können z. B. kleiner Haut Biopsie Stanzwerkzeuge erforderlich. Wenn ein Abschnitt so fein ist, dass es die Fähigkeiten der Biopsie Stanzwerkzeuge unterschreitet, möglicherweise Mikrodissektion darüber hinaus erforderliche21. Darüber hinaus kann die Verwendung von visuellen Hilfsmitteln, wie z. B. einen sezierenden Umfang oder Lupe, Prozess-insbesondere in Fällen von kleineren Größen der Welt, die Gewebe-Sammlung wie z. B. mit infantilen okuläre Gewebe Hilfe.
Zu guter Letzt ist es wichtig zu beachten, dass während diese Technik die RPE und choroid Gewebe als einen einzigen Komplex Gruppen, diese Gewebe Molekular und funktionell unterschiedlichen bleiben. In der Tat unterscheiden sich die Proteome deutlich zwischen diesen beiden Geweben. Aber verbunden trotz dieser Unterschiede, die RPE und Aderhaut anatomisch, funktionell und klinisch bleiben2,6,7. Somit sollten keine nachgeschalteten Proteomic Analysen der RPE-Aderhaut-komplex diese wichtige Unterscheidung Bedenken.
Diese Handschrift zeigt einen unkomplizierten, zuverlässigen, geringem Aufwand Ansatz für Musterkollektion für Proteomic Analysen von Fovea, Makula, und peripheren Netzhaut und RPE-Aderhaut-Gewebe im menschlichen Auge. Liegt im Ermessen des Prüfers können Änderungen an der Sammlung Prozess oder Gewebe Handhabung, Pre-Kollektion und Post-Sammlung, abhängig von der beabsichtigten nachgelagerten Proteomik-Analyse vorgenommen werden.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
VBM wird unterstützt durch Zuschüsse des NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 und R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 und Forschung zu verhindern, dass Blindheit (RPB), New York, NY. MT und GV werden unterstützt durch NIH T32GM007337 zu gewähren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
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