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Biochemistry

मानव रेटिना और RPE के विच्छेदन-Proteomic विश्लेषण के लिए धमनियां

Published: November 12, 2017 doi: 10.3791/56203
Automatic Translation
*1,2,7,8, *3,4, 3,4, 1,2, 3, 3, 1,2, 5,6, 3,9
1Barbara & Donald Jonas Stem Cell Laboratory, and Bernard & Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Pathology & Cell Biology, Institute of Human Nutrition, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Edward S. Harkness Eye Institute, New York-Presbyterian Hospital, 3Omics Laboratory, Byers Eye Institute, Department of Ophthalmology, Stanford University, 4Medical Scientist Training Program, University of Iowa, 5Department of Pediatrics, University of Iowa, 6Department of Neurology, University of Iowa, 7Department of Ophthalmology, Federal University of Sao Paulo (UNIFESP), 8Department of Ophthalmology, Federal University of EspÍrito Santo (UFES), 9Palo Alto Veterans Administration, Palo Alto, CA
* These authors contributed equally

Summary

मानव रेटिना fovea, मैक्युला, और परिधीय रेटिना सहित कार्यात्मक और आणविक रूप से अलग क्षेत्रों से बना है. यहां, हम एक मानव आंख से पंच बायोप्सी और ऊतक परतों के मैनुअल हटाने का उपयोग करने के लिए टुकड़े और बहाव proteomic विश्लेषण के लिए इन अलग रेटिना क्षेत्रों इकट्ठा विधि का वर्णन ।

Abstract

मानव रेटिना संवेदी neuroretina और अंतर्निहित रेटिना pigmented उपकला (RPE), जो दृढ़ता से संवहनी धमनियां परत करने के लिए जटिल है से बना है । रेटिना के विभिन्न क्षेत्रों शारीरिक और आणविक रूप से अलग कर रहे हैं, अद्वितीय कार्यों को सुविधाजनक बनाने और रोग के लिए अंतर संवेदनशीलता का प्रदर्शन. इन क्षेत्रों और परतों में से प्रत्येक के Proteomic विश्लेषण कई रोगों की आणविक प्रक्रिया में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन (AMD), मधुमेह, और मोतियाबिंद भी शामिल है. हालांकि, रेटिना क्षेत्रों और परतों की जुदाई मात्रात्मक proteomic विश्लेषण पूरा किया जा सकता से पहले आवश्यक है. यहां, हम विच्छेदन और संग्रह के लिए एक विधि का वर्णन foveal, धब्बेदार, और परिधीय रेटिना क्षेत्रों और अंतर्निहित RPE-धमनियां जटिल, क्षेत्रीय पंच बायोप्सी और एक मानव आंख से ऊतक परतों के मैनुअल हटाने शामिल. एक आयामी एसडीएस-पृष्ठ के रूप में अच्छी तरह से बहाव proteomic विश्लेषण, जैसे तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा-ms/एमएस), प्रत्येक विदारक रेटिना परत में प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, रेटिना रोग के लिए आणविक बायोमास का खुलासा.

Introduction

रेटिना, RPE, और धमनियां जटिल ऊतकों कि प्रोटीन अभिव्यक्ति, शारीरिक समारोह में महत्वपूर्ण क्षेत्रीय मतभेदों का प्रदर्शन कर रहे हैं, और रोग संवेदनशीलता1,2. उदाहरण के लिए, इस तरह की उंर से संबंधित धब्बेदार अध-पतन (AMD), रेटनाइटिस पिगमेंटोसा, और केंद्रीय तरल रेटिनोपैथी के रूप में रोगों fovea, मैक्युला, या रेटिना परिधि के भीतर विशिष्ट स्थानीयकरण का प्रदर्शन1,3, 4,6. यहाँ, हम कैसे अलग रेटिना क्षेत्रों स्वतंत्र रूप से नमूना किया जा सकता है का प्रदर्शन एक विधि पेश करते हैं. इस विधि का समग्र लक्ष्य proteomic विश्लेषण के लिए foveal, धब्बेदार, और परिधीय क्षेत्रों के मानव रेटिना और RPE-धमनियां से ऊतक के नमूनों के संग्रह के लिए एक विश्वसनीय गाइड प्रदान करना है । विकास और इस तकनीक के उपयोग के लिए तर्क यह है कि इन विशिष्ट रेटिना क्षेत्रों के proteomic विश्लेषण के माध्यम से, महत्वपूर्ण आणविक अंतर्दृष्टि इन क्षेत्रों के शारीरिक और pathophysiological कार्यों में प्राप्त किया जा सकता है ।

इस दृष्टिकोण से संबंधित क्षेत्रीय रोग संवेदनशीलता के लिए proteomic आधार प्रकट करने का वादा किया है, और नए विशिष्ट चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान की सुविधा के लिए । दरअसल, अवलेह और रेटिना के साथ अपनी बातचीत की proteomic जांच आणविक संरचना और स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतक के समारोह में मुख्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. हालांकि, अलग रेटिना क्षेत्रों के स्पष्ट तुलनात्मक proteomic विश्लेषण कमी कर रहे हैं । तकनीक का समर्थन करने के लिए इन बहुत जरूरत अध्ययन, एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि ऊतक संग्रह दृष्टिकोण का प्रदर्शन करके अंय तरीकों से अधिक लाभ प्रदान करने में मदद मिलेगी । और तो, दृष्टिकोण बहुत सुलभ है, मानक के लाभ ले आकार और आसानी से उपलब्ध ऊतक पंच बायोप्सी उपकरण । हमारी तकनीक proteomic प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त संग्रह और ऊतकों के भंडारण पर जोर देती है, प्रोटीन स्थिरता और क्षरण के लिए महत्वपूर्ण विचार कर रही है । इस प्रकार, इस विधि proteomic कारकों के बहाव आणविक विश्लेषण पर विचार कर जांचकर्ताओं के लिए सबसे उपयुक्त है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यह अध्ययन आयोवा विश्वविद्यालय के & #39; s संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और हेलसिंकी की घोषणा में उल्लिखित सिद्धांतों का पालन करता है.

< p class = "jove_title" > 1. Foveal और धब्बेदार बायोप्सी पंच

  1. खुला और तितली मानव आंख, इस तरह कि यह ऊतक के 4 अलग फ्लैप के होते हैं, के रूप में एक पिछले प्रकाशन में वर्णित. < सुप वर्ग = "xref" > 5
  2. शुरुआत एक butterflied मानव एक पेट्री डिश में रखा आंख के साथ, केंद्र एक 4 मिमी पंच बायोप्सी उपकरण fovea पर, नीचे प्रेस, और धीरे रोल जब तक एक चीरा fovea के आसपास किया जाता है.
  3. अगले, केंद्र और मैक्युला के आर्केड के भीतर एक 8 मिमी त्वचा पंच बायोप्सी उपकरण नीचे दबाने से मैक्युला चारों ओर एक चीरा उत्पन्न, कोमल दबाव और रोलिंग लागू. यह एक दूसरे, पहले आसपास के ऊतकों की बाहरी अंगूठी का उत्पादन होगा ।
< p class = "jove_title" > 2. परिधीय रेटिना बायोप्सी पंच

  1. बस आर्केड बाहर, परिधीय रेटिना में घूंसे की एक श्रृंखला बनाने के लिए 4 मिमी त्वचा पंच बायोप्सी उपकरण का उपयोग करें । यहां, प्रत्येक वृत्त का चक्र प्रालंब के लिए दो घूंसे बनाओ ।
    नोट: सभी घूंसे बना रहे हैं के बाद, आंख केंद्र में दो गाढ़ा घूंसे, fovea और मैक्युला का प्रतिनिधित्व करने के लिए, और परिधीय रेटिना में प्रत्येक प्रालंब-totaling 8 घूंसे के आधार पर दो घूंसे होगा ।
    2. ।
< p class = "jove_title" > 3. Fovea और मैक्युला बायोप्सी संग्रह

  1. के रूप में ऊतक अब संग्रह के लिए तैयार है, अलग बायोप्सी ट्यूबों में सभी ऊतक microfuge इकट्ठा और बहाव प्रसंस्करण के लिए तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर फ्रीज । सभी नमूनों को स्टोर पर-८० & #176; ग तक खर्चात.
  2. रेटिना fovea की पारदर्शी ऊतक के किनारों को हड़पने के लिए एक घुमावदार ०.१२ Colibri संदंश का उपयोग करें । इकट्ठा करने के लिए, तरक्की और foveal ऊतक अंतर्निहित RPE से अलग-धमनियां.
  3. इसी तरह, ०.१२ Colibri संदंश का उपयोग करने के लिए पारदर्शी मैक्युला ऊतक के बाहरी अंगूठी समझ । ऊतक अभी भी अंतर्निहित या आसन्न ऊतक से जुड़ा हुआ है, तो ध्यान से धार ट्रिम करने के लिए, एक जोड़ी का उपयोग करें वेस् ट कैंची, बस रेटिना घटक पर कब्जा करने और दूर किसी भी ऑप्टिक तंत्रिका ऊतक पंच में शामिल विदारक ।
< p class = "jove_title" > 4. परिधीय रेटिना संग्रह

  1. घुमावदार ०.१२ Colibri संदंश का उपयोग धीरे अंतर्निहित RPE से परिधीय रेटिना ऊतक डिस्क अलग-रंजित और व्यक्तिगत microfuge ट्यूबों के भीतर जगह ।
    2. अवशिष्ट अवलेह जेल के मामले में
  2. , रेटिना ऊतक के संग्रह से पहले के रूप में ज्यादा संभव के रूप में दूर जेल लिफ्ट और अलग करने के लिए संदंश का उपयोग करें । एक बार रेटिना को हटा दिया गया है, pigmented RPE-रंजित नीचे रहता है ।
< p class = "jove_title" > 5. Foveal और मैक्युला RPE-रंजित संग्रह

  1. ०.१२ Colibri संदंश का उपयोग करने के लिए अंधेरे RPE-रंजित ऊतक है कि हटा fovea के क्षेत्र के नीचे झूठ के किनारों समझ । ध्यान से इस ऊतक श्वेतपटल से अलग और इकट्ठा.
  2. एक ही संदंश का उपयोग कर, अंधेरे RPE की बाहरी अंगूठी के किनारों को हटा धब्बेदार क्षेत्र अंतर्निहित ऊतक पकड़ । ध्यान से इस ऊतक श्वेतपटल से अंगूठी के आसपास अलग बिंदुओं पर किनारों लोभी और हल्के ढंग से खींच द्वारा अलग । अंततः, RPE-धमनियां ऊतक की अंगूठी को उखाड़ फेंका जाएगा और एकत्र किया जा सकता है ।
    नोट: माध्यमिक संदंश विपरीत हाथ में हटाने के दौरान RPE-रंजित ऊतक जोड़ तोड़ में सहायक हो सकता है । रेटिना ऊतक की तरह, Wescott कैंची पंच उपकरण का उपयोग कर पूरी तरह से incised नहीं था कि किसी भी ऊतक को हटाने में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
< p class = "jove_title" > 6. परिधीय रेटिना RPE-रंजित संग्रह

  1. 8 परिधीय पंच क्षेत्रों में संदंश-धमनियां दूर छील करने के लिए ०.१२ Colibri RPE का उपयोग करें ।
  2. के रूप में पहले, जगह microfuge ट्यूबों में RPE-धमनियां ऊतक और बहाव प्रसंस्करण के लिए तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर फ्रीज । सभी नमूनों को ऑन रखें-८० & #176; ग जब तक उपयोग क ֩
< p class = "jove_title" > 7. कैंची विच्छेदन

< p class = "jove_content" > नोट: पंच बायोप्सी ब्लेड सुस्त है या पंच बायोप्सी उपकरण कठिन पर्याप्त धक्का नहीं है, वहाँ एक साफ-ऊतक आसपास के कट नहीं हो सकता है ।

  1. इन मामलों में टिशू को जितना ज्यादा दूर से खींचो, और फिर इन् वेस् ट कैंची को ट्रिम और अलग से इस् तेमाल करें ।

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Representative Results

रेटिना और RPE-धमनियां ऊतक विभिन्न तरीकों से एक व्यक्ति की जांच सूट करने के लिए संसाधित किया जा सकता है । संग्रह के बाद, शोधकर्ता foveal क्षेत्र, बाहरी मैक्युला, और परिधीय रेटिना (चित्रा 1) से रेटिना और RPE-रंजित ऊतक के नमूने के अधिकारी होगा । विशेष रूप से, foveal क्षेत्र पंच fovea, parafovea, और आसंन perifovea की एक छोटी राशि शामिल होंगे । धब्बेदार पंच perifoveal क्षेत्र के शेष के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आसंन निकट परिधीय क्षेत्र की एक छोटी राशि भी शामिल है । अंत में, परिधीय घूंसे के मध्य परिधीय और दूर परिधीय क्षेत्रों के नमूने । एक प्रतिनिधि प्रयोग में, ऊतक के नमूने trypsin पचा लिया और प्रोटीन की सामग्री (चित्रा 2a) कल्पना करने के लिए एक आयामी एसडीएस-पृष्ठ का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. इस विश्लेषण के परिणाम रेटिना के विभिन्न क्षेत्रों के बीच विशिष्ट प्रोटीन का सुझाव देते हैं. तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा-ms/6 ठीक से rhodopsin, एक अत्यधिक प्रचुर मात्रा में और अद्वितीय रेटिना प्रोटीन से पेप्टाइड्स की पहचान की । धब्बेदार क्षेत्र से प्राप्त एक प्रतिनिधि rhodopsin स्पेक्ट्रम चित्रा bमें दिखाया गया है । इसके अलावा प्रोटीन सामग्री के विश्लेषण शारीरिक रेटिना के विशिष्ट क्षेत्रों के आणविक कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा । इस मामले में है कि विच्छेदन ध्यान से नहीं किया जाता है, और रेटिना ठीक से RPE-रंजित से अलग नहीं है, इन दोनों के ऊतकों के बीच प्रोटीन सामग्री में अंतर समझदार नहीं होगा ।

Figure 1
चित्र 1 . रेटिना क्षेत्रों । एक स्वस्थ मानव रेटिना की एक प्रतिनिधि छवि । अलग रेटिना क्षेत्रों बिंदीदार हलकों द्वारा प्रकाश डाला जाता है, और पंच बायोप्सी द्वारा नमूना क्षेत्रों ठोस हलकों द्वारा संकेत कर रहे हैं । पीला बिंदीदार हलकों foveal क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं, fovea, parafovea, और perifovea सहित (केंद्र से जावक यात्रा), जबकि पीले ठोस चक्र 4 मिमी foveal पंच का प्रतिनिधित्व करता है । नीले बिंदीदार सर्कल शारीरिक धब्बेदार क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि नीले ठोस चक्र 8 मिमी धब्बेदार पंच का प्रतिनिधित्व करता है । अंत में, गुलाबी बिंदीदार हलकों के पास रेटिना परिधीय क्षेत्र (पी के पास), मध्य रेटिना परिधीय क्षेत्र (मध्य पी), और सुदूर परिधीय क्षेत्र (सुदूर पी) का प्रतिनिधित्व करते हैं । गुलाबी ठोस हलकों 4 मिमी परिधीय रेटिना घूंसे, जो मध्य पी और दूर पी क्षेत्रों में शामिल प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . रेटिना प्रोटीन की पहचान । परिधीय रेटिना, मैक्युला, और foveal क्षेत्रों biopsied थे और proteomic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया । (क) एक आयामी एसडीएस-पृष्ठ और प्रत्येक रेटिना क्षेत्र में चांदी धुंधला दृश्य प्रोटीन । (ख) रेटिना ऊतक नमूने तरल क्रोमैटोग्राफी के अधीन थे-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा-ms/ प्रतिनिधि स्पेक्ट्रम दिखाया rhodopsin धब्बेदार क्षेत्र में पहचान की प्रोटीन की है । इस स्पेक्ट्रम मैक्युला में पहचान की पांच अद्वितीय rhodopsin पेप्टाइड्स में से एक का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

ऊतक संग्रह के बाद, नमूना हैंडलिंग और उपचार के14महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । बाद के रूप में प्रोटीन संरचना, जो बहाव विश्लेषण विषम सकता है के लिए नुकसान में परिणाम हो सकता है तरल नाइट्रोजन में संरक्षण, रासायनिक निर्धारण पर पसंद है । इसके अतिरिक्त, तरल नाइट्रोजन संरक्षण विधियों जो नमूनों की ठंड शामिल नहीं करने के लिए पसंद है । विशेष रूप से, फेरर एट अल । 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर संरक्षित मस्तिष्क के नमूनों के बीच प्रोटीन के स्तर में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया, 0 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत उन लोगों की तुलना में15. इसके अलावा, यह सावधान रहना महत्वपूर्ण है जब नमूनों प्रसंस्करण, ठंड से पहले विशिष्ट रासायनिक और शारीरिक उपचार के रूप में प्रोटीन के स्तर और पोस्ट-शोधों संशोधन16,17को बदलने की क्षमता है । इस बिंदु के नमूनों की अनुप्रवाह विश्लेषण पर विचार के महत्व पर जोर देती है । अलग से, ऊतक कटाई के बाद पोस्टमार्टम समय एक और कारक है कि विशिष्ट प्रोटीन के स्तर और स्थिरता को प्रभावित कर सकता है । क्षरण समय पोस्टमार्टम और भंडारण तापमान18,19,20के आधार पर नमूना proteome के लिए हो सकता है । इसके अलावा, इस तरह के रोग के ऊतकों और स्वस्थ ऊतक के बीच आंतरिक नियंत्रण के उपयोग के रूप में समय के बाद पोस्टमार्टम गिरावट के लिए नियंत्रण, महत्वपूर्ण है । यदि समय के कारक पर ध्यान नहीं दिया जाता है, तो ह्रास परिणाम तिरछा कर सकता है । एक सामांय नियम के रूप में, जल्दी ऊतक पोस्टमार्टम का विश्लेषण किया है, गिरावट के लिए कम जोखिम अध्ययन के परिणाम को बदलने के लिए ।

कई प्रक्रियात्मक संशोधनों के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है बेहतर एक विशिष्ट अनुसंधान प्रश्न सूट । एक संशोधन है कि विभिन्न आकार त्वचा पंच बायोप्सी उपकरण ऊतक के नमूनों की विभिन्न मात्रा में इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कम या अधिक ऊतक बहाव proteomic प्रसंस्करण के लिए आवश्यक मात्रा या ब्याज की विशिष्ट प्रोटीन की स्थिरता के आधार पर हो सकता है । इसके अलावा, ऊतक पंच बायोप्सी के आकार कितनी निहायत रेटिना या RPE-धमनियां के विशिष्ट क्षेत्रों का नमूना लिया जाएगा निर्धारित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, यदि विशिष्ट, रोग ऊतक के ठीक क्षेत्रों की आवश्यकता है, छोटे त्वचा पंच बायोप्सी उपकरण की जरूरत हो सकती है । इसके अलावा, अगर एक खंड इतना ठीक है कि यह पंच बायोप्सी उपकरण की क्षमताओं के नीचे चला जाता है, microdissection21आवश्यक हो सकता है । इसके अतिरिक्त, इस तरह के एक विदारक गुंजाइश या शीशा कांच के रूप में दृश्य एड्स, का उपयोग, ऊतक संग्रह प्रक्रिया सहायता कर सकते है-विशेष रूप से छोटे ग्लोब आकार के मामलों में, जैसे शिशु नेत्र ऊतक के साथ ।

अंत में, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि जब इस तकनीक समूहों RPE और धमनियां ऊतकों एक एकल परिसर के रूप में, इन ऊतकों आणविक और कार्यात्मक रूप से अलग रहते हैं । वास्तव में, proteomes इन दो ऊतकों के बीच स्पष्ट रूप से अलग हैं । हालांकि, इन मतभेदों के बावजूद, RPE और रंजित शारीरिक रहते हैं, कार्यात्मक, और नैदानिक2,6,7से जुड़े । इस प्रकार RPE-रंजित परिसर के किसी भी बहाव proteomic विश्लेषण इस महत्वपूर्ण अंतर को ध्यान में रखना चाहिए ।

यह पांडुलिपि मानव आंखों में fovea, मैक्युला, और परिधीय रेटिना और RPE-रंजित ऊतक के proteomic विश्लेषण के लिए नमूना संग्रह करने के लिए एक सीधा, विश्वसनीय, कम उपरि दृष्टिकोण को दर्शाता है । जांचकर्ता के विवेक पर, संशोधनों या तो संग्रह प्रक्रिया या ऊतक हैंडलिंग, पूर्व संग्रह और बाद संग्रह, इरादा बहाव proteomic विश्लेषण पर निर्भर करता है बनाया जा सकता है ।

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Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

VBM NIH अनुदान [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 और R21AG050437] द्वारा समर्थित है, डोरिस ड्यूक चैरिटेबल फाउंडेशन अनुदान #: २०१३१०३, और अनुसंधान को रोकने के लिए अंधापन (रपब), ंयूयॉर्क, NY । मीट्रिक टन और जीवी NIH अनुदान T32GM007337 द्वारा समर्थित हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-mm skin punch biopsy tool Miltex REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool Miltex REF 33-37
0.12 Colibri Forceps Stephens Instruments S5-1145
Wescott Scissors Sklar Surgical Instruments 64-3146
Microfuge tubes Eppendorf #022364111 1.5 mL
Liquid Nitrogen Praxair, Inc. 7727-37-9 [R]

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References

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Cabral, T., Toral, M. A., Velez, G., … More

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