Summary
La retina humana está conformada por las regiones funcionalmente y molecularmente distintas, incluyendo la fóvea, mácula y retina periférica. Aquí, describimos un método utilizando las biopsias del sacador y extracción manual de las capas de tejido de un ojo humano para diseccionar y recoger estas regiones retinianas distintas para análisis proteómico aguas abajo.
Abstract
La retina humana se compone de la neuroretina sensorial y el epitelio pigmentado retiniano subyacente (RPE), que es firmemente complexed a la capa vascular de la coroide. Diferentes regiones de la retina son anatómicamente y molecularmente distintas, facilitando funciones únicas y demostrar susceptibilidad diferencial a la enfermedad. Análisis proteómico de cada una de estas regiones y capas pueden proporcionar información vital sobre el proceso molecular de muchas enfermedades, incluyendo degeneración relacionada de Macular (AMD), diabetes mellitus y glaucoma. Sin embargo, la separación de capas y regiones retinianas es esencial antes de proceder con el análisis proteómico cuantitativo. Aquí, describimos un método de disección y recogida de la regiones retinianas periféricas, maculares y foveal y subyacente coroides RPE complejo, involucrando a las biopsias del sacador regional y extracción manual de las capas de tejido de un ojo humano. Unidimensional de SDS-PAGE, así como análisis proteómicos aguas abajo, como líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS), pueden utilizarse para identificar proteínas en cada capa retiniana disecada, revelar biomarcadores moleculares de la enfermedad retiniana.
Introduction
La retina, EPR y coroides son tejidos complejos que muestran importantes diferencias regionales en la expresión de proteínas, función fisiológica y patológica susceptibilidad1,2. Por ejemplo, enfermedades como la degeneración relacionada de Macular (AMD), retinitis pigmentosa y la retinopatía serosa central demuestran características localización dentro de la fóvea, mácula o retina periferia1,3, 4,6. Aquí, presentamos un método de demostración de retina cómo distinta regiones pueden ser muestreadas independientemente. El objetivo general de este método es proporcionar a una guía confiable para la recolección de muestras de tejido de las regiones periféricas, maculares y foveal de la retina humana y la RPE-coroides para análisis proteómico. El fundamento para el desarrollo y uso de esta técnica es a través de análisis proteómico de estas regiones retinianas específicas, importantes penetraciones moleculares pueden obtenerse en las funciones fisiológicas y fisiopatológicas de estas regiones.
Este enfoque promete revelar la base proteómicos para susceptibilidad de enfermedad regional relativa y para facilitar la identificación de nuevas dianas terapéuticas específicas. De hecho, las investigaciones proteómicas de vítreo y sus interacciones con la retina han proporcionado ideas claves en la composición molecular y función del tejido sano y enfermo5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. sin embargo, se carecen de análisis proteómicos claro comparativo de distintas regiones retinianas. La técnica ayuda a apoyar estos estudios necesaria, ofreciendo ventajas sobre otros métodos demostrando un enfoque de la colección de tejido fiable y reproducible. Más aún, el enfoque es muy accesible, tomando ventaja de sacador de tejido de tamaño estándar y disponible herramientas de biopsia. Nuestra técnica hace hincapié en la adecuada recolección y almacenamiento de tejidos para proteómica de procesamiento, haciendo consideraciones importantes para la estabilidad de la proteína y la degradación. Así, este método es más apropiado para investigadores teniendo en cuenta posterior análisis molecular de factores proteómicos.
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Protocol
este estudio fue aprobado por la Universidad de Iowa ' s Junta de revisión institucional y se adhiere a los principios enunciados en la declaración de Helsinki.
1. punzón de biopsia Macular y Foveal
- libre y mariposa, el ojo humano, que consta de 4 aletas separadas de los tejidos, como se describe en una publicación anterior. 5
- partir de un ojo humano abierto colocado en caja Petri, centro de una herramienta de biopsia punch de 4 mm sobre la fóvea, presione hacia abajo y rodar suavemente hasta que se hace una incisión alrededor de la fóvea.
- a continuación, generar una incisión alrededor de la mácula centrado y presionando hacia abajo de una herramienta de biopsia punch de piel de 8 mm dentro de las arcadas de la mácula, aplicando una presión suave y balanceo. Esto producirá un anillo de tejido que rodea la primera segunda, exterior.
2. Punch de biopsia retiniana periférica
- uso el punch de piel de 4 mm herramienta de biopsia a realizar una serie de golpes en la retina periférica, a las afueras de la galería. Aquí, hacer dos golpes para cada aleta del cuadrante.
Nota: Después de que se hacen todos los golpes, el ojo tendrá dos golpes concéntricos en el centro, representando a la fóvea y la mácula, y dos golpes en la base de cada aleta-un total de 8 golpes en la retina periférica.
3. Fóvea y la mácula biopsia colección
- el tejido está listo para la colección, recoge todas las biopsias de tejido en los tubos del microfuge separado como congelación con nitrógeno líquido para el proceso aguas abajo. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta utilización.
- Utilizar un fórceps curvo de Colibri 0.12 para agarrar los bordes del tejido translúcido de la fóvea retiniana. Recopilar, elevar y separar el tejido foveal de la RPE-coroides subyacente.
- Del mismo modo, usar la pinza Colibri 0,12 agarrar el anillo externo de tejido translúcido de la mácula. Si el tejido está todavía conectado a tejidos adyacentes o subyacentes, utilice un par de tijeras de Westcott para cortar cuidadosamente el borde, capturar sólo el componente retiniano y disección a cualquier tejido del nervio óptico en el punzón.
4. Colección de Retina periférica
- utilizar el fórceps curvado de Colibri 0,12 suavemente separar los discos de tejido retiniano periférico de la RPE-coroides subyacente y el lugar dentro de los tubos del microfuge individuales.
- En el caso del gel vítreo residual, utilizar el fórceps para levantar y separar el gel lejos tanto como sea posible antes del tejido retiniano. Una vez que la retina se ha eliminado, la RPE-coroides pigmentada es inferior a.
5. Foveal y mácula RPE-coroides colección
- pinzas de Colibri uso el 0.12 que sujete los bordes del tejido coroides RPE oscuro que se encuentra debajo de la zona de la fóvea quitada. Separar cuidadosamente este tejido de la esclerótica y la recoge.
- Utilizando las mismas pinzas, sujete los bordes del anillo externo de oscuro tejido de RPE-coroides subyacente del área macular quitado. Cuidadosamente Separe este tejido de la esclerótica sujetando los bordes en diferentes puntos alrededor del anillo y tirar suavemente. Finalmente, el anillo de tejido coroides RPE se retirar y se puede recoger.
Nota: Secundarias pinzas en la mano contraria pueden ser útiles en la manipulación del tejido coroides RPE durante la extracción. Como el tejido retiniano, tijeras de Wescott se pueden utilizar para ayudar en la eliminación de cualquier tejido que no fue incidida completamente usando la herramienta del sacador.
6. Colección de RPE-coroides Retina periférica
- utilizar el fórceps Colibri 0,12 para despegar la coroides RPE en las áreas periféricas punch 8.
- Anteriormente, coloque el tejido de RPE-coroides en tubos de microcentrífuga y congelar con nitrógeno líquido para el proceso aguas abajo. No todas las muestras a-80 ° C hasta su utilización.
7. Tijera de disección
Nota: si las cuchillas de biopsia punch es embotada o la herramienta de biopsia punch no es empujada lo suficientemente dura, puede que no haya un corte limpio que rodea el tejido.
- En estos casos, separe el tejido lo más posible y luego usar tijeras de Westcott para recortar y separar.
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Representative Results
Tejido de RPE-coroides y retiniana pueden procesarse de varias maneras a una investigación individual. Después de la recolección, el investigador contará con muestras de retina y coroides RPE tejido de la región foveal, exterior mácula y retina periférica (figura 1). Específicamente, el golpe de la región foveal incluirá la fóvea, el parafovea y una pequeña cantidad de la perifovea adyacente. El punzón macular incluye el resto de la región perifoveal, así como una pequeña cantidad de la adyacente región de cerca de periférico. Finalmente, los golpes periféricos muestra las regiones periférica media y periférica lejana. En un experimento representativo, las muestras de tejido fueron digeridos en tripsina y analizan usando unidimensional SDS-PAGE para visualizar el contenido de proteína (figura 2A). Los resultados de este análisis sugieren distintas proteínas entre las diferentes regiones de la retina. Análisis de líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS)6 debidamente identificado péptidos de rodopsina, una proteína muy abundante y única de la retina. Un espectro de rodopsina representativos de la región macular se muestra en la figura 2B. Análisis del contenido de proteína proporcionar penetraciones en las funciones moleculares de las regiones anatómicamente distintas de la retina. En el caso que la disección no se realiza cuidadosamente, y la retina no se separa correctamente la RPE-coroides, diferencias en contenido de proteínas entre estos dos tejidos no será discernibles.
Figura 1 . Regiones retinianas. Una imagen representativa de una retina humana saludable. Diferentes regiones retinianas se destacan por los círculos punteados, y las regiones muestreadas por las biopsias del sacador se indican con círculos sólidos. El amarillo círculos punteados representan la región foveal, incluyendo la fóvea parafovea y perifovea (viajando hacia el exterior del centro), mientras que el círculo sólido amarillo representa el punzón de 4 mm foveal. El círculo punteado azul representa la región anatómica macular, mientras que el círculo sólido azul representa el golpe de 8 mm macular. Finalmente, los círculos de puntos rosados representan la región periférica retiniana cerca (cerca de P), media región periférica retiniana (mediados P) y región periférica lejos (ahora P). Los círculos sólidos rosa representan los golpes de la retina periférica de 4 mm, que contienen las regiones mediados P y el momento P. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Identificación de las proteínas retinianas. Regiones foveal, mácula y retina periférica fueron biopsiadas y utilizado para el análisis proteómico. (A) unidimensional SDS-PAGE y plata visualizaron proteínas en cada región retiniana. (B) las muestras de tejido de la Retina fueron objeto de análisis líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS). El espectro representativo que se muestra es de la proteína rodopsina identificada en la región macular. Este espectro representa uno de los cinco péptidos rodopsina única identificadas en la mácula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Después de tejido obtención muestra y tratamiento son consideraciones cruciales14. Conservación en nitrógeno líquido se prefiere sobre la fijación química, como este último puede resultar en daños a la estructura de la proteína, que podría sesgar el análisis descendente. Además, conservación de nitrógeno líquido se prefiere a los métodos que no implican la congelación de las muestras. En particular, Ferrer et al mostraron diferencias significativas en los niveles de proteínas entre muestras de cerebro conservadas a 4 ° C o a temperatura ambiente, en comparación con los almacenados a 0 ° C15. Además, es importante tener cuidado cuando se procesan las muestras, como tratamiento específico de físico y química antes de congelación tiene el potencial de alterar los niveles de proteínas y modificaciones post-traduccionales16,17. Este punto hace hincapié en la importancia de considerar el análisis previsto aguas abajo de las muestras. Por separado, post-mortem de tejidos es otro factor que puede afectar el nivel y estabilidad de proteínas específicas. Degradación puede ocurrir que el proteoma de muestra dependiendo de tiempo post-mortem y almacenamiento temperatura18,19,20. Además, control de degradación post-mortem de tiempo, como por el uso de controles internos entre enfermedad tejido y tejido sano, es crucial. Si se omite el factor tiempo, la degradación podría sesgar resultados. Como regla general, cuanto antes el tejido es analizado post mortem, el menor riesgo de degradación alterar los resultados del estudio.
Varias modificaciones procesales se pueden hacer en el presente Protocolo para una pregunta de investigación específica. Una modificación es que pueden utilizarse diferentes tamaños piel punch biopsia herramientas para recoger diferentes cantidades de muestras de tejido. Tejido más o menos puede ser necesario para proteómica downstream procesamiento dependiendo de la cantidad o la estabilidad de las proteínas específicas de interés. Por otra parte, el tamaño de la biopsia del sacador de tejido puede determinar cómo gravemente las regiones específicas de la retina o coroides de RPE se ser muestreadas. Por ejemplo, si las regiones específicas, finas de tejido patológico se requiere, pueden necesitarse más pequeño piel punch biopsia herramientas. Además, si una sección es tan fina que cae por debajo de las capacidades de herramientas de la biopsia de punch, microdisección puede ser necesaria21. Además, el uso de ayudas visuales, como una disección alcance o lupa, puede ayudar a la colección de tejidos proceso-particularmente en los casos de tamaños más pequeños del mundo, como con el tejido ocular infantil.
Finalmente, es importante tener en cuenta que si bien esta técnica agrupa los tejidos coroides y EPR como un complejo único, estos tejidos siguen siendo molecularmente y funcionalmente distintos. De hecho, los proteomas difieren notablemente entre estos dos tejidos. Sin embargo, a pesar de estas diferencias, EPR y coroides siendo anatómicamente, funcionalmente y clínicamente ligados2,6,7. Por lo tanto cualquier análisis proteómico aguas abajo del complejo EPR-coroides deben tener en cuenta esta distinción clave.
Este manuscrito muestra un enfoque sencillo, fiable y bajo overhead para recogida de muestras para análisis proteómico de la fóvea, mácula y retina periférica y tejido RPE-coroides en los ojos humanos. A la discreción del investigador, pueden hacerse modificaciones en el proceso de recolección o manipulación, la colección y la colección, dependiendo el análisis proteómico abajo previsto del tejido.
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Disclosures
No hay conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
VBM es apoyado por subvenciones de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 y R21AG050437, Doris Duke Charitable Fundación Grant #: 2013103 y la investigación para evitar la ceguera (RPB), Nueva York, NY. MT y GV son apoyados por los NIH grant T32GM007337.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
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