Summary
İnsan retina fovea, makula ve periferik retina gibi işlevsel ve tatlı farklı bölgelerinde oluşur. Burada, incelemek ve bu farklı retina bölgeler aşağı akım proteomik analiz için toplamak için punch biyopsi ve doku katmanları bir insan gözünün üzerinden el ile kaldırılması kullanarak bir yöntemi açıklanmaktadır.
Abstract
İnsan retinanın duyusal neuroretina ve temel retina Pigmentli epitel (RPE), hangi vasküler choroid katmana sıkıca complexed oluşmaktadır. Retina farklı bölgelerinde benzersiz işlevleri kolaylaştırmak ve hastalık fark duyarlılık gösteren anatomik ve tatlı, farklıdır. Bu bölgeler ve Katmanlar proteomik analizi Age-Related yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), diyabet ve glokom da dahil olmak üzere birçok hastalığın moleküler sürecinin hayati kazandırabileceğini. Ancak, nicel proteomik analizi gerçekleştirilebilir önce retina bölgeler ve katmanları ayrılması önemlidir. Burada, diseksiyon ve foveal, maküler ve periferik retina bölgeler ve RPE koroid kompleks altında yatan, bölgesel punch biyopsi ve doku katmanları bir insan gözünün üzerinden el ile kaldırılmasını içeren koleksiyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Tek boyutlu SDS-sayfa hem hem aşağı akım proteomik analizi, sıvı Kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS), gibi retina hastalığı için moleküler biyolojik açığa proteinler disseke her retina tabakasında tanımlamak için kullanılabilir.
Introduction
Retina, RPE ve koroid protein ifade, fizyolojik fonksiyon ve patolojik duyarlılıkları1,2önemli bölgesel farklılıklar gösteren karmaşık dokuları vardır. Örneğin, Age-Related yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), retinitis pigmentosa ve merkezi seröz retinopati her gibi hastalıkların karakteristik yerelleştirme fovea, makula veya retina çevre1,3içinde göstermek, 4,6. Burada, nasıl farklı retina bölgeleri bağımsız olarak tatmak mümkündür gösteren bir yöntem mevcut. Bu yöntem genel amacı insan retina ve RPE koroid foveal, maküler ve çevre bölgelerdeki proteomik analiz için doku örnekleri topluluğu için güvenilir bir kılavuz sağlamaktır. Geliştirme ve bu tekniğin kullanımı için gerekçe proteomik analizi, bu özel retina bölgelerin, moleküler bilgiler bu bölgeler fizyolojik ve patofizyolojik görev içine elde etti önemli ile o.
Bu yaklaşım göreli bölgesel hastalık duyarlılıkları proteomik temeli ortaya çıkarmak ve yeni belirli tedavi hedefleri tanımlaması kolaylaştırmak için vaat ediyor. Nitekim, proteomik araştırmalar Vitre ve retina ile olan etkileşimleri işlevini sağlıklı ve hastalıklı doku5,7,8 ve moleküler kompozisyon içine anahtar anlayışlar hazırladık , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ancak, net karşılaştırmalı proteomik analizleri farklı retina bölgeler eksik vardır. Teknik avantajları diğer yöntemler üzerinde bir güvenilir ve tekrarlanabilir doku toplama yaklaşım göstererek sağlayan bu çok ihtiyaç duyulan çalışmaları desteklemek için yardımcı olacaktır. Daha çok, çok kolay, standart boyutlu ve hazır doku punch biyopsi araçları yararlanan bir yaklaşımdır. Bizim teknik uygun toplama ve depolama için işleme, protein istikrar ve yıkımı için önemli konuları yapma proteomik dokuların vurgular. Bu nedenle, bu yöntem en aşağı akım moleküler analiz proteomik faktörlerin göz önünde bulundurarak müfettişler için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada Iowa Üniversitesi tarafından onaylanmıştır ' s Kurumsal değerlendirme Komitesi ve Helsinki Deklarasyonu belirtilen ilkelerinin'in.
1. Foveal ve Maküler biyopsi yumruk
- açık ve kelebek insan göz, öyle ki bir önceki yayında açıklandığı gibi doku, 4 ayrı flep oluşur. 5
- bir kabında yerleştirilen bir pirzola insan gözü ile başlayan, bir 4-mm punch biyopsi araç fovea Merkezi aşağı bastırın ve bir kesi fovea yapılana kadar yavaşça rulo.
- Sonra ortalama ve bir 8 mm cilt punch biyopsi aracı makula arcades içinde aşağı tuşuna basarak, hafif basınç uygulayarak ve haddeleme tarafından makula çevresinde kesik oluşturur. Bu bir ikinci, dış halka ilk çevreleyen doku üretecek.
2. Periferik retina biyopsi yumruk
- kullanmak 4-mm cilt punch biyopsi aracı hemen dışında arcade periferik retina yumruk bir dizi yapmak için. Burada, her çeyrekte flap için iki yumruk olun.
Not: tüm yumruk yapılır, göz fovea ve makula, temsil eden iki konsantrik yumruklar şehir merkezinde olacak ve iki yumruklar her flep toplam tabanında sonra 8 periferik retina yumruk atıyor.
3. Fovea ve makula biyopsi koleksiyonu
- doku şimdi koleksiyonu için hazır olduğu gibi tüm doku biyopsisi ayrı microfuge tüpler toplamak ve sıvı nitrojen kullanarak aşağı akım işlem için dondurma. -80 ° C'de tüm örneklerini kullanımı kadar mağaza.
- Bir eğri 0,12 Colibri forseps retina fovea yarı saydam doku kenarlarını kapmak için kullanın. Toplamak için yüceltmek ve foveal doku temel RPE koroid ayırın.
- Benzer şekilde, yarı saydam makula dokusunun dış halka kavramak için 0,12 Colibri forseps kullanın. Doku hala temel veya bitişik doku iliştirdiyseniz, sadece retina bileşen yakalama ve uzak yumruk dahil herhangi bir optik sinir dokusu dissekan kenarına dikkatle kırpmaya Westcott makas kullanın.
4. Periferik Retina koleksiyonu
- yavaşça periferik retina doku diskleri temel RPE koroid ve bireysel microfuge tüpler içinde yer ayırmak için eğri 0,12 Colibri forseps kullanın.
- Durumunda kalan vitreus jeli, forseps kullanmak Asansör ve jel uzakta ayrı koleksiyonu retina dokusunun önce mümkün olduğu kadar. Retina kaldırıldıktan sonra Pigmentli RPE koroid aşağıda kalır.
5. Foveal ve makula RPE koroid koleksiyonu
- kaldırılan fovea alan altında yatıyor karanlık RPE koroid doku kenarlarını kavramak için kullanım 0,12 Colibri forseps. Bu doku sklera ve toplamak dikkatle ayrı.
- Aynı forseps kullanarak kaldırıldı makula alanının altında yatan karanlık RPE koroid doku dış halkasındaki kenarlarını kavramak. Dikkatle bu doku sklera halka etrafında farklı noktalarda kenarları açgözlü ve hafifçe çekerek ayırın. Sonunda, RPE koroid doku halka yerinden ve toplanan olabilir.
Not: İkincil forseps ters el kaldırma sırasında RPE koroid doku düzenleme yararlı olabilir. Retina doku gibi Wescott makas tam yumruk aracını kullanarak basamağında değil herhangi bir doku giderilmesinde yardımcı olmak için kullanılabilir.
6. Periferik Retina RPE koroid koleksiyonu
- 8 periferik yumruk alanlarda RPE koroid peel away için 0,12 Colibri forseps kullanın.
- Daha önce RPE koroid doku microfuge tüplerde yerleştirin ve sıvı nitrojen kullanarak aşağı akım işlem için dondurma. Tüm örneklerini-80 ° C'de kullanımı kadar devam.
7. Makas diseksiyon
Not: punch biyopsi blade donuk veya punch biyopsi aracı yeterince sert itti değil, olabilir bir çocuğun dokuyu çevreleyen.
- Bu gibi durumlarda, doku uzağa çekmek mümkün olduğu kadar ve Westcott makas ve ayırmak için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retina ve RPE koroid doku bireysel soruşturma uygun olarak çeşitli şekillerde işlenebilir. Toplandıktan sonra araştırmacı retina ve RPE koroid dokudan foveal bölge, dış makula ve periferik retina (şekil 1) sahip olacak. Özellikle, foveal bölgede yumruk fovea, parafovea ve bitişik perifovea az miktarda içerir. Yaşa bağlı makula yumruk perifoveal bölge hem de bitişik periferik yakınındaki bölgesinin küçük bir miktar geri kalanı içerir. Son olarak, periferik yumruklar orta periferik ve periferik uzak bölgelere örnek. Temsil edici bir deneyde, doku örnekleri tripsin sindirilmiş ve protein içeriği (şekil 2A) görselleştirmek için tek boyutlu SDS-sayfa kullanılarak analiz. Bu incelemenin sonuçlarını arasında retina farklı bölgelerinde farklı proteinler öneririz. Sıvı Kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS)6 göre analiz düzgün peptidler rhodopsin, son derece bol ve benzersiz retina protein üzerinden tespit edilmiştir. Yaşa bağlı makula bölgesinden elde edilen bir temsilcisi rhodopsin spektrum şekil 2Biçinde gösterilir. Protein içeriği, daha fazla çözümleme anlayışlar retina anatomik olarak farklı bölgelerinde moleküler işlevleri sağlar. Diseksiyon dikkatle gerçekleştirilmez ve retina düzgün RPE koroid ayrılmış değil durumda, protein içeriği bu iki doku arasındaki farkları discernable olmayacaktır.
Resim 1 . Retina bölgeler. Sağlıklı bir insan retina temsilcisi bir görüntü. Farklı retina bölgeler noktalı çevrelerin vurgulanır ve punch biyopsi tarafından örneklenen bölgeleri katı daireler tarafından gösterilir. Sarı noktalı daireler fovea, parafovea ve sarı katı daire ise (dışa Merkezi'nden seyahat), perifovea de dahil olmak üzere foveal bölgesini temsil eden 4 mm foveal yumruk temsil eder. Mavi katı Daire 8 mm makula yumruk temsil ederken mavi noktalı daire anatomik maküler bölge temsil eder. Son olarak, pembe noktalı daireler çevre retina periferik bölgesini (P) yakın, orta retina periferik bölge (P) orta ve uzak çevre bölge (çok P) temsil eden. Pembe katı daire orta P ve P uzak bölgeleri içeren 4 mm periferik retina yumruklar temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Retina protein tanımlaması. Periferik retina, makula ve foveal bölgeleri biyopsi ve proteomik analizi için kullanılır. (A) One-Dimensional SDS-sayfa ve gümüş boyama proteinleri retinal her bölgedeki görüntülenir. (B) sıvı Kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizi tabidir Retina doku örnekleri vardı. Yaşa bağlı makula bölgede tespit rhodopsin protein gösterilen temsilcisi spektrumdur. Bu yelpazenin makula içinde tanımlanan beş benzersiz rhodopsin peptidler birini temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sonra doku toplanması, örnek işleme ve tedavisi çok önemli konuları14vardır. Koruma sıvı azot ikinci aşağı akım analizi çarpık protein yapısına zarar görmesine neden kimyasal fiksasyonu tercih edilir. Ayrıca, sıvı nitrojen koruma örnekleri dondurulması içermeyen yöntemleri için tercih edilir. 4 ° C veya oda sıcaklığında, bu 0 ° C15, depolanan karşılaştırıldığında korunmuş beyin örnekleri arasında protein düzeyleri önemli farklılıklar gösterdi en belirgin Ferrer vd . Ayrıca, örnekleri, donma protein düzeyleri ve translasyonel modifikasyonlar16,17değiştirme potansiyeline sahiptir önce belirli kimyasal ve fiziksel tedavi olarak işlerken dikkatli olmanız önemlidir. Bu noktada amaçlanan aşağı akım analiz örnekleri göz önünde bulundurarak önemini vurgular. Ayrı ayrı, doku hasat öldükten sonra zamanlama düzeyleri ve spesifik proteinlerin kararlılığını etkileyen başka bir faktördür. Bozulması için örnek Proteom zaman öldükten sonra ve depolama sıcaklığı18,19,20bağlı olarak ortaya çıkabilir. Ayrıca, tarafından hastalık doku ve sağlıklı doku arasında iç kontrol kullanımı gibi zaman öldükten sonra bozulması için kontrol etmek önemlidir. Zamanlama faktörü dikkate gerekiyorsa, bozulma sonuçları çarpık. Genel bir kural olarak, ne kadar çabuk analiz otopsi çalışma sonuçları değiştirmek yıkımı için daha az risk dokudur.
Birçok yordam değişikliği bu iletişim kuralı için bir özel araştırma soru daha iyi uyacak şekilde yapılabilir. Bir değişiklik farklı boyutu cilt punch biyopsi araçları doku örnekleri farklı miktarda toplamak için kullanılabilir olduğunu. Daha fazla veya daha az doku aşağı akım proteomik miktar veya istikrar ilgi belirli proteinlerin bağlı olarak işleme için gerekli olabilir. Ayrıca, retina veya RPE koroid belirli bölgelerinde örneklenmiş nasıl fena halde doku punch biyopsi boyutunu belirleyebilirsiniz. Örneğin, belirli, iyi patolojik doku bölgelerinde gerekiyorsa, daha küçük deri punch biyopsi araçlar gerekli olabilir. Ayrıca, bir bölüm punch biyopsi Araçları özellikleri damla iyi ise mikrodiseksiyon gerekli21olabilir. Ayrıca, diseksiyon kapsam veya Büyüteç camı, gibi görsel araçları kullanımı doku toplama işlemi-özellikle küçük küre boyutları, durumlarda gibi çocuksu oküler doku ile yardımcı olabilir.
Son olarak, bu teknik RPE ve choroid doku grupları tek bir kompleks olarak olsa da, bu dokuların tatlı ve işlevsel olarak ayrı kalmasını unutmamak gerekir. Gerçekten de, proteomes belirgin iki Bu dokular arasında farklılık gösterir. Ancak, bu farklılıklar, RPE ve koroid anatomik olarak, işlevsel ve klinik olarak kalır karşın2,6,7bağlantılı. Böylece herhangi bir aşağı akım proteomik analizi RPE koroid kompleks bu önemli ayrım unutmayın.
Bu el yazması fovea, makula ve periferik retina ve RPE koroid doku insan Eyes proteomik analiz için örnek koleksiyon için basit, güvenilir, düşük Tepegöz yaklaşım gösteriyor. Araştırmacı takdirine toplama işlemi veya doku işleme, ön toplama ve bağlı olarak amaçlanan aşağı akım proteomik analiz sonrası koleksiyonu için değişiklik yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.
Acknowledgments
VBM olduğunu NIH hibe [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 ve R21AG050437], Doris Duke hayırsever Vakfı Hibe desteklenen #: 2013103 ve araştırma için önlemek körlüğü (RPB), New York, NY. MT ve GV NIH tarafından desteklenmektedir T32GM007337 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
References
- Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration. Eye (Lond). , (2016).
- Zhang, P., et al. Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid. Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).
- Funke, S., et al. Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples. Sci Rep. 6, 29759 (2016).
- Decanini, A., et al. Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes. Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis. J Vis Exp. (47), (2011).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex. JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. J Vis Exp. (50), (2011).
- Skeie, J. M., et al. Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques. Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex. PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M. Translational vitreous proteomics. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).
- Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. Proteomic insight into the molecular function of the vitreous. PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).
- Velez, G., et al. Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease. JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).
- Velez, G., et al. Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment. Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Ferrer, I., et al. Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).
- Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization. J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).
- Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics. J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).
- Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).
- Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains. PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).
- Nagy, C., et al. Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain. J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).
- Mukherjee, S., et al. Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection. Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).
