Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

माउस में प्रारंभिक गर्भावस्था लक्षण वर्णन के लिए तीन आयामी उच्च आवृत्ति ट्रा का एक उपंयास का उपयोग

Published: October 24, 2017 doi: 10.3791/56207
Automatic Translation
1,4, 2, 2, 1, 1, *3, *4
1Devision of Repreoductive Endocrinology and Infertility, Department of Obstetrics and Gynecology, Baylor College of Medicine, 2Mouse Phenotyping Core, Baylor College of Medicine, 3Reproductive and Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

चूहों व्यापक रूप से गर्भावधि जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि, गर्भावस्था समाप्ति ऐसे अध्ययनों के लिए आवश्यक है जो अनुदैर्ध्य जांच precludes और पशुओं की बड़ी संख्या का उपयोग आवश्यक । इसलिए, हम जल्दी पता लगाने और गर्भवती माउस में प्रत्यारोपण के बाद की घटनाओं की निगरानी के लिए उच्च आवृत्ति ट्रा की एक गैर इनवेसिव तकनीक का वर्णन ।

Abstract

हाई-फ्रीक्वेंसी ट्रा (HFUS) utero मेंमानव भ्रूण के वास्तविक समय के विकास को गैर-इनवेसिव रूप से मॉनिटर करने के लिए एक आम तरीका है । माउस नियमित रूप से एक vivo में मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है भ्रूण आरोपण और गर्भावस्था प्रगति का अध्ययन । दुर्भाग्य से, इस तरह के murine अध्ययन गर्भावस्था रुकावट अनुवर्ती phenotypic विश्लेषण को सक्षम करने के लिए की आवश्यकता है । इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, हम तीन आयामी (3-डी) HFUS इमेजिंग डेटा के जल्दी पता लगाने और murine भ्रूण आरोपण साइटों और उनके utero मेंव्यक्तिगत विकासात्मक प्रगति के लक्षण वर्णन के लिए पुनर्निर्माण का इस्तेमाल किया । 3-डी पुनर्निर्माण और मॉडलिंग के साथ HFUS इमेजिंग का मेल, हम सही ढंग से भ्रूण आरोपण साइट संख्या के रूप में अच्छी तरह से गर्भवती C57BL6J में विकासात्मक प्रगति की निगरानी करने में सक्षम थे/129S चूहों से ५.५ दिनों के बाद सहवास (d.p.c.) के माध्यम से ९.५ d.p.c. एक transducer के उपयोग के साथ । माप शामिल: संख्या, स्थान, और आरोपण साइटों की मात्रा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंतर-आरोपण साइट रिक्ति; भ्रूण व्यवहार्यता कार्डियक गतिविधि निगरानी द्वारा मूल्यांकन किया गया था । तत्काल बाद में आरोपण अवधि (५.५ से ८.५ d.p.c.), 3-डी पुनर्निर्माण दोनों मेष और ठोस ओवरले प्रारूप में gravid गर्भाशय के एक गर्भाशय सींग के भीतर विकासशील गर्भधारण के दृश्य प्रतिनिधित्व सक्षम होना चाहिए । के रूप में आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों को मादा प्रजनन गर्भाशय रोग से व्युत्पंन phenotypes विशेषताएं इस्तेमाल किया जा जारी, इस विधि का पता लगाने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है, यों, और vivo मेंजल्दी आरोपण घटनाओं की विशेषता । 3 डी HFUS इमेजिंग के इस उपंयास का उपयोग करने की क्षमता को सफलतापूर्वक पता लगाने, कल्पना, और एक गैर इनवेसिव तरीके में जल्दी murine गर्भावस्था के दौरान भ्रूण आरोपण साइटों की विशेषता दर्शाता है । प्रौद्योगिकी वर्तमान तरीकों पर एक महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करता है, जो सकल ऊतक और histopathologic लक्षण वर्णन के लिए गर्भधारण की रुकावट पर भरोसा करते हैं । यहां हम एक वीडियो और पाठ स्वरूप का वर्णन कैसे सफलतापूर्वक जल्दी murine गर्भावस्था के अल्ट्रासाउंड प्रदर्शन करने के लिए जाल और ठोस 3-डी छवियों में गर्भाशय के रूप में पुनर्निर्माण के साथ विश्वसनीय और प्रतिलिपि डेटा उत्पंन का उपयोग करें ।

Introduction

आवर्तक जल्दी गर्भावस्था हानि गर्भाधान के बाद सबसे आम जटिलताओं में से एक है और1,2गर्भ धारण करने की कोशिश कर रहे जोड़ों के लगभग 1% को प्रभावित करता है । प्रारंभिक गर्भावस्था के झड़ने के अंतर्निहित तंत्र विविध रहे हैं: आंतरिक भ्रूण विषमताओं और मातृ comorbidities से एंडोमेट्रियल ग्रहणशीलता1,3,4में दोषों के लिए । क्योंकि उनके आनुवंशिक पथ की, माउस मॉडल है व्यापक रूप से जल्दी भ्रूण आरोपण और गर्भावस्था की जांच के लिए उपयोग किया गया है । इसके अलावा, माउस के लघु गर्भावधि समय और बड़े पैमाने पर अध्ययन करने की क्षमता मानव प्रजनन चिकित्सा में प्रमुख नैदानिक प्रश्नों को संबोधित करने में माउस की बढ़ती उपयोगिता को सुनिश्चित किया है5. उस ने कहा, murine प्रयोगात्मक डिजाइन के विशाल बहुमत अभी भी कई बांधों की आवश्यकता के लिए अनुक्रमिक गर्भावधि दिनों पर euthanized हो सकता है और आरोपण साइट स्थान का विश्लेषण, संख्या, आकार, और रिक्ति पैटर्न गर्भावस्था के दौरान6, 7,8, जिससे एक ही जानवर पर precluding अनुदैर्ध्य पढ़ाई हो ।

क्लिनिक में, अल्ट्रासाउंड एक गैर इनवेसिव तरीके से मानव भ्रूण व्यवहार्यता और विकास की निगरानी करने के लिए एक विश्वसनीय और अमूल्य उपकरण है9,10,11। हाल ही में, उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड (HFUS) गर्भावस्था के दौरान भ्रूण व्यवहार्यता और विकास की निगरानी के लिए एक विधि के रूप में माउस में सीमित अनुप्रयोगों को खोजने के लिए शुरू कर दिया है12,13,14। अल्ट्रासाउंड इमेजिंग में हाल ही में तकनीकी प्रगति पशु अंगों और विकृतियों के बाद निगरानी के दृश्य पुनर्निर्माण के लिए तीन आयामी (3-D) डेटा के आवेदन की अनुमति दी है15,16, 17. इस उन्नत इमेजिंग तकनीक का उपयोग स्पष्ट रूप से छोटे मात्रा में उतार चढ़ाव का पता लगाने के लिए शक्ति में सुधार हुआ है, अंतर-पशु परिवर्तनशीलता को कम करने, और एक विकृति या एक चिकित्सीय हस्तक्षेप की प्रभावकारिता की प्रगति की निगरानी करने के लिए17. जबकि इस तकनीक की प्राथमिक उपयोगिता को oncomouse मॉडल15,16, 3 डी HFUS इमेजिंग में द्रोह प्रगति पर नजर रखने के लिए किया गया है हाल ही में quantitate और भ्रूण आरोपण के सक्रिय विकास की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है और माउस गर्भाशय18में भ्रूण विकास ।

यहां, हम प्रदर्शन कैसे HFUS इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए 2 डी और 3-डी डेटा उत्पादन के लिए जल्दी गर्भवती माउस गर्भाशय के पुनर्निर्माण उत्पंन करते हैं । हम इस उपंयास विधि की उपयोगिता के लिए गर्भावस्था के समापन की आवश्यकता के बिना इन जल्दी भ्रूण आरोपण घटनाओं का पता लगाने के प्रदर्शन, शोधकर्ताओं ने एक गैर इनवेसिव तरीके से डेटा इकट्ठा करने की अनुमति ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

< p class = "jove_content" > ये अध्ययन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित स्वास्थ्य और पशु प्रोटोकॉल के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला पशुओं के देखभाल और उपयोग के लिए मार्गदर्शिका के अनुसार आयोजित किए गए थे Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन के तहत प्रोटोकॉल नंबर एक-४२०३.

< p class = "jove_title" > 1. अल्ट्रासाउंड के लिए गर्भवती माउस की तैयारी

  1. समय सहवास
    1. एक सिद्ध उपजाऊ पुरुष माउस के साथ बांध प्लेस १७०० के बाद रातोंरात शुरुआत । अलग बांध और ०७०० घंटे (एच) द्वारा पुरुष, चाहे अगर योनि प्लग मौजूद है, गर्भावस्था के सटीक डेटिंग सुनिश्चित करने के लिए ।
      नोट: सहवास के बाद सुबह ०.५ दिन पोस्ट coitum (d.p.c.) माना जाता है.
  2. तैयारी के लिए अल्ट्रासाउंड
    1. एक सील संज्ञाहरण प्रेरण कंटेनर में गर्भवती माउस जगह ।
    2. isoflurane के साथ बेहोश (2%) सांस संवेदनाहारी और ऑक्सीजन (1 & #160; L/जब तक जानवर) लेकन पलटा (लगभग 1-2 मिनट माउस के आकार पर निर्भर करता है) खो देता है और सहज आंदोलनों (श्वसन के अलावा) नहीं मनाया जाता है ।
    3. जगह isoflurane के साथ नाक शंकु में लापरवाह स्थिति में माउस को बेहोश (2%) श्वास संवेदनाहारी और ऑक्सीजन (1 & #160; L/ लागू नेत्र मरहम पशु & #39; s आंखें.
      4. एक कपास झाड़ू के साथ
    4. , पूरे पेट के लिए लोमनाशक क्रीम लागू करते हैं, योनि के लिए उरोस्थि, और पार्श्वों के लिए ।
    5. क्रीम 3 मिनट की एक अधिकतम के लिए रहने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर ऊतक के साथ क्रीम और बालों को हटा दें । सुनिश्चित करें कि सभी बाल हटा दिया है, के रूप में किसी भी शेष बाल छवि गुणवत्ता में कमी आएगी ।
< p class = "jove_title" > 2. अल्ट्रासाउंड के मंच की तैयारी

  1. चालू transducer.
  2. 3-डी मोटर स्टेज मोटर स्टेज transducer. करने के लिए संलग्न
    1. 3d मोटर में 3 डी मोटर केबल को जोड़ने के द्वारा रियर पैनल पर 3d मोटर कनेक्टर प्लग । बढ़ते सिस्टम को 3 डी मोटर प्रणाली शीर्ष पर जल्दी रिलीज पोस्ट का उपयोग करने के लिए संलग्न इमेजिंग स्टेशन से कनेक्ट करने के लिए, और जल्दी रिलीज transducer दबाना करने के लिए नीचे पर माउंट ।
  3. को जांच लगायेंगे transducer दबाना ।
< p class = "jove_title" > 3. इमेजिंग शुरू गर्भवती माउस

  1. जगह माउस लापरवाह निगरानी मंच पर । माउस लगातार नाक शंकु के माध्यम से isoflurane संवेदनाहारी (1.5-2.5%) और ऑक्सीजन (1 & #160; L/ धीरे मंच पर दिल की दर की निगरानी पैड के लिए सभी पंजे टेप करें.
    1. पेट पर अल्ट्रासाउंड ट्रांसमिशन जेल के 1-2 एमएल लागू होते हैं ।
  2. मैनुअल मोटर अवस्था का उपयोग कर, पेट के निचले पर अल्ट्रासाउंड जांच की स्थिति ।
    1. मूत्राशय, जो एक तरल पदार्थ से भरे अंधेरे चक्र के रूप में दिखाई देना चाहिए सिर्फ योनि खोलने के लिए cephalad पता लगाएँ.
    2. एक बार मूत्राशय स्थित है, जांच कदम बहुत धीरे गर्भवती गर्भाशय है, जो गर्भावस्था साइटों पर गोल क्षेत्रों के साथ एक बेलनाकार आकार के रूप में प्रकट करना चाहिए कल्पना करने के लिए cephalad । यह एक श्रृंखला पर मोती की तरह लग रही के रूप में वर्णित किया जा सकता है ।
    3. एक बार गर्भवती गर्भाशय की पहचान की गई है, 2-डी इमेजिंग शुरू ।
< p class = "jove_title" > 4. 2-डी अल्ट्रासाउंड इमेजिंग (चित्रा 1)

  1. गर्भवती गर्भाशय की पहचान की गई है एक बार, मूत्राशय के निकटतम और धीरे और क्रमिक रूप से गर्भावस्था साइटों की संख्या और स्थान निर्धारित करने के लिए cephalad स्थानांतरित करने के लिए गर्भावस्था साइट पर शुरू ।
  2. अगर गुर्दे, तिल्ली, या जिगर की कल्पना कर रहे हैं, जांच की स्थिति करीब caudal (मूत्राशय के करीब) के रूप में उपयोगकर्ता बहुत दूर cephalad चला गया है ।
  3. छवि एक ही तरीके से contralateral गर्भाशय सींग ।
  4. जब अल्ट्रासाउंड फ्रेम आरोपण/गर्भावस्था साइट के केंद्र में बाद में विश्लेषण और माप के लिए बचाने के लिए छवि फ्रीज ।
    नोट: यह छवि के लिए एक दूसरे से कम लेता है जमे हुए और बाद में विश्लेषण के लिए बचाया ।
  5. उपाय आरोपण दूरी मैन्युअल रूप से पर क्लिक करके एक मार्कर के रूप में hyperechoic decidualization प्रतिक्रिया का उपयोग कर & #34; उपाय & #34; उपकरण पहले, और फिर एक आरोपण साइट के स्थान पर क्लिक करके. अगले, अगले आरोपण साइट के लिए कर्सर खींचें और एक लाइन है कि कंप्यूटर स्वचालित रूप से इसकी दूरी की रिपोर्ट करेंगे आकर्षित करने के लिए क्लिक करें । सॉफ्टवेयर फिर रिपोर्ट करेगा कि मैनुअल माप क्या है । यह चरण कंप्यूटरीकृत नहीं है, लेकिन उपयोगकर्ता पर निर्भर करता है decidualized साइटों, जो कार्यक्रम के लिए एक माप प्रदान करेगा के बीच एक लाइन ड्राइंग द्वारा decidualized साइटों के बीच दूरी को चिह्नित करने के लिए ।
  6. उपाय आरोपण आकार, गर्भावधि थैली आकार, और भ्रूण पोल आकार.
< p class = "jove_title" > 5. भ्रूण दिल दर

< p class = "jove_content" > नोट: ९.५ d.p.c. पर, भ्रूण दिल की धड़कन स्पष्ट रूप से visualized किया जाना चाहिए ।

  1. जबकि जांच बहुत अभी भी रखते हुए, पल्स वेव डॉपलर पर बारी और दृश्य दिल की धड़कन पर इस स्थिति.
    2. हृदय हृदय को हरा स्पंदन
  2. रर.
    नोट: इसके अलावा दिल से, इस प्रक्रिया भी गर्भनाल में स्पंदन रिकॉर्ड कर सकते हैं ।
< p class = "jove_title" > 6.3-डी अल्ट्रासाउंड अर्जन

  1. के बाद गर्भवती गर्भाशय 2-डी इमेजिंग पर visualized किया गया है, एक क्षेत्र है कि वांछित 3-डी छवि के अनुमानित मध्य बिंदु में है में जांच की स्थिति । उदाहरण के लिए, यदि एक इमेजिंग 3 में एक सेब डी थे, जांच शुरू में रखा जाना चाहिए, जहां एप्पल कोर स्थित होने की भविष्यवाणी की है (यानी वस्तु के बीच) ।
  2. वांछित छवि के बीच में एक स्थिति में जांच के साथ, एक 3 डी अधिग्रहण प्राप्त करते हैं । 3 डी मोटर चरण चरण या फ्रेम की एक श्रृंखला में गर्भाशय भर में इस दूरी की यात्रा करेंगे, पूरी तरह से क्या अंवेषक इच्छाओं पर कब्जा करने के इरादे से ।
  3. की पुष्टि करें कि इरादा संरचनाओं वास्तविक समय अल्ट्रासाउंड भाग को पूरा करने से पहले 3-डी स्कैनिंग में पूरी तरह से कैप्चर किए गए हैं । बाद के समय में इस 3-डी जानकारी को पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए सहेजें । अनुभवी उपयोगकर्ता द्वारा निष्पादित किए जाने पर 2-डी और 3-डी अल्ट्रासाउंड प्राप्ति के लिए कुल समय लगभग 10-20 मिनट है ।
< p class = "jove_title" > 7.3-डी पुनर्गठन पोस्ट-प्रोसेसिंग (चित्रा 2)

  1. 3-डी छवि प्रसंस्करण के लिए वांछित डेटा लोड ।
  2. चुन & #34;p arallel और रोटेशनल तरीके & #34;, जो सभी 3d इमेज फ्रेम को एक 3-डी & #34 में लोड करेगा; box & #34; कि उपयोगकर्ता तब इच्छित ऑब्जेक्ट, फ़्रेम-द्वारा-फ़्रेम में ट्रेस करेगा । चरण आकार ०.०८ मिलीलीटर चुनें । छवि ब्लॉक के एक छोर पर शुरू और अंतरिक्ष के भीतर कब्जा कर लिया गया है कि छवियों के साथ परिचित करने के माध्यम से स्क्रॉल.
    1. छवि के एक छोर पर प्रारंभ करें और मैन्युअल रूप से ऑब्जेक्ट की बाह्यरेखा का पता लगाएँ.
    2. स्क्रॉल करने के लिए अगले 2-डी छवि स्लाइस या & #34; फ़्रेम & #34; और मैंयुअल रूप से ऑब्जेक्ट की बाह्यरेखा को ट्रेस करें ।
    3. इस प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक कि सभी फ़्रेम उपयोगकर्ता द्वारा मैन्युअल रूप से व्याख्या/
    4. क्लिक & #34; समाप्त & #34; 3-डी छवि और कुल वॉल्यूम परिकलनों को प्राप्त करने के लिए ।
  3. जाल और ठोस ओवरले, जो शीर्ष बाएँ कोने में एक तीर है के बीच चयन करें ।
  4. रखने के लिए या स्पष्टता के लिए आसपास के अल्ट्रासाउंड छवि जानकारी को दूर करने के लिए चुनें । प्रत्येक 3-डी पुनर्निर्माण 10 और 20 मिनट के बीच ले सकता है.
< p class = "jove_title" > 8. पोस्ट-प्रक्रियात्मक देखभाल

  1. जब अल्ट्रासाउंड पूरा हो गया है, संज्ञाहरण गैस बंद करें, मंच से माउस को हटाने और धीरे से पोंछ और पशु से किसी भी अल्ट्रासाउंड जेल दूर धोने ।
  2. पिंजरे में एक गद्देदार क्षेत्र में एक प्रवण स्थिति में वापस माउस जगह है । पशु जाग और अनायास चलती है जब तक निगरानी.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

के रूप में चित्रा 1में प्रदर्शन किया, उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड आरोपण साइट के विकास के रूप में शुरू का पता लगाने कर सकते हैं ५.५ डी. पी. सी समय बिंदु के रूप में जल्दी । ६.५ डी. पी. सी. में आरोपण साइटों के एक मार्कर के रूप में हल्का hyperechoic decidualized अंतर्गर्भाशयकला का उपयोग आरोपण साइटों और इन साइटों की रिक्ति की संख्या मात्रा होने की अनुमति देता है । के रूप में गर्भावस्था ७.५ d.p.c. के लिए प्रगति, एक गहरा hypoechoic गर्भावधि थैली और भ्रूण पोल भी आसानी से पहचाने जाने योग्य हैं ।

जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है, माउस गर्भाशय के तीन आयामी पुनर्निर्माण की पूर्ण पोस्ट-प्रोसेसिंग संरचना को विज़ुअलाइज़ करने में सक्षम है । ६.५ डी. पी. सी. में 3-डी उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड संरचना दोनों मेष और ठोस ओवरले स्वरूपों में एक दृश्य चित्रण प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक अंय उदाहरण के लिए, ७.५ पर इस बार डी. पी. सी, दोनों मेष और ठोस ओवरले के साथ एक और गर्भाशय के अंतिम समग्र छवि को दर्शाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: आरोपण साइट के विकास और गर्भ में भ्रूण विकास की निगरानी के उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड का पता लगाने । जैसा कि चित्र 1aमें दिखाया गया है, ५.५ पर d.p.c. लाइटर hyperechoic decidualized अंतर्गर्भाशयकला (d) आरोपण साइटों की संख्या और रिक्ति को मात्रा करने की अनुमति देता है. के रूप में चित्रा 1bमें दिखाया गया है, एक और गर्भाशय सींग में decidualization साइटों (डी) गर्भाशय सींग (यू) से जुड़े हुए हैं । द्वारा ७.५ d.p.c., गहरा hypoechoic सैक (जी एस) और भ्रूण ध्रुव (एफ) आसानी से पहचाने जाने योग्य चित्र 1Cहैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रारंभिक गर्भावस्था के दौरान तीन आयामी माउस गर्भाशय के पुनर्निर्माण. ६.५ डी. पी. सी. में, जैसा कि चित्र 2aमें दिखाया गया है, दोनों मेष और ठोस ओवरले स्वरूपों में 3-डी उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड दिखाए जाते हैं । ७.५ डी. पी. सी. में, जैसा कि चित्र2 ए में दिखाया गया है, 3-डी उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड छवियों मेष और ठोस ओवरले स्वरूपों के साथ दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3 डी HFUS इमेजिंग के इस उपंयास का उपयोग करने की क्षमता को सफलतापूर्वक पता लगाने, कल्पना, और एक गैर इनवेसिव तरीके में जल्दी murine गर्भावस्था के दौरान भ्रूण आरोपण साइटों की विशेषता दर्शाता है । प्रौद्योगिकी वर्तमान तरीकों पर एक महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करता है, जो सकल ऊतक और histopathologic लक्षण वर्णन के लिए गर्भधारण की रुकावट पर भरोसा करते हैं । लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऊतकीय तरीके अभी भी अधिक इष्टतम माना जाता है जब एक और अधिक बढ़ाया और अधिक सेलुलर स्तर पर लक्षण वर्णन किया जाना चाहिए, या जब जीन और प्रोटीन विश्लेषण की आवश्यकता है । नए माउस आरोपण दोषों और जल्दी गर्भावस्था हानि19,20,21,22, इस उंनत अल्ट्रासाउंड तकनीक की क्षमता का पता लगाने के लिए जल्दी प्रदर्शित मॉडल की बढ़ती संख्या के साथ ५.५ डी. पी. सी. सी. से गर्भधारण पूर्व अल्ट्रासाउंड तरीकों कि मध्य गर्भावस्था12,13पर पता लगाने के लिए सीमित थे पर स्पष्ट लाभ प्रदान करता है । इसके अलावा, इस विधि हृदय गति का पता लगाता है जैसे ही दिल को हरा शुरू होता है, 8.5 के बीच-9.5 डी. पी. सी23,24 व्यवहार्य भ्रूण की पुष्टि के लिए अनुमति देता है । एक ही जानवर में जल्दी गर्भावस्था की घटनाओं का पालन करने की क्षमता का मतलब है कम जानवरों प्रयोग प्रति आवश्यक है और अधिक सटीक विश्लेषण ऐसे अनुदैर्ध्य प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है25,26, 27.

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रोटोकॉल में तीन सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: (1) सटीक गर्भावधि दिन जानने; (2) ऑपरेटर की क्षमता के लिए गर्भाशय का पता लगाने और सही संरचनात्मक साइट पर जांच की स्थिति; और (3) सटीक तकनीक एक 3 डी पुनर्निर्माण का उत्पादन करने के लिए । निंनलिखित मुसीबत शूटिंग दिशानिर्देश मददगार साबित: जब यह अल्ट्रासाउंड पर गर्भाशय का पता लगाने के लिए मुश्किल है, तो उपयोगकर्ता यह सुनिश्चित करना है कि मूत्राशय पहले की पहचान की है द्वारा शुरू कर सकते हैं । मूत्राशय को आमतौर पर काले घेरे के रूप में देखा जाता है, और योनि खोलने के लिए तुरंत cephalad जाता है । यहां तक कि चूहों में है कि पिशाब तुरंत पहले अल्ट्रासाउंड करने के लिए आया है, मूत्राशय पूरी तरह से खाली नहीं है और इस तरह (हमारे अनुभव में) एक विश्वसनीय मार्कर हो सकता है । एक बार मूत्राशय की पहचान की है, जांच धीरे से गर्भाशय में देखा जाता है जब तक cephalad ले जाया जाना चाहिए । यदि मूत्राशय छोटा है या visualized किया जा करने में असमर्थ है, तो उपयोगकर्ता भी अंडाशय में शुरू करके गर्भाशय कल्पना करने का प्रयास कर सकते हैं, जो पार्श्वों में पाया जा सकता है, गुर्दे के लिए अवर । इस व्यवस्थित दृष्टिकोण का उपयोग करना, प्रत्येक आरोपण साइट और भ्रूण विकास देखा जा सकता है, के रूप में चित्रा 1। इस अवसर पर, जिस तरह से गर्भाशय पेट में तैनात किया जाता है के रूप में ट्रा के दौरान गर्भाशय के वांछित क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है, के रूप में अलग आकार और vivo में गर्भाशय की स्थिति से चित्रा 2 में दिखाया गया है । उपयोगकर्ता एक और अधिक अनुकूल स्थिति जिसमें वांछित गर्भाशय क्षेत्र अल्ट्रासाउंड द्वारा कब्जा किया जा सकता है के लिए आंतरिक रूप से गर्भाशय को शिफ्ट करने या फिर से संगठित करने के लिए माउस प्लेटफॉर्म विमान झुकाव कर सकते हैं । अंत में, उपयोगकर्ता अल्ट्रासाउंड सत्र पूरा होने के बाद जल्द ही अधिग्रहीत अल्ट्रासाउंड छवियों के माध्यम से जल्दी से स्क्रॉल करके ट्रा के दौरान वांछित गर्भाशय छवियों प्राप्त किया गया था कि पुष्टि कर सकते हैं । एक छोटी सी सीमा है कि 3-डी मेष/ठोस ओवरले दृश्य पुनर्निर्माण के लिए अल्ट्रासाउंड सत्र के दौरान नहीं किया जा सकता है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि अल्ट्रासाउंड छवियों को प्राप्त किया जा रहा सटीक रहे हैं, हम अनुशंसा करते हैं कि शोधकर्ताओं के रूप में प्रवीणता प्राप्त कर रहे हैं, पशुओं अल्ट्रासाउंड के बाद euthanized के लिए अल्ट्रासाउंड निष्कर्षों की सटीकता के लिए सकल ऊतक नमूना सहसंबंधी बनाने के लिए कर रहे हैं माप और एनाटॉमी ।

जब तक हम यहां सामांय murine गर्भावस्था के मॉडलिंग का वर्णन, इस तकनीक के भविष्य के आवेदन असामांय जल्दी गर्भावस्था की घटनाओं यों तो लागू किया जाएगा । HFUS और 3-डी पुनर्निर्माण जांचकर्ताओं का पता लगाने और संख्या, आकार और गर्भधारण के स्थानों पर नजर रखने की अनुमति है जो विकास और/ उदाहरण के लिए, विषमताओं के गैर इनवेसिव phenotypic लक्षण वर्णन-अर्थात दोषपूर्ण एंडोमेट्रियल decidualization, ंयायपालिका भ्रूण आरोपण वितरण, और अपर्याप्त trophoblastic आक्रमण और वृद्धि-एक बढ़ती द्वारा प्रदर्शित आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों की संख्या अब longitudinally गर्भावस्था रुकावट के बिना विश्लेषण किया जा सकता है इस इमेजिंग पद्धति का उपयोग कर ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम बहुत बहुत रॉंग Zhao, जिे ली, और यान यिंग की सहायता की सराहना करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine VisualSonics, inc. VS-11945
Vevo Imaging Station VisualSonics, inc. SA-11982
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel Parker #SKU PLI 01-08
Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle Henry Shein #29404
PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment Dechra #12920060

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
  2. Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
  3. Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
  4. Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
  5. Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
  6. Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897 (2015).
  7. Ding, Y. B., et al. 5-aza-2'-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364 (2012).
  8. Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
  9. Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
  10. Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
  11. Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
  12. Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205 (2013).
  13. Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38 (2014).
  14. Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
  15. Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97 (2015).
  16. Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
  17. Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
  18. Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312 (2017).
  19. Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
  20. Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500 (2012).
  21. Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171 (2016).
  22. Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
  23. Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
  24. Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
  25. Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
  26. Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
  27. Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक १२८ तीन आयामी उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड माउस आरोपण गर्भावस्था
माउस में प्रारंभिक गर्भावस्था लक्षण वर्णन के लिए तीन आयामी उच्च आवृत्ति ट्रा का एक उपंयास का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peavey, M. C., Reynolds, C. L.,… More

Peavey, M. C., Reynolds, C. L., Szwarc, M. M., Gibbons, W. E., Valdes, C. T., DeMayo, F. J., Lydon, J. P. A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse. J. Vis. Exp. (128), e56207, doi:10.3791/56207 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter