Summary
Mus er meget udbredt at studere svangerskabsuge biologi. Men graviditet opsigelse kræves for sådanne undersøgelser, som er til hinder for langsgående undersøgelser og nødvendiggør brug af et stort antal dyr. Derfor, vi beskriver en non-invasiv teknik, høj frekvens ultralyd for tidlig opdagelse og overvågning af efter implantation begivenheder i den gravide mus.
Abstract
Høj-frekvens ultralyd (HFUS) er en fælles metode til ikke-invasivt overvåge real-time udvikling af menneskelige fosteret i utero. Musen bruges rutinemæssigt som en i vivo model til at studere embryo implantation og graviditet progression. Desværre, sådan murine undersøgelser kræver graviditet afbrydelse at aktivere opfølgende fænotypiske analyser. For at løse dette problem, brugte vi tre-dimensionelle (3-D) genopbygning af HFUS imaging data for tidlig påvisning og karakterisering af murine embryo implantation sites og deres individuelle udviklingsmæssige progression in utero. Ved at kombinere HFUS imaging med 3D-genopbygning og modellering, var vi i stand til nøjagtigt kvantificere embryo implantation site nummer samt overvåge udviklingsmæssige progression i gravide C57BL6J/129S mus fra 5.5 dage post coitus (d.p.c.) gennem til 9,5 d.p.c. med brugen af en transducer. Målinger inkluderet: antal, placering og volumen af implantation websteder samt Inter implantation websted afstand; embryo levedygtighed blev vurderet af hjertets Aktivitetsovervågning. I den umiddelbare efter implantation periode (5,5 til 8,5 d.p.c.), 3D-genopbygning af fælderne livmoderen i både mesh og solid overlay format aktiveret visuel repræsentation af de udvikle graviditeter inden for hver uterin horn. Som gensplejsede mus fortsat kan anvendes til at karakterisere kvindelige reproduktive fænotyper afledt af uterin dysfunktion, giver denne metode en ny tilgang for at opdage, kvantificere og karakterisere tidlig implantation begivenheder i vivo. Denne roman anvendelse af 3-D HFUS billeddannelse demonstrerer evne til med held at opdage, visualisere og karakterisere embryo-implantation websteder i den tidlige murine graviditet i en ikke-invasiv måde. Teknologien tilbyder en betydelig forbedring over nuværende metoder, der er afhængige af afbrydelsen af graviditeter for grov væv og histopatologisk karakterisering. Her bruger vi en video og tekst format til at beskrive hvordan man med held udføre ultralyd af tidlige murine graviditet til at generere pålidelig og reproducerbar data med genopbygningen af den uterine form i mesh og solid 3D-billeder.
Introduction
Tilbagevendende tidlig graviditet tab er en af de mest almindelige komplikationer efter undfangelsen og rammer cirka 1% af par forsøger at blive gravide1,2. De underliggende mekanismer i tidlig graviditet tab er forskellige: fra iboende embryonale abnormiteter og maternel co-morbiditet defekter i endometrie modtagelighed1,3,4. På grund af deres genetiske sporbarhed, har musemodeller været bredt udnyttet for undersøgelser af tidlig embryo implantation og graviditet. Desuden, den korte svangerskabsuge tid musen og evnen til at udføre store undersøgelser har sikret den voksende nytte af mus i håndteringen af centrale kliniske spørgsmål i menneskelige forplantningsmedicin5. Som sagt, det store flertal af murine eksperimentelle design stadig kræve adskillige dæmninger til aflives på sekventiel svangerskabsuge dage at kvantificere og analysere implantation site placering, antal, størrelse og afstand mønstre under graviditet6, 7,8, derved udelukkes longitudinelle studier på samme dyr.
I klinikken er ultralyd en pålidelig og uvurderligt redskab til at overvåge menneskelige føtal levedygtighed og udvikling i en ikke-invasiv måde9,10,11. Mere nylig, høj frekvens ultralyd (HFUS) er begyndt at finde begrænset anvendelse i mus som en metode til overvågning af føtal levedygtighed og væksten under graviditeten12,13,14. De seneste teknologiske fremskridt i ultrasound imaging har tilladt anvendelsen af tre-dimensionelle (3-D) data for visuel genopbygning af dyrs organer og efterfølgende overvågning af patologier15,16, 17. Brug af denne avancerede imaging-teknologi har markant forbedret beføjelse til at opdage mindre volumen udsving, at reducere Inter animalske variabilitet og overvåge udviklingen af en patologi eller effekten af en terapeutisk intervention17. Mens den primære nytte af denne teknologi har været at overvåge malignitet progression i oncomouse modeller15,16, er 3-D HFUS billeddannelse først for nylig blevet brugt til at kvantificere og overvåge aktiv vækst af fosteret implantation og fostrets udvikling i mus livmoderen18.
Her, viser vi hvordan man udfører HFUS imaging for at fremstille 2D- og 3D-data for at generere rekonstruktioner af tidlige gravide mus livmoderen. Vi påvise nytten af denne nye metode til at opdage disse tidlige embryonale implantation begivenheder uden behov for graviditet opsigelse, giver forskerne til at indsamle data i en ikke-invasiv måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
disse undersøgelser blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr udgivet af National Institutes of Health og animalske protokoller godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Baylor College of Medicine under protokollen antal AN-4203.
1. forberedelse af den gravide mus for ultralyd
- timet parring
- sted dæmningen med en dokumenteret frugtbar mandlige mus overnight begyndelsen efter 1700. Adskille dam og mandlige ved 0700 timer (h), uanset hvis vaginal plug er til stede, at sikre nøjagtige datering af graviditeten.
Bemærk: Om morgenen efter parring er anset for 0,5 dag post coitum (d.p.c.).
- sted dæmningen med en dokumenteret frugtbar mandlige mus overnight begyndelsen efter 1700. Adskille dam og mandlige ved 0700 timer (h), uanset hvis vaginal plug er til stede, at sikre nøjagtige datering af graviditeten.
- Forberedelse til ultralyd
- opstille den gravide mus i en forseglet anæstesi induktion container.
- Adstadige med isofluran (2%) inhaleret anæstesi og ilt (1 L/min), indtil dyret mister den oprettende refleks (ca 1-2 min. afhængigt af størrelsen af musen) og spontane bevægelser er ikke observeret (udover respiration).
- Sted bedøvet mus i liggende stilling i næsen kegle med isofluran (2%) inhaleret anæstesi og ilt (1 L/min). Anvende oftalmologiske salve til dyret ' s øjne.
- Med en vatpind, anvende depilatory creme til hele underlivet, brystbenet til skeden, og lateral til flankerne.
- Tillade creme til at forblive i en periode på højst 3 min, og fjern derefter fløde og hår med væv. Sikre at alle hår er fjernet, så eventuelle resterende hår vil falde billedkvalitet.
2. Forberedelse af ultralyd fase
- aktivere transduceren.
- Tillægger transduceren 3D-motor fase motor fase.
- Stik til 3D motor ved at forbinde den 3D motor kabel til 3D-motor stikket på bagpanelet. Fastgør 3D motor systemet til monteringssystem ved hjælp af quick release stillingen på toppen til at forbinde til billedbehandling station, og quick release montere på bunden for at anbringe transducer klemmen.
- Tillægger transducer klemmen sonden.
3. Begynd Imaging den gravide mus
- sted musen liggende på overvågning-platformen. Musen løbende modtager isofluran bedøvelsesmiddel (mellem 1,5-2,5%) og ilt (1 L/min) via næsen kegle. Forsigtigt tape alle poter til puls overvågning puder på platformen.
- Gælder 1-2 mL af ultralyd transmission gel på maven.
- Ved hjælp af manuel motor scenen, Placer ultralydssonde på underlivet.
- Find blæren, som skal vises som en væskefyldt mørk cirkel bare cephalad til vaginal åbning.
- Når blæren er placeret, flytte sonden meget langsomt cephalad til at visualisere den gravid livmoder, som skal vises som en cylindrisk med rund områder på graviditet websteder. Dette kan beskrives som leder som perler på en kæde.
- Når den gravide uterus er identificeret, begynder 2D-imaging.
4. 2-D ultralyd Imaging (figur 1)
- når den gravide uterus er identificeret, begynder på webstedet graviditet tættest på blæren og langsomt og sekventielt flytte cephalad til at bestemme antallet og placeringen af graviditet websteder.
- Hvis nyrer, milt eller lever er visualiseret, flytte sonden tættere caudale (tættere på blæren) som brugeren gået alt for langt cephalad.
- Image de kontralaterale uterin horn på samme måde.
- Fryser billedet når ultralyd rammen er i midten af webstedet implantation/graviditet at gemme til senere analyse og målinger.
Bemærk: Det tager mindre end et sekund for billedet for at blive frosset og gemt til senere analyse. - Foranstaltning implantation afstand ved hjælp af hyperekkoisk decidualization reaktion som markør ved manuelt at klikke på den " foranstaltning " værktøj først, og derefter klikke på placeringen af et websted, implantation. Næste, træk markøren til næste implantation websted og klik for at trække en linje, at computeren automatisk vil rapportere dens afstand. Softwaren vil derefter rapportere, hvad manuel måling er. Dette trin er ikke edb, men afhængig af brugeren til at markere afstand mellem decidualized websteder ved at trække en linje mellem de decidualized steder, som programmet vil give en måling for.
- Måler implantation størrelse, svangerskabsuge sac størrelse og føtal pole størrelse.
5. Fostrets hjertefrekvens
NOTE: på 9,5 d.p.c., fostrets hjerteslag klart skal visualiseres.
- Samtidig med at sonden meget stadig, tænde pulse wave Doppler og Placer det over de synlige hjerteslag.
- Post hjerte hjerterytme svingningerne.
NOTE: Bortset fra hjertet, denne procedure kan også optage svingningerne i navlestrengen.
6. 3D-ultralyd erhvervelse
- efter den gravide uterus har blevet visualiseret på 2D-billeddannelse, position sonden i et område, der er i den omtrentlige midtpunkt den ønskede 3D-billede. For eksempel, hvis en imaging et æble i 3D, sonden i første omgang placeres hvor apple core er forudsagt til at være placeret (dvs. i midten af objektet).
- Med sonden i en position i midten af det ønskede billede, hente en 3D-erhvervelse. 3D-motor scenen vil rejse denne afstand på tværs af livmoderen i en række trin eller rammer, med den hensigt at indfange i helhed hvad investigator begærer.
- Bekræft at de tilsigtede strukturer helt er fanget i den 3D-scanning før du fuldfører delen real-time ultralyd. Gem denne 3D-om post-processing på et senere tidspunkt. Den samlede tid til 2D- og 3D-ultralyd erhvervelse er ca 10-20 minutter når udføres af en erfaren bruger.
7. 3D-rekonstitution post-processing (figur 2)
- indlæse de ønskede data til 3D-billedbehandling.
- Vælg " parallelle og roterende metoder ", som vil indlæse alle 3D-billedrammer i en 3-D " box " at brugeren derefter vil spore det ønskede objekt i frame-by-frame. Vælg trin størrelse 0,08 mL. Begynde i den ene ende af billedet blok og rulle gennem for at orientere om de billeder, der har været fanget i plads.
- Start i den ene ende af billedet og manuelt spore omridset af objektet.
- Rulle til næste 2-D billed skive eller " ramme " og manuelt spore omridset af objektet.
- Fortsætte denne proces, indtil alle rammer har været manuelt kommenteret/spores ved brugeren.
- Klik " slut " at få den 3-D billede og samlede beregninger.
- Vælg mellem mesh og solid overlay, der er en pil i det øverste venstre hjørne.
- Vælger at beholde eller fjerne de omkringliggende ultralyd billedoplysninger for klarhed. Hver 3D-genopbygning kan tage mellem 10 og 20 min.
8. Post proceduremæssige pleje
- når ultralyd er fuldført, slukke anæstesi gas, fjerne musen fra platformen og tør forsigtigt og vaske væk enhver ultralyd gel fra dyret.
- Placer musen tilbage i buret i en udsat position i en polstret område. Overvåge indtil dyret er vågen og bevægelse spontant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 1, kan høj frekvens ultralyd afsløre implantation site udvikling begynder så tidligt som 5,5 d.p.c tid. Brug den lettere hyperekkoisk giver decidualized endometriet som markør af implantation websteder på 6,5 d.p.c antallet af implantation websteder og afstanden mellem disse websteder til kvantificeres. Som graviditeten er skrider frem til 7,5 d.p.c. mørkere hypoechoic svangerskabsuge sac og føtal pole også let kan identificeres.
Som vist i figur 2, er udfyldte post-processing sammensætningen af den tre-dimensionelle genopbygning af livmoderen, mus købedygtig visualiseres. På 6,5 d.p.c, kan 3D-høj frekvens ultralyd sammensætning i både mesh og solid overlay formater bruges til at give en visuel afbildning. Et andet eksempel, viser denne gang på 7,5 d.p.c, det endelige sammensatte billede af en anden livmoderen med både mesh og solid overlay.
Figur 1: høj frekvens ultralyd påvisning af implantation site udvikling og overvågning af fosterets vækst i hele drægtighedsperioden. Som vist i figur 1A, på 5,5 d.p.c. den lettere hyperekkoisk tillader decidualized endometriet (D) antallet af implantation websteder og afstand til kvantificeres. Som vist i figur 1B, er decidualization lokaliteter (D) i en anden uterin horn følgeskab af den uterine horn (U). Af 7,5 d.p.c. er mørkere hypoechoic sac (GS) og fostrets pole (F) let identificerbare figur 1 c. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: de tre-dimensionelle genopbygning af livmoderen, mus i den tidlige graviditet. På 6,5 d.p.c, som vist i figur 2A, 3D-høj frekvens ultralyd i både mesh og solid overlay er formater vist. På 7,5 d.p.c, som vist i figur 2B, 3D-høj frekvens ultralyd billeder med både mesh og solid overlay er formater vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne roman anvendelse af 3-D HFUS billeddannelse demonstrerer evne til med held at opdage, visualisere og karakterisere embryo-implantation websteder i den tidlige murine graviditet i en ikke-invasiv måde. Teknologien tilbyder en betydelig forbedring over nuværende metoder, der er afhængige af afbrydelsen af graviditeter for grov væv og histopatologisk karakterisering. Dog skal det bemærkes, at histologiske metoder ville stadig blive betragtet som mere optimal når karakterisering på en mere forstørret og mere cellulære niveau ønskes, eller når gen- og protein analyse er påkrævet. Med et stigende antal nye musemodeller vise implantation defekter og tidlig graviditet tab19,20,21,22, evne til dette avancerede ultralyd teknik til at opdage tidligt graviditeter fra 5,5 d.p.c og fremefter giver klare fordele i forhold til tidligere ultralyd metoder, der var begrænset til registrering på midten graviditet12,13. Desuden, denne metode registrerer hjerte motion så snart hjertet begynder at slå, mellem 8,5-9,5 d.p.c23,24 giver mulighed for bekræftelse af levedygtige fostre. Evnen til at følge tidlige graviditet begivenheder i de samme dyr betyder færre dyr kræves pr. eksperiment og mere præcis analyse kan udføres med sådanne langsgående eksperimentelle design25,26, 27.
Det skal bemærkes, at de tre mest kritiske trin i protokollen er: (1) at kende den nøjagtige svangerskabsuge dag; (2) evnen af operatøren til at lokalisere livmoderen og placere sonden over den korrekte anatomiske websted; og (3) præcise teknikker til at producere en 3-D genopbygning. De følgende retningslinjer for fejlfinding har vist sig nyttige: når det er vanskeligt at lokalisere livmoderen på ultralyd, brugeren kan begynde med at sikre, at blæren identificeres først. Blæren er normalt ses som en sort cirkel, og er straks cephalad til vaginal åbning. Selv i mus, der har undergået vandladning umiddelbart før ultralyd, blæren er aldrig helt tom og dermed (i vores erfaring) kan være en pålidelig markør. Når blæren er identificeret, skal sonden være langsomt flyttet cephalad indtil livmoderen er set. Hvis blæren er små eller ikke kan visualiseres, kan brugeren også forsøge at visualisere livmoderen ved at starte på æggestokkene, som kan findes på flankerne, ringere til nyrerne. Brug denne systematisk fremgangsmåde, kan hver implantation websted og fostrets udvikling observeres, Figur1. Lejlighedsvis, kan det være vanskeligt at opnå det ønskede område af livmoderen under ultrasonografi på grund af den måde, hvorpå livmoderen er placeret i maven, som vist i figur 2 af forskellige former og positioner af livmoderen in vivo. Brugeren kan vippe mus platform flyet til at skifte eller justere livmoderen internt til en mere gunstig position, hvor den ønskede uterin region kan blive fanget af ultralyd. Endelig, brugeren kan bekræfte, at de ønskede uterin billeder blev fremstillet under ultrasonografi ved hurtigt rulle gennem de erhvervede ultralyd billeder snart efter ultralyd-session er afsluttet. En mindre begrænsning er, at 3D-mesh/solid overlay visuelle Genopbygningsagentur ikke kan udføres under ultralyd session. For at sikre, at ultralyd billeder at det er fremstillet, er nøjagtige, anbefales det, at som forskerne får færdigheder, dyrene er aflivet efter ultralyd for at korrelere nøjagtighed af ultralyd resultaterne til brutto væv modellen målinger og anatomi.
Mens vi beskrive her modellering af normal murine graviditet, vil fremtidige anvendelser af denne teknik blive anvendt for at kvantificere unormal tidlig graviditet begivenheder. HFUS og 3D-genopbygning vil tillade efterforskere at opdage og overvåge antallet, størrelsen og placeringen af graviditeter, som er unormal vækst og/eller udvikling. For eksempel, ikke-invasiv fænotypiske karakterisering af abnormiteter –dvs. defekte endometrie decidualization, afvigende embryo implantation distribution, og utilstrækkelig trophoblastic invasion og vækst — vises af en stigende antallet af gensplejsede mus kan nu analyseres på langs uden graviditet afbrydelse ved hjælp af denne billedbehandling metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi værdsætter i høj grad bistand fra Rong Zhao, Jie Li og Yan Ying.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
References
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
- Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
- Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
- Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
- Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897 (2015).
- Ding, Y. B., et al. 5-aza-2'-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364 (2012).
- Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
- Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
- Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
- Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38 (2014).
- Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
- Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97 (2015).
- Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
- Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
- Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312 (2017).
- Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
- Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500 (2012).
- Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171 (2016).
- Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
- Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
- Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
- Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).
