Summary
Souris sont largement utilisés pour étudier la biologie gestationnelle. Toutefois, une interruption de grossesse est requise pour ces études qui empêche les études longitudinales et nécessite l’utilisation d’un grand nombre d’animaux. Par conséquent, nous décrivons une technique non invasive d’échographie de haute fréquence pour une détection précoce et le suivi des événements après l’implantation chez la souris enceinte.
Abstract
Échographie de haute fréquence (HFUS) est une méthode courante de façon non invasive de suivre l’évolution en temps réel du fœtus humain dans l’utérus. La souris est couramment utilisée comme un modèle in vivo pour étudier l’implantation de l’embryon et de la progression de la grossesse. Malheureusement, ces études murins exigent des interruption de grossesse pour permettre l’analyse phénotypique suivi. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé des reconstruction tridimensionnelle (3d) de HFUS données de dépistage précoce et de caractérisation des sites d’implantation des embryons murins et leur progression du développement individuel in uterod’imagerie. Alliant modélisation et imagerie HFUS avec reconstruction 3D, nous avons pu précisément quantifier le nombre de site implantation embryonnaire mais aussi surveiller la progression du développement chez les souris gestantes de C57BL6J/129S de 5,5 jours post coït (d.p.c.) par l’intermédiaire de 9,5 d.p.c. à l’aide d’un transducteur. Mesures incluses : nombre, emplacement et le volume de sites d’implantation ainsi qu’espacement inter-implantation site ; viabilité de l’embryon a été évaluée par le suivi de l’activité cardiaque. Dans la période immédiate de l’après l’implantation (5,5 à 8,5 d.p.c.), reconstruction 3D de l’utérus gravide en maille et en superposition solide format activé une représentation visuelle des grossesses en développement au sein de chaque corne utérine. Comme les souris génétiquement modifiées continuent d’être utilisés pour caractériser les phénotypes de reproduction féminins dérivés de dysfonctions utérines, cette méthode propose une nouvelle approche pour détecter, quantifier et de caractériser l’implantation des événements anticipé en vivo. Cette nouvelle utilisation de l’imagerie 3D HFUS démontre la capacité de détecter avec succès, visualiser et caractériser les sites d’implantation embryonnaire en début de grossesse murin de façon non invasive. La technologie offre une amélioration significative par rapport aux méthodes actuelles, qui s’appuient sur l’interruption des grossesses tissu brut et caractérisation histopathologique. Ici, nous utilisons un format de vidéo et de texte pour décrire comment réaliser avec succès les échographies du début de la grossesse murin à produire des données fiables et reproductibles avec reconstruction de la forme utérine en résille et des images 3D solides.
Introduction
Perte de grossesse précoce récurrente est l’une des complications plus fréquentes après la conception et touche environ 1 % des couples qui essaient de concevoir1,2. Les mécanismes sous-jacents de la perte de grossesse précoce sont variées : des anomalies embryonnaires intrinsèques et comorbidités maternelles pour les vices de la réceptivité de l’endomètre1,3,4. En raison de leur traçabilité génétique, modèles de souris ont été largement utilisés pour les enquêtes de l’implantation d’embryon précoce et grossesse. En outre, le temps court de gestation de la souris et la possibilité d’effectuer des études à grande échelle ont assuré l’utilité croissante de la souris dans la lutte contre les principales questions cliniques en médecine de la reproduction humaine5. Cela dit, la grande majorité des protocoles expérimentaux murins nécessite encore de nombreux barrages à être euthanasiés sur jours de gestation séquentielles pour quantifier et analyser les emplacement de site d’implantation, nombre, la taille et l’espacement au cours de la grossesse6, 7,8, excluant ainsi des études longitudinales sur le même animal.
En clinique, l’échographie est un outil fiable et précieux pour contrôler la viabilité foetale humaine et le développement dans une manière non invasive9,10,11. Plus récemment, échographie de haute fréquence (HFUS) a commencé à trouver des applications limitées chez la souris comme une méthode de surveillance la viabilité fœtale et la croissance au cours de la grossesse12,13,14. Les récentes avancées technologiques en imagerie par ultrasons ont permis en trois dimensions (3d) de données pour visual reconstruction d’organes d’animaux et de suivi des pathologies15,16, 17. Utilisation de cette technologie d’imagerie avancée a considérablement amélioré la capacité de détecter les plus petites fluctuations de volume, afin de réduire les animaux et pour surveiller la progression d’une pathologie ou l’efficacité d’une intervention thérapeutique17. Tandis que l’utilité principale de cette technologie a été de suivre l’évolution de la tumeur maligne à l’oncosouris modèles15,16, imagerie 3-d de HFUS a récemment été utilisé pour doser et contrôler la croissance active de l’implantation de l’embryon et le développement du foetus dans l' utérus de souris18.
Ici, nous démontrons comment faire HFUS imaging pour produire des données 2D et 3D pour générer les reconstructions de l’utérus de souris enceinte au début. Nous démontrent l’utilité de cette nouvelle méthode pour détecter ces événements d’implantation embryonnaire précoce sans la nécessité d’une interruption de grossesse, permettant ainsi aux chercheurs de recueillir des données de manière non invasive.
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Protocol
ces études ont été menées conformément au Guide pour les soins et les Use of Laboratory Animals, publié par le National Institutes of Health et les animaux protocoles approuvés par le Comité de l’emploi (IACUC) et d’institutionnels animalier du Baylor College of Medicine en vertu du protocole numéro AN-4203.
1. préparation de la souris enceintes pour échographie
- Timed accouplement
- Place le barrage avec un mâle fertile éprouvé souris une nuit début après 1700. Séparez dam et mâle en 7 heures (h), sans se soucier si plug vaginal est présent, afin d’assurer une datation précise de la grossesse.
Remarque : Le matin après l’accouplement est considérée comme 0,5 jour post coitum (d.p.c.).
- Place le barrage avec un mâle fertile éprouvé souris une nuit début après 1700. Séparez dam et mâle en 7 heures (h), sans se soucier si plug vaginal est présent, afin d’assurer une datation précise de la grossesse.
- Préparation pour l’échographie
- Placer la souris enceinte dans un conteneur d’induction anesthésie scellé.
- Calme avec anesthésie isoflurane (2 %) par inhalation et d’oxygène (1 L/min) jusqu'à ce que l’animal perd le réflexe de redressement (environ 1-2 min selon la taille de la souris) et de mouvements spontanés ne sont pas respectées (en dehors de la respiration).
- Place sous sédation souris en décubitus dorsal dans le cône de nez à l’isoflurane (2 %) inhalé anesthésique et d’oxygène (1 L/min). Pommade ophtalmique à l’animal ' yeux de s.
- Avec un coton tige, appliquer la crème dépilatoire à abdomen entier, sternum au vagin et des latéraux pour les flancs.
- Permettent de rester pour une durée maximale de 3 min, la crème et puis retirez la crème et les cheveux avec le tissu. Assurez-vous que tous les cheveux sont supprimée, car les poils restants diminuera la qualité d’image.
2. Préparation de la phase de l’échographie
- tourner sur le transducteur.
- Joindre 3D moteur moteur platine platine au transducteur.
Moteur
- plug en 3D en branchant le câble du moteur 3D sur le connecteur du moteur 3D sur le panneau arrière. Fixez le système moteur 3D pour le système de fixation à l’aide du poste de dégagement rapide sur le dessus pour vous connecter à la station d’imagerie et le blocage rapide de monter sur le fond pour fixer la pince du transducteur.
- Fixer la sonde sur la pince de transducteur.
3. Begin Imaging la souris enceintes
- souris de Place couchée sur la plate-forme de surveillance. La souris reçoit en permanence des isoflurane anesthésique (entre 1,5 et 2,5 %) et l’oxygène (1 L/min) par l’intermédiaire de la coiffe. Ruban délicatement toutes les pattes aux coussinets sur la plate-forme de surveillance de la fréquence cardiaque.
- Appliquer 1 à 2 mL de gel de transmission ultrasonique sur abdomen.
- En utilisant le manuel moteur, positionner la sonde sur le bas de l’abdomen.
- Localiser la vessie, ce qui devrait apparaître comme un cercle sombre remplie de liquide juste céphalique à l’ouverture du vagin.
- Une fois que la vessie se situe, déplacer la sonde très lentement céphalique de visualiser l’utérus gravide, qui doit se présenter sous une forme cylindrique avec des zones rondes sur les sites de grossesse. Cela peut être décrit comme ressemblant à perles sur une chaîne de.
- Une fois que l’utérus gravide a été identifié, commencer l’imagerie 2D.
4. L’échographie 2D (Figure 1)
- une fois que l’utérus gravide a été identifié, commencer sur le site de grossesse plus proche de la vessie et lentement et de façon séquentielle déplacer céphalique déterminer le nombre et l’emplacement des sites de grossesse.
- Si le rein, la rate ou le foie est visualisée, repositionner la sonde plu caudal (proche de la vessie) que l’utilisateur est allé trop loin en direction céphalique.
- L’image de la corne utérine controlatérale de la même manière.
- Figer l’image lorsque l’image d’échographie est au centre du site implantation/grossesse à épargner pour plus tard les analyse et les mesures.
Remarque : Il faut moins d’une seconde pour l’image à être congelés et enregistré pour une analyse ultérieure. - Mesure de distance de l’implantation à l’aide de la réaction de décidualisation hyperéchogènes comme marqueur en cliquant manuellement sur le " mesure " outil tout d’abord et puis en cliquant sur l’emplacement d’un site d’implantation. Ensuite, faites glisser le curseur pour le prochain site d’implantation et cliquez pour tirer un trait que l’ordinateur signalera automatiquement sa distance. Le logiciel signalera alors quelle est la mesure manuelle. Cette étape n’est pas informatisée, mais repose sur l’utilisateur pour marquer la distance entre les sites decidualized en traçant une ligne entre les sites decidualized, dont le programme fournira une mesure dédiée
- Mesurer la taille d’implantation, taille sac gestationnel et pole foetaux.
5. Rythme cardiaque fœtal
Remarque : À 9,5 d.p.c., le battement de coeur foetal doit être clairement visualisé.
- Tout en gardant la sonde tout immobile, tourner sur la vague d’impulsion Doppler et placer cela sur la pulsation visible.
- Record le cardiaque coeur battre pulsations.
NOTE : En dehors du cœur, cette procédure peut également enregistrer des pulsations du cordon ombilical.
6. Acquisition d’échographie 3D
- après l’utérus gravide a été visualisée sur l’imagerie 2D, positionner la sonde dans une zone qui se trouve dans le point médian approximatif de l’image 3D souhaitée. Par exemple, si on était d’imagerie d’une pomme en 3-d, la sonde doit initialement être placée où le trognon de pomme est prédit être situé (c'est-à-dire au milieu de l’objet).
- Avec la sonde en position au milieu de l’image souhaitée, obtenir une acquisition 3D. Le stade moteur 3D se rendra cette distance à travers l’utérus dans une série d’étapes ou de cadres, dans le but de capturer en totalité ce que le chercheur désire.
- Confirmer que les structures prévues sont entièrement saisis dans la numérisation 3D avant la fin de la partie de l’échographie en temps réel. Enregistrer ces informations 3D pour le post-traitement à une date ultérieure. Le temps total d’acquisition de l’échographie 2D et 3D est environ 10-20 minutes lorsque exécuté par un utilisateur expérimenté.
7. Reconstitution 3D post-traitement (Figure 2)
- charger les données désirées pour le traitement de l’image 3-d.
- Choisir " Méthodes parallèles et rotationnels ", qui se chargera de tous les cadres d’image 3D en 3-un d " zone " que l’utilisateur tracera ensuite l’objet souhaité dans, image par image. Choisissez l’étape format 0,08 mL. Commencez à une extrémité du bloc image et faites défiler pour se familiariser avec les images qui ont été capturés au sein de l’espace.
- Start à une extrémité de l’image et la trace le contour de l’objet manuellement.
- Scroll à tranche 2D image suivante ou " cadre " et manuellement tracer le contour de l’objet.
- Continuez ce processus jusqu'à ce que tous les cadres ont été annotées/tracés manuellement par l’utilisateur.
- Cliquez " finition " pour obtenir l’image en 3D et des calculs de volume total.
- Choisir entre maille et superposition de solide, qui est une flèche dans le coin supérieur gauche.
- Choisir de conserver ou supprimer les informations d’image échographie environnantes pour plus de clarté. Chaque reconstruction 3D peut prendre entre 10 et 20 min.
8. Soins post procédure
- une fois l’échographie terminée, éteindre le gaz d’anesthésie, retirer la souris de la plate-forme et essuyer doucement et laver tout gel ultrasonique de l’animal.
- Remettre la souris dans la cage dans une position couchée dans une zone rembourrée. Surveiller jusqu'à ce que l’animal est éveillé et se déplaçant spontanément.
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Representative Results
Comme illustré à la Figure 1, l’échographie de haute fréquence peut détecter l’implantation site développement commence dès que le point de temps d.p.c 5,5. À l’aide du briquet hyperéchogènes decidualized endomètre comme marqueur de sites d’implantation à 6,5 d.p.c permet le nombre de sites d’implantation et de l’espacement de ces sites à être quantifié. Comme la grossesse progresse à 7,5 d.p.c., un sac gestationnel de plus sombre hypoéchogènes et pole foetal est également facilement identifiables.
Tel qu’illustré à la Figure 2, la composition remplie de post-traitement de la reconstruction tridimensionnelle de l’utérus de souris peut être visualisé. À 6.5 d.p.c, la composition de l’échographie 3D haute fréquence en maille et en formats de superposition solide peut être utilisée pour fournir une représentation visuelle. Un autre exemple, cette fois à 7,5 d.p.c, illustre l’image composite finale d’un autre utérus avec maille et superposition solide.
Figure 1 : détection de l’échographie haute fréquence de développement de sites d’implantation et le suivi de la croissance foetale pendant toute la gestation. Comme le montre la Figure 1 a, sur 5,5 d.p.c. le briquet hyperéchogènes decidualized endomètre (D) permet le nombre de sites d’implantation et de l’espacement à quantifier. Comme le montre la Figure 1 b, les sites de décidualisation (D) dans une autre corne utérine sont rejoints par la corne utérine (U). Par d.p.c. 7,5, la plus sombre hypoéchogènes sac (GS) et le pôle foetale (F) sont facilement identifiables Figure 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : la reconstruction tridimensionnelle de l’utérus de souris en début de grossesse. À 6.5 d.p.c, comme illustré à la Figure 2 a, échographie 3D haute fréquence en maille et en superposition solide formats sont présentés. À 7,5 d.p.c, comme illustré à la Figure 2 b, d’images échographiques 3D haute fréquence avec maille et superposition solide formats sont présentés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cette nouvelle utilisation de l’imagerie 3D HFUS démontre la capacité de détecter avec succès, visualiser et caractériser les sites d’implantation embryonnaire en début de grossesse murin de façon non invasive. La technologie offre une amélioration significative par rapport aux méthodes actuelles, qui s’appuient sur l’interruption des grossesses tissu brut et caractérisation histopathologique. Il convient toutefois de noter que des méthodes histologiques seront toujours considérées plus optimale lorsque la caractérisation au niveau plus agrandie et plus cellulaire est souhaitée, ou lorsqu’il est nécessaire d’analyse génique et protéique. Avec un nombre croissant de nouveaux modèles de souris, affichage des défauts d’implantation et début grossesse perte19,20,21,22, la capacité de cette avancée technique de l’échographie pour détecter tôt grossesses de 5,5 d.p.c partir offre des avantages évidents par rapport aux méthodes échographie antérieure qui se limitaient à détection à mi-grossesse12,,13. En outre, cette méthode détecte un mouvement cardiaque dès que le coeur commence à battre, entre 8,5 et 9,5 d.p.c23,24 , permettant la confirmation des foetus viables. La capacité de suivre des événements précoces de la grossesse chez le même animal signifie moins d’animaux sont tenus par l’expérience et une analyse plus précise peut être réalisée avec ces conceptions expérimentales longitudinales25,26, 27.
Il est à noter que les trois étapes les plus critiques dans le protocole sont : (1) connaître le jour exact de gestation ; (2) la capacité de l’opérateur pour localiser l’utérus et de placer la sonde sur le site anatomique correct ; et (3) techniques précis pour produire une reconstruction 3D. Les instructions de dépannage suivantes se sont avérés utiles : lorsqu’il est difficile de localiser l’utérus à l’échographie, l’utilisateur peut démarrer en veillant à ce que la vessie est tout d’abord identifiée. La vessie est habituellement considérée comme un cercle noir et est immédiatement céphalique de l’orifice vaginal. Même chez les souris ayant subi la miction immédiatement avant l’échographie, la vessie n’est jamais complètement vide et donc (d’après notre expérience) peut être un marqueur fiable. Une fois que la vessie est identifiée, la sonde doit être lentement déplacée céphalique jusqu'à ce que l’utérus est vu. Si la vessie est petite ou ne peuvent pas être visualisés, l’utilisateur peut également essayer de visualiser l’utérus en commençant par l’ovaire, qui se trouvent sur les flancs, inférieurs au rein. En utilisant cette approche systématique, chaque site d’implantation et le développement foetal peuvent être observée, comme dans la Figure 1. À l’occasion, il peut être difficile d’obtenir la région souhaitée de l’utérus au cours de l’échographie en raison de la manière dont l’utérus est placé dans l’abdomen, comme illustré à la Figure 2 par différentes formes et positions de l’utérus in vivo. L’utilisateur peut incliner le plan de plate-forme de souris pour déplacer ou réaligner l’utérus en interne à une position plus favorable dans lequel la région utérine souhaitée peut être capturée par échographie. Enfin, l’utilisateur peut confirmer que les images désirées utérines ont été obtenus au cours de l’échographie en faisant défiler rapidement à travers les images d’échographie acquis peu de temps après que la session de l’échographie est terminée. Une limitation mineure, c’est que la superposition de maillage 3D/solide pour la reconstruction visuelle ne peut être effectuée au cours de la session de l’échographie. Pour s’assurer que les images d’échographie étant obtenus sont exacts, il est recommandé que, comme les chercheurs gagnent la compétence, les animaux sont euthanasiés après échographie afin de corréler l’exactitude des conclusions échographie au spécimen de tissu brut les mesures et l’anatomie.
Alors que nous décrivons ici la modélisation d’une grossesse normale murine, futures applications de cette technique s’appliquera afin de quantifier les événements anormaux de grossesse précoce. HFUS et reconstruction 3D permettra aux enquêteurs de détecter et surveiller le nombre, la taille et l’emplacement grossesses qui sont anormaux dans la croissance ou de développement. Par exemple, la caractérisation phénotypique non invasif des anomalies —c'est-à-dire défectueux décidualisation endométriale, distribution d’implantation embryonnaire aberrants et invasion trophoblastique inadéquate et la croissance — affiche de plus en plus nombre de souris génétiquement modifiées peut maintenant être analysée longitudinalement sans interruption de la grossesse en utilisant cette méthode d’imagerie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous apprécions grandement l’aide de Rong Zhao et Jie Li Yan Ying.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
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