Summary
마우스 널리 임신 생물학을 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 임신 종료는 이러한 연구는 경도 조사 하는 걸로 하 고 동물의 큰 숫자의 사용을 필요로 필요 합니다. 따라서 조기 발견에 대 한 높은 주파수 초음파의 비-침략 적 기법 및 임신 마우스에서 후 이식 이벤트 모니터링 설명 합니다.
Abstract
높은 주파수 초음파 (HFUS) 비 접촉 utero에인간 태아의 실시간 개발을 모니터링 하는 일반적인 방법입니다. 마우스 배아 착상과 임신 진행을 vivo에서 모델 정기적으로 사용 됩니다. 불행히도, 이러한 murine 연구 후속 phenotypic 분석을 임신 중단을 요구. 이 문제를 해결 하려면 우리는 HFUS 조기 발견 및 murine 배아 이식 사이트 및 그들의 개인적인 발달 진행 utero의 특성화에 대 한 데이터를 이미징의 3 차원 (3 차원) 재구성을 사용 합니다. 3 차원 개조와 HFUS 이미징 및 모델링을 결합 수 있었습니다 정확 하 게 계량 배아 이식 사이트 번호로 9.5 d.p.c. 통해 5.5 일 포스트 성교 (d.p.c.)에서 임신 C57BL6J/129S 마우스에 발달 진행 모니터링 와 변환기의 사용. 포함 하는 측정: 번호, 위치, 및 간 이식 사이트 간격; 이식 사이트의 볼륨 태아 생존 능력은 심장 활동을 모니터링 하 여 평가 했다. 즉시 포스트 주입 기간 (5.5 8.5 d.p.c.), 메쉬 및 고체 오버레이 벗 자 궁의 3 차원 재구성 형식 각 자 궁 경적 내 개발 임신의 시각적 표현을 사용할 수 있습니다. 유전자 조작된 생쥐 여성 생식 고기 자 궁 기능 장애에서 파생 하는 데 사용할 계속,이 방법은 검색 하 고, 계량, 초기 이식 이벤트에서 vivo에서성격에 새로운 접근 방식을 제공 합니다. 3 차원 HFUS 이미징의 소설의 사용이 성공적으로 감지, 시각화, 및 비-침략 적 방법으로 배아 이식 사이트 murine 임신 초기 동안 특성의 수를 보여 줍니다. 기술 총 조직 및 조직 특성에 대 한 임신의 중단에 의존 하는 현재의 방법에 비해 상당한 개선을 제공 합니다. 여기 비디오와 텍스트 형식을 사용 하 여 성공적으로 메쉬 및 고체 3 차원 이미지에서 재건의 자 궁 형태와 안정적이 고 재현 가능한 데이터를 생성 하는 murine 임신 초기의 초음파를 수행 하는 방법을 설명 하.
Introduction
재발 이른 임신 손실 하나 가장 일반적인 합병증의 임신 후 이며1,2임신을 하려고 하는 커플의 약 1%에 영향을 미칩니다. 이른 임신 손실의 기본 메커니즘 변화 된다: 내장 배아 이상 및 모성 comorbidities 자궁내 막 감수1,,34에 결함에서. 그들의 유전 추적성 때문에 마우스 모델 초기 배아 이식 및 임신의 수사를 위해 널리 이용 되어 있다. 또한, 마우스와 대규모 연구를 수행 하는 능력의 짧은 임신 시간 인간의 생식 의학5핵심 임상 질문 해결에 마우스의 성장 유틸리티를 보장입니다. 즉, murine 실험적인 디자인의 대다수 여전히 요구 순차적 임신 일 임신6, 동안 주입 사이트 위치, 번호, 크기 및 간격 패턴을 분석 하 고 계량 하에 안락사를 수많은 댐 7,8, 따라서 제외 같은 동물에 대 한 경도 연구.
병원에서 초음파는 인간의 태아 생존 능력 및 비-침략 적 방식으로9,,1011개발 모니터링 하 고 귀중 한 도구 이다. 더 최근에, 높은-주파수 초음파 (HFUS) 태아 생존 능력 및 임신12,,1314동안 모니터링을 위한 방법으로 마우스에 제한 된 응용 프로그램을 찾을 시작 했다. 초음파 영상에서 최근의 기술 진보는 동물 장기의 시각적 재구성 및 pathologies15,16의 후속 모니터링에 대 한 3 차원 (3 차원) 데이터의 응용 프로그램을 허용 했 17. 이 고급 이미징 기술의 사용은 현저 하 게 작은 볼륨 변동을 줄이고 간 동물 다양성, 모니터는 병의 진행 이나 치료 적 개입17의 효능을 검색 하는 힘을 향상 시켰다. 이 기술의 기본 유틸리티 oncomouse 모델15,16암 진행 모니터링 하고있다, 반면 3 차원 HFUS 이미징 최근에 quantitate 배아 이식의 활성 증가 모니터링 하 사용 되었습니다. 그리고18의 마우스 자 궁 태아의 개발.
여기, HFUS 2 차원 및 3 차원 데이터를 생성 이미징 생성 초기 임신 마우스 자 궁의 개조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 비-침략 적 방식으로 데이터를 수집 하는 연구를 수 있도록이 소설 방법 임신 종료 하지 않고도 이러한 초기 배아 이식 이벤트 감지의 유틸리티를 설명 합니다.
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Protocol
이러한 연구 관리 및 사용의 실험실 동물 건강의 국가 학회에 의해 출판 및 동물 프로토콜 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 대 한 가이드에 따라 실시 했다 베일 러 의과대학 프로토콜의 번호는-4203.
1. 초음파 임신 마우스의 준비
1700 후- 장소 입증 된 비옥한 남성으로 댐 짝짓기 타임
- 마우스 하룻밤 시작. 별도 댐 및 남성 0700 시간 (h)에 관계 없이 있으면 질 플러그, 임신의 정확한 데이트 되도록.
참고: 0.5 일 것으로 간주 됩니다 짝짓기 후 아침 게시물 coitum (d.p.c.). - 초음파에 대 한 준비
- 봉인된 마 취 유도 컨테이너에 임신 마우스를 놓습니다.
- Isoflurane (2%) 흡입 마 취 제 및 산소 (1 L/min) 동물 잃는다 righting 반사 (약 1-2 분 크기에 따라 마우스의)와 자발적인 움직임 (호흡) 외에 나타나지 않으면 때까지 Sedate.
- 장소 진정 마우스 원뿔 isoflurane (2%)와 흡입 마 취 제 및 산소 (1 L/min)에서 부정사의 위치에서. 동물 안과 연 고를 적용 ' s 눈.
- , 면봉으로 전체 복 부, 질, 하 흉 골을 depilatory 크림을 적용 하 고 측면에 측면.
- 크림 최대 3 분 동안 유지 하 고 크림와 조직으로 머리 제거. 모든 머리 제거 되도록 모든 나머지 머리 이미지 품질 저하 됩니다 있으므로.
2. 초음파 무대의 준비
- 변환기 설정.
- 변환기에 연결할 3 차원 모터 단계 모터 단계.
3D 모터 커넥터 후면 패널에 3D 모터 케이블을 연결 하 여
- 3D로 플러그 모터. 3D 모터 시스템 이미징 역에 연결 하는 상단에 빠른 릴리스 게시물을 사용 하 여 장착 시스템에 연결 및 변환기 클램프 부착 하 하단에 빠른 릴리스.
- 변환기 클램프 프로브 연결.
3. 임신 마우스 이미징 시작
- 장소 마우스 모니터링 플랫폼에 부정사. 마우스 지속적으로 받는 isoflurane 마 취 (사이 1.5-2.5%)와 산소 (1 L/min) 코 콘을 통해. 부드럽게 심장 박동 모니터링 플랫폼에 패드를 모든 발 테이프.
- 복 부에 초음파 전송 젤의 1-2 mL를 적용.
- 더 낮은 복 부에 초음파 프로브 위치 수동 모터 단계를 사용 하 여.
- 질을 그냥 cephalad 액체가 채워진 어두운 원형으로 나타납니다 방광을 찾습니다.
- 일단 방광이 위치, 이동 조사 매우 느리게 cephalad 임신 사이트에서 둥근 분야와 원통형 모양으로 나타납니다 임신 자 궁을 시각화. 이 체인에 진주 처럼 보이는으로 기술 될 수 있다.
- 임신 자 궁을 확인 한 시작 2 차원 이미징.
4. 2 차원 초음파 영상 (그림 1)
- 임신 자 궁을 확인 한 방광에 가까운 임신 사이트에서 시작 하 고 천천히 그리고 순차적으로 이동 cephalad 수와 임신 사이트의 위치를 결정.
- 신장, 비장, 또는 간 시각는 경우 프로브 위치 가까이 꼬리 (가까이 방광) 사용자 cephalad 너무 멀리 간.
- Contralateral 자 궁 경적 같은 방식으로 이미지.
- 고정 이미지 초음파 프레임 나중 분석 및 측정 하기 주입/임신 사이트의 중심에 있을 때.
참고: 냉동 하 여 나중에 분석을 위해 저장 된 이미지에 대 한 1 초 미만의 걸립니다. - 측정 이식 거리에 수동으로 클릭 하 여 hyperechoic decidualization 반응 마커로 사용 하는 " 측정 " 도구를 먼저, 그리고 하나의 이식 사이트의 위치에 클릭. 다음, 다음 이식 사이트를 컴퓨터 것입니다 자동으로 거리를 보고 선 그리기를 클릭 하 여 커서를 끌어. 소프트웨어 다음 수동 측정은 보고 합니다. 이 단계는 전산화 하지 하지만 프로그램 측정 대 한을 제공 합니다 decidualized 사이트 사이의 선을 그려 decidualized 사이트 사이의 거리를 표시 하는 사용자에 의존
- 이식 크기, 임신 낭 크기 및 태아 극 크기 측정.
5. 태아 심장 박동
참고: 9.5 d.p.c.에서 태아 심장 박동 한다 명확 하 게 시각화.
- 프로브를 매우 여전히 유지 하면서 펄스 파 도플러에 설정 하 고 보이는 심장 박동이 놓고.
- 레코드는 심장 심장 박동 pulsations.
참고: 심장은 그렇다 하 고이 절차 또한 기록할 수 pulsations 탯.
6. 3 차원 초음파 수집
- 임신 자 궁에 2 차원 영상 시각 되었습니다 후 원하는 3 차원 이미지의 대략 중간 지점에 있는 지역에 프로브를 위치. 예를 들어 3 차원에서 사과 이미징 했다 하나, 경우 프로브 처음 배치 해야 어디 애플 코어 (즉, 개체의 중간)를 찾을 수 전망 이다.
- 이미지의 중간에 원하는 위치에서 프로브와 3 차원 획득 얻을. 3 차원 모터 단계는 일련의 단계 또는 프레임에 자 궁이이 거리 여행 것입니다, 전체에서 캡처는 의도로 어떤 탐정 욕망.
- 의도 구조 실시간 초음파 부분을 완료 하기 전에 3 차원 스캔에 캡처됩니다 완전히 확인. 나중에 후 처리에 대 한 3 차원 정보를 저장 합니다. 2 차원 및 3 차원 초음파 수집에 대 한 총 시간은 약 10 ~ 20 분 숙련된 된 사용자에 의해 수행 될 때.
7. 3 차원 재구성 후 처리 (그림 2)
- 3 차원 이미지 처리에 대 한 원하는 데이터 로드.
- 선택 " 병렬 및 회전 메서드 "는 하나의 3 차원으로 모든 3D 이미지 프레임을 로드 합니다 " 상자 " 사용자 다음 프레임으로 프레임에 원하는 개체를 추적 한다. 단계 선택 0.08 mL 크기. 이미지 블록의 한쪽 끝에서 시작 하 고 공간 내에서 캡처한 이미지를 스크롤할.
- 이미지와 수동으로 추적 개체의 개요의 한쪽 끝에서 시작.
- 다음 2 차원 이미지 슬라이스를 스크롤 또는 " 프레임 " 수동으로 추적 개체의 개요.
- 모든 프레임 수동으로 주석/추적 사용자 되었습니다 때까지이 과정을 계속.
- 클릭 " 완료 " 3 차원 이미지 및 전체 볼륨 계산.
- 메쉬 및 고체 중첩, 왼쪽된 상단 모서리에 있는 화살표는 사이 선택.
- 유지 하거나 선명도 대 한 주변 초음파 이미지 정보를 제거 하려면 선택 합니다. 각 3 차원 재구성 10 그리고 20 분 사이 걸릴 수 있습니다
8. 포스트 절차적 케어
- 초음파 완료 되 면 마 취 가스를 해제, 플랫폼에서 마우스를 제거 하 고 부드럽게 닦 고 동물에서 어떤 초음파 젤을 씻어.
- 패딩된 영역 내에서 발생 하기 쉬운 위치에 장에 다시 마우스를 놓습니다. 때까지 동물 깨어 이동 자발적 모니터링.
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Representative Results
그림 1에서처럼 높은 주파수 초음파 이식 사이트 개발 시작 초기 5.5 d.p.c 시간 지점으로 검색할 수 있습니다. 밝은 hyperechoic를 사용 하 여 decidualized endometrium 6.5 d.p.c에서 이식 사이트의 표식으로 이식 사이트 및 이러한 사이트를 측정할 수의 간격의 수가 있습니다. 임신으로 7.5 d.p.c., 어두운 hypoechoic 임신 낭 및 태아 극 진행 쉽게 식별할 수 있습니다.
그림 2에서처럼 마우스 자 궁의 3 차원 재구성의 완료 후 처리 구성 구상 될 수 있다. 6.5 d.p.c에서 메쉬 형식과 고체 오버레이 3 차원 고주파 초음파 구성 시각적 묘사를 제공 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또 다른 예로, 7.5 d.p.c에서이 이번 메쉬와 고체 오버레이 다른 자 궁의 최종 합성 이미지를 보여 줍니다.
그림 1: 주입 사이트 개발 및 임신 기간 내내 태아 성장의 모니터링의 높은 주파수 초음파 탐지. 그림 1A같이 5.5 d.p.c. 라이터 hyperechoic에 decidualized endometrium (D) 이식 사이트 수를 측정할 수 있습니다. 그림 1B같이 다른 자 궁 경적에 decidualization 사이트 (D) 자 궁 경적 (U)에 의해 결합 됩니다. 7.5 d.p.c., 어두운 hypoechoic sac (GS) 및 태아 극 (F) 그림 1C쉽게 식별할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 임신 초기 동안 마우스 자 궁의 3 차원 재구성. 6.5 d.p.c에서 같이 그림 2A, 3 차원 고주파 초음파 메쉬에 단단한 오버레이 형식 표시 됩니다. 7.5 d.p.c에서 같이 그림 2B, 3 차원 고주파 초음파 이미지 메쉬와 고체 오버레이 형식 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
3 차원 HFUS 이미징의 소설의 사용이 성공적으로 감지, 시각화, 및 비-침략 적 방법으로 배아 이식 사이트 murine 임신 초기 동안 특성의 수를 보여 줍니다. 기술 총 조직 및 조직 특성에 대 한 임신의 중단에 의존 하는 현재의 방법에 비해 상당한 개선을 제공 합니다. 그러나 그 조직학 방법 아직도 간주 됩니다 더 최적의 특성 더 확대 하 고 더 많은 세포 수준에서 원하는 때 또는 때 유전자와 단백질 분석은 필요 주목 한다. 주입 결함 및 이른 임신 손실19,20,,2122표시 하는 새로운 마우스 모델의 증가 함께 능력 고급 초음파 기술을 조기 발견 5.5 d.p.c 이후부터 임신 중 임신12,13에서 검출에 국한 되었던 이전 초음파 방법에 비해 명확한 이점이 있습니다. 또한,이 방법은 즉시 8.5-9.5 d.p.c23,24 가능한 태아의 확인에 대 한 허용 사이 려 시작 하는 마음으로 심장 모션을 감지 합니다. 초기 임신 이벤트 같은 동물에 따라 능력 의미 적은 동물 실험 당 필요 하 고 같은 경도 실험 디자인25,26, 더 정확한 분석을 수행할 수 있습니다 27.
그것은 프로토콜에서 세 가지 가장 중요 한 단계는 주목 한다: (1) 알고 정확한 임신 주; (2) 자 궁을 찾아서 정확한 해 부 사이트; 프로브를 놓고 연산자의 기능 그리고 (3) 정확한 기술을 3 차원 재구성을 생산. 다음 문제 해결 지침 도움이 입증 된: 초음파에서 자 궁을 찾을 수 어렵습니다, 사용자는 방광 먼저 식별 함으로써 시작할 수 있습니다. 방광은 보통 검은 원으로 볼 그리고 즉시 cephalad 질. 초음파 직전 방 받은 쥐에도 방광이 완전히 비어 적 하 고 따라서 (경험)에서 신뢰할 수 있는 표시 될 수 있습니다. 방광을 확인 한 조사 해야 천천히 이동 cephalad 자 궁을 볼 때까지. 방광 작은 또는 수 수 없는 경우 사용자 또한 신장에 열 등 측면에서 찾을 수 있습니다 난소에서 시작 하 여 자 궁을 시각화를 시도할 수 있습니다. 이 체계적인 접근을 사용 하 여 각 이식 사이트 및 태아 개발 볼 수 있습니다, 그림 1과 같이. 때때로, 그것은 그림 2 에서처럼 다른 모양 및 자 궁의 위치에 의해 vivo에서 자 궁 복 부에 배치 하는 방식으로 인해 초음파 하는 동안 자 궁의 원하는 영역을 얻으려면 어려울 수 있습니다. 사용자는 마우스 플랫폼 평면 이동 또는 자 궁 초음파에 의해 원하는 자 궁 지역 수 있습니다 캡처 더 유리한 위치로 내부적으로 재편성을 기울일 수 있습니다. 마지막으로, 사용자는 신속 하 게 초음파 세션이 완료 된 후에 곧 인수 초음파 이미지를 스크롤 하 여 원하는 이미지를 자 궁 초음파 동안 얻은 했다 확인할 수 있습니다. 작은 한계가 이다 초음파 세션 동안 시각적 재구성에 대 한 3 차원 메쉬/솔리드 오버레이 수행할 수 없습니다. 초음파 이미지 획득 되 고 정확 하도록 좋습니다는 연구 능력을 얻고 있다로 동물은 안락사 초음파 후 총 조직 표본에 초음파 결과의 정확도 연결 하려면 측정 그리고 해부학입니다.
여기 정상 murine 임신의 모델링 설명, 하는 동안이 기술의 미래 응용 프로그램 계량 비정상적인 초기 임신 이벤트에 적용 됩니다. HFUS와 3 차원 재구성 감지 하 고 수, 크기 및 위치는 성장 및 개발에 비정상적인 임신의 모니터링 조사 허용 됩니다. 이상의 예를 들어, 비-침략 적 phenotypic 특성-즉, 결함이 자궁내 막 decidualization, 탈 선 배아 이식 분포, 그리고 불 충 분 한 trophoblastic 침공과 성장-증가 의해 표시 유전자 조작된 쥐 수 이미징이 방법론을 사용 하 여 임신 중단 없이 경도 분석 수 있습니다 지금.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 아주 많이 룽 자오, Jie Li 및 연 잉의 도움 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
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