Summary
Мышей широко используются для изучения гестационного биологии. Однако прерывание беременности является обязательным для таких исследований, которые исключает продольных исследований и требует использования большого количества животных. Таким образом мы описываем, неинвазивная методика высокочастотный ультразвук для раннего обнаружения и мониторинга событий после имплантации в беременных мыши.
Abstract
ВЧ-ультразвуковое исследование (HFUS) является распространенным методом неинвазивно следить в реальном времени развития человеческого плода в утробе матери. Мышь обычно используется в качестве модели в естественных условиях для изучения имплантации эмбриона и прогрессирования беременности. К сожалению такие мышиных исследования требуют прерывания беременности для последующей фенотипического анализа. Для решения этой проблемы, мы использовали трехмерной (3-D) реконструкция HFUS визуализации данных для раннего обнаружения и определения характеристик мышиных эмбриона имплантации сайтов и их индивидуального развития прогрессии в утробе матери. Сочетание HFUS изображений с трехмерной реконструкции и моделирования, мы смогли точно определить номер сайта имплантации эмбриона, а также следить за динамикой развития беременных мышей C57BL6J/129S от 5.5 дней поста коитус (d.p.c.) через 9,5 d.p.c. с использованием датчика. Замеры включали: количество, местоположение и объем имплантации сайты, а также интервал между имплантации сайта; жизнеспособность эмбриона оценивалась путем мониторинга сердечной деятельности. В период сразу после имплантации (5,5 до 8,5 d.p.c.), 3-D реконструкции беременных матки в сетку и твердых оверлея формат включен визуальное представление развивающейся беременности в течение каждого рога матки. Как генетически модифицированные мыши по-прежнему использоваться для характеристики женского репродуктивного фенотипов, производный от матки дисфункции, этот метод предлагает новый подход для выявления, количественной оценки и характеризуют начала имплантация события в естественных условиях. Этот роман использования трехмерных изображений HFUS демонстрирует способность успешно обнаруживать, визуализировать и характеризуют места имплантации эмбриона на ранних сроках беременности мышиных неинвазивным способом. Технология предлагает значительное улучшение нынешних методов, которые полагаются на прерывание беременности для грубых тканей и гистопатологические характеристика. Здесь мы используем формат видео и текст для описания как успешно выполнять УЗИ беременности мышиных для создания надежных и воспроизводимых данных с реконструкции матки формы в сетку и твердых 3-D изображения.
Introduction
Рецидивирующий ранняя потеря беременности является одним из наиболее распространенных осложнений после зачатия и затрагивает приблизительно 1% пар пытается забеременеть1,2. Основных механизмов ранней беременности потери различны: от встроенных эмбриональных отклонений и материнской сопутствующих заболеваний, дефектов в эндометрия восприимчивость1,3,4. Из-за их генетических уступчивость мыши модели широко использовались для исследования ранних имплантации эмбриона и беременности. Кроме того короткое время гестационного мыши и способности выполнять крупномасштабные исследования обеспечили растущей полезности мыши в решении ключевых вопросов клинической в репродуктивной медицине5. Впрочем, подавляющее большинство из мышиных экспериментальные проекты по-прежнему требуют многочисленные плотины, чтобы быть euthanized на последовательных дней гестационного для количественной оценки и анализа имплантации место, число, размер и интервал шаблоны во время беременности6, 7,8, тем самым исключая продольных исследований на то же самое животное.
В клинике ультразвук является надежным и бесценным инструментом для мониторинга человеческого плода жизнеспособность и развитие в неинвазивным способом9,10,11. Совсем недавно высокочастотный ультразвук (HFUS) начал найти ограниченное применение в мыши как метод для мониторинга плода жизнеспособность и рост во время беременности12,,1314. Последние технологические достижения в УЗИ позволили применение трехмерной (3-D) данных для визуального реконструкции органы животных и последующего мониторинга патологий15,16, 17. Использование этой передовой технологии обработки изображений заметно улучшилась мощностью, чтобы обнаружить меньший объем колебания, чтобы снизить изменчивость между животных и контролировать прогрессирование патологии или эффективность терапевтического вмешательства17. Хотя основная полезность этой технологии для мониторинга прогрессии злокачественных новообразований в онкомышь модели15,16, 3-D визуализации HFUS лишь недавно был использован чтобы quantitate и контролировать активный рост имплантации эмбриона и развитие плода в матке мыши18.
Здесь мы продемонстрируем для выполнения HFUS изображений для производства 2-D и 3-D данных для создания реконструкций раннего матки беременной мыши. Мы продемонстрировать полезность этого романа метода для выявления этих ранних эмбриональных имплантации событий без необходимости прерывания беременности, что позволяет исследователям для сбора данных в неинвазивным способом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
эти исследования были проведены в соответствии с руководство по уходу и использования лабораторных животных, опубликованных национальных институтов здравоохранения и животных протоколов, одобренных институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в колледж Бейлор по протоколу номер-4203.
1. подготовка беременных мыши для УЗИ
- , приуроченная спаривания
- место плотины с проверенным плодородные мужчин мыши ночи начала после 1700. Плотины и разных мужчин, 07 ч (h), независимо если присутствует Вагинальные вилка, для обеспечения точной датировки беременности.
Примечание: На следующее утро после спаривания считается день 0,5 должности coitum (d.p.c.).
- место плотины с проверенным плодородные мужчин мыши ночи начала после 1700. Плотины и разных мужчин, 07 ч (h), независимо если присутствует Вагинальные вилка, для обеспечения точной датировки беременности.
- Подготовка к УЗИ
- место беременной мышь в контейнере индукции запечатанном анестезии.
- Sedate с изофлюрановая (2%) вдыхании анестетика и кислорода (1 Л/мин) до тех пор, пока животное теряет восстанавливающих рефлекс (примерно 1-2 мин в зависимости от размера мыши) и спонтанного движения не наблюдается (кроме дыхания).
- Место седативных мышь в лежачем положении в носовой конус с изофлюрановая (2%) вдыхании анестетика и кислорода (1 Л/мин). Применить глазная мазь для животного ' глаза ф.
- С ватным тампоном, применять депиляционный крем весь живот, грудины влагалище и боковые фланги.
- Позволяют крем оставаться для максимум 3 мин, а затем удалить крем и волос с ткани. Убедитесь, что удалены все волосы, как любые оставшиеся волосы будет снижение качества изображения.
2. Подготовка этапа УЗИ
- включите преобразователя.
- Придают 3-D мотор стадия мотор стадия преобразователя.
Мотор
- вилку в 3D, подключив 3D мотор кабель к разъему 3D мотор на задней панели. Прикрепить 3D двигательной системы для монтажа системы, используя быстрый релиз пост на вершине для подключения к изображений станции и быстрого выпуска смонтировать на дно, чтобы прикрепить зажим датчика.
- Прикрепить зонд для датчика зажим.
3. начало Imaging беременных мыши
- место мыши лежа на платформу мониторинга. Мышь постоянно получает изофлюрановая анестезии (между 1,5-2,5%) и кислорода (1 Л/мин) через носовой конус. Осторожно лента все лапы для сердечного ритма, мониторинг колодки на платформе.
- Применяют 1-2 мл геля передачи ультразвука на животе.
- Стадии ручной мотор, поместите ультразвуковой зонд на нижней части живота.
- Найти мочевого пузыря, который должен появиться как заполненные жидкостью темный круг просто краниально к вагинальный открытия.
- После мочевого пузыря находится, зонд очень медленно двигайте краниально визуализировать беременной матки, который должен отображаться как цилиндрической формы с круглой областях на участках беременности. Это можно охарактеризовать как глядя, как жемчуг на цепочке.
- После того, как была обнаружена беременной матки, начать 2-D изображений.
4. 2-D УЗИ (рис. 1)
- после того, как была обнаружена беременной матки, начать на сайте беременности, ближе всего к мочевого пузыря и медленно и последовательно двигаться краниально определить количество и расположение сайтов беременности.
- Если визуализируются почки, селезенки или печени, изменить положение зонда ближе хвостового (ближе к мочевого пузыря) как пользователь пошел слишком далеко краниально.
- Изображение контралатеральной рога матки таким же образом.
- Заморозить изображение при УЗИ фрейм находится в центре сайта имплантации/беременность сохранять для последующего анализа и измерения.
Примечание: Он занимает менее одной секунды для изображения быть заморожены и сохранять для последующего анализа. - Мера имплантации расстояние с помощью реакции decidualization гиперэхогенные как маркер вручную нажатием на " меры " первый инструмент, а затем нажав на месте одного сайта имплантации. Затем перетащите курсор в следующий сайт имплантации и нажмите, чтобы рисовать линии, что компьютер будет автоматически сообщать его расстояние. Программное обеспечение будет затем отчет ручного измерения. Этот шаг не компьютеризирована, но полагается на пользователя, чтобы отметить расстояние между decidualized сайты путем рисования линии между decidualized сайтов, которые программа будет обеспечивать измерение for.
- Измерения имплантации, гестационного мешок размер и размер плода полюс.
5. ЧСС плода
Примечание: на 9,5 d.p.c., следует четко визуализируется плода сердцебиение.
- Очень по-прежнему сохраняя зонд, включите импульсная волна Doppler и поместите это видимый сердцебиение.
- Запись сердечной сердцебиение пульсациями.
Примечание: Помимо сердца, эта процедура может также записывать пульсации в пуповине.
6. трехмерного УЗИ приобретение
- после того, как беременной матки была визуализирована на изображения 2-D, положение зонда в области, которая находится в приблизительно медианы желаемого 3-D изображения. Например, если один изображениями яблоко в 3-D, зонд первоначально следует где apple ядро прогнозируется быть расположен (т.е. в середине объекта).
- С зонда в положении в середине нужное изображение, получить 3-D приобретения. 3-D мотор этап будет путешествовать это расстояние через матку в серии шагов или рамы, с целью захвата в объеме желания что следователь.
- Подтвердить, что предполагаемой структуры полностью захвачен в 3-D сканирование до завершения часть реального времени УЗИ. Сохраните этот 3-D информации для последующей обработки в более позднее время. Общее время для приобретения 2-D и 3-D УЗИ составляет примерно 10-20 минут при исполнении опытным пользователем.
7. 3-D воссоздание пост-обработки (рис. 2)
- загрузить нужные данные для обработки трехмерных изображений.
- Выберите " методы параллельных и вращения ", который загрузит все кадры 3D изображения в одном 3-D " поле " что пользователь затем будет проследить желаемого объекта в, кадр за кадром. Выберите шаг размер 0,08 мл. Начало в один конец блока изображения и прокрутите ознакомиться с изображениями, которые были захвачены в пространстве.
- Начало в одном конце изображения и вручную отслеживать контур объекта.
- Прокрутки следующий фрагмент изображения 2-D или " рамы " и вручную отслеживать контур объекта.
- Продолжать этот процесс до тех пор, пока все кадры были вручную аннотированный/объяснить пользователя.
- Нажмите " отделка " чтобы получить трехмерное изображение и общий объем вычислений.
- Выбрать между сеткой и твердых оверлея, который представляет стрелку в верхнем левом углу.
- Решили сохранить или удалить информацию о близлежащих УЗИ изображения для ясности. Каждый трехмерной реконструкции может занять от 10 и 20 мин
8. После процедуры ухода за
- при завершении УЗИ, выключить газ анестезии, удалите мышь от платформы и осторожно протрите и смыть любых УЗИ гель от животного.
- Место мыши обратно в клетке, в положении лежа в набивочного районе. Контролировать до тех пор, пока животное спит и движущихся спонтанно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на рисунке 1, высокой частоты ультразвука можно обнаружить имплантации сайт развития начиная с 5.5 точки время d.p.c в кратчайшие сроки. С помощью зажигалки гиперэхогенные decidualized эндометрия как маркер места имплантации в 6,5 d.p.c позволяет количество сайтов имплантации и интервалов этих сайтов, чтобы быть количественно. Как беременность прогрессирует до 7,5 d.p.c., темнее гипоэхогенные гестационного sac и плода полюс также легко идентифицировать.
Как показано на рисунке 2, состав завершенных после обработки трехмерной реконструкции в матку мышь способна быть визуализированы. На 6,5 d.p.c композиции УЗИ 3-D высокой частоты в сетки и твердых оверлея форматов может использоваться для предоставления визуальное изображение. Другой пример, на этот раз на 7,5 d.p.c, демонстрирует окончательное составное изображение другой матки с сеткой и твердых оверлея.
Рисунок 1: высокая частота УЗИ обнаружения имплантации разработка сайта и мониторинга роста плода на протяжении беременности. Как показано на рисунке 1A, на 5,5 d.p.c. легче гиперэхогенные decidualized эндометрия (D) позволяет количество сайтов имплантации и интервал чтобы быть количественно. Как показано на рисунке 1B, сайты decidualization (D) в другой рога матки соединены рога матки (U). 7.5 d.p.c. темнее гипоэхогенные sac (ОО) и плода полюс (F) являются легко узнаваемый Рисунок 1 c. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: трехмерная реконструкция мыши матки на ранних сроках беременности. На 6,5 d.p.c как показано на рисунке 2A, 3-D высокой частоты ультразвука в сетку и твердых оверлея показаны форматы. На 7,5 d.p.c как показано на рисунке 2B, 3-D высокой частоты ультразвуковых изображений с сеткой и твердых оверлея показаны форматы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот роман использования трехмерных изображений HFUS демонстрирует способность успешно обнаруживать, визуализировать и характеризуют места имплантации эмбриона на ранних сроках беременности мышиных неинвазивным способом. Технология предлагает значительное улучшение нынешних методов, которые полагаются на прерывание беременности для грубых тканей и гистопатологические характеристика. Однако следует отметить, что Гистологическая методы по-прежнему будут рассматриваться более оптимального когда требуемой квалификации на более увеличенное и более клеточном уровне, или когда требуется анализ генов и белков. С ростом числа новых моделей мыши отображение имплантации дефектов и ранней беременности потери19,20,21,22способность этого передовые ультразвуковая техника для раннего обнаружения беременность от 5,5 d.p.c года имеет явные преимущества перед ранее ультразвуковых методов, которые были ограничены до обнаружения в середине беременности12,13. Кроме того этот метод обнаруживает сердечной движения, как только сердце начинает бить, между23,d.p.c 8,5-9,524 , позволяя для подтверждения жизнеспособных плодов. Способность следовать ранней беременности события в то же самое животное означает меньше животных требуются за эксперимент и более точный анализ может быть выполнен с такими продольной экспериментальных образцов25,26, 27.
Следует отметить, что три важнейшие шаги в протоколе являются: (1) Зная точный гестационный день; (2) способность оператору обнаружить матки и положение зонда над правильным анатомические сайта; и (3) точные методы для создания трехмерной реконструкции. Следующие руководящие принципы устранения неисправностей оказались полезными: когда это трудно обнаружить матки на УЗИ, пользователь может запустить путем обеспечения впервые выявленных мочевого пузыря. Мочевого пузыря обычно рассматривается как черный круг и немедленно краниально к вагинальный открытия. Даже в мышей, которые претерпели мочеиспускания непосредственно перед УЗИ мочевого пузыря никогда не является полностью пустой и таким образом (в нашем опыте) может быть надежным маркер. После того, как определена мочевого пузыря, зонд должен быть медленно двинулась краниально пока видели матки. Если мочевого пузыря является небольшой или не могут быть визуализированы, пользователь может также пытаться визуализировать матки, начиная в яичнике, который можно найти на флангах, уступает почки. Используя этот системный подход, каждый сайт имплантации и развития плода можно наблюдать, как показано на рисунке 1. Иногда это может быть трудно получить желаемый регион матки во время УЗИ благодаря манере, в которой матки располагается в животе, как показано на рисунке 2 , различные формы и позиции матки в естественных условиях. Пользователь может наклона плоскости платформы мыши сдвиг или перестроить внутренне более благоприятное положение, в котором регионе желаемого матки может быть захвачено УЗИ матки. Наконец пользователь может подтвердить, что желаемого матки изображения были получены в ходе УЗИ быстро прокручивать приобретенных ультразвуковых изображений вскоре после завершения сессии УЗИ. Незначительные ограничения является, что 3-D сетка/твердых оверлея для визуального восстановления не может быть выполнена в ходе сессии УЗИ. Чтобы гарантировать, что УЗИ изображения получены точные, мы рекомендуем, что как исследователи получают знания, животные являются умерщвлены после УЗИ для того, чтобы соотнести точность результатов УЗИ для грубых тканей образца измерения и анатомии.
В то время как мы описываем здесь моделирования нормальной мышиных беременности, будущего применения этой техники будет применяться для количественной оценки события аварийного ранней беременности. HFUS и 3-D реконструкция позволит следователей для выявления и мониторинга количество, размер и расположение беременностей, которые являются ненормальными роста и/или развития. Например, неинвазивные фенотипические характеристики аномалий —т.е. дефектные эндометрия decidualization, аберрантных эмбриона имплантации распределения и неадекватной трофобластической вторжения и рост — отображается путем увеличения можно теперь продольно проанализирован ряд генно-инженерных мышей без прерывания беременности, с использованием этой методологии обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы очень ценим помощь Rong Чжао, Jie Li и Инь Янь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
References
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
- Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
- Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
- Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
- Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897 (2015).
- Ding, Y. B., et al. 5-aza-2'-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364 (2012).
- Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
- Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
- Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
- Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38 (2014).
- Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
- Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97 (2015).
- Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
- Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
- Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312 (2017).
- Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
- Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500 (2012).
- Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171 (2016).
- Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
- Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
- Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
- Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).
