Summary
Ratones son ampliamente utilizados para estudiar biología gestacional. Sin embargo, interrupción del embarazo se requiere para este tipo de estudios que impide investigaciones longitudinales y hace necesario el uso de grandes cantidades de animales. Por lo tanto, describimos una técnica no invasiva de la ecografía de alta frecuencia para la detección precoz y seguimiento de eventos tras la implantación en el ratón embarazado.
Abstract
Sonografía de alta frecuencia (HFUS) es un método no invasor, controlar el desarrollo en tiempo real del feto humano en el útero. El ratón se utiliza rutinariamente como un modelo en vivo para el estudio de la implantación del embrión y la progresión del embarazo. Desafortunadamente, estos estudios murinos requieren interrupción del embarazo para permitir el seguimiento análisis fenotípico. Para solucionar este problema, se utilizó la reconstrucción tridimensional (3D) de HFUS imagen de datos para la detección temprana y la caracterización de sitios de implantación de embriones murinos y su progresión en el desarrollo individual en el útero. Combinación de modelado y proyección de imagen de HFUS con reconstrucción 3-d, pudimos con precisión cuantificar número de sitio de implantación de embriones, así como monitorear la progresión del desarrollo en embarazadas ratones C57BL6J/129S de 5,5 días post coito (d.p.c.) a través de d.p.c. 9.5 con el uso de un transductor. Mediciones incluidas: número, ubicación y volumen de sitios de implantación así como espaciamiento entre implantación; se evaluó la viabilidad del embrión mediante el control de la actividad cardiaca. En el período tras el implante inmediato (5.5 a 8.5 d.p.c.), reconstrucción 3D del útero grávido en malla y recubrimiento sólido formato permitió a representación visual de los embarazos en vías de desarrollo dentro de cada cuerno uterino. Como ratones transgénicos se siguen usando para caracterizar fenotipos reproductivos femenino derivados de disfunción uterina, este método ofrece un nuevo enfoque para detectar, cuantificar y caracterizar principios implantación eventos en vivo. Este nuevo uso de la proyección de imagen de 3-d HFUS demuestra la capacidad de detectar, visualizar y caracterizar sitios de implantación del embrión durante el embarazo temprano murino de manera no invasiva con éxito. La tecnología ofrece una mejora significativa sobre los métodos actuales, que se basan en la interrupción de embarazos para tejidos brutos y Caracterización histopatológica. Aquí utilizamos un formato de vídeo y texto para describir cómo realizar con éxito los ultrasonidos del embarazo temprano murino para generar datos fiables y reproducibles con la reconstrucción de la forma uterina en malla y sólidos 3D imágenes.
Introduction
Pérdida recurrente de embarazo temprano es una de las complicaciones más frecuentes después de la concepción y afecta aproximadamente al 1% de las parejas que intentan concebir1,2. Los mecanismos subyacentes de la pérdida temprana del embarazo son muy variados: desde intrínsecas anormalidades embrionarias y comorbilidades maternas a los defectos en la receptividad endometrial1,3,4. Debido a su maleabilidad genética, modelos de ratón han sido ampliamente utilizados para las investigaciones de temprana implantación del embrión y el embarazo. Además, el poco tiempo de gestación del ratón y la capacidad para realizar estudios de gran escala han asegurado la creciente utilidad del ratón para hacer frente a preguntas claves clínicas en medicina reproductiva humana5. Dicho esto, la gran mayoría de los diseños experimentales murinos aún requiere numerosas presas para ser sacrificados en los días gestacionales secuenciales para cuantificar y analizar la ubicación del sitio de implantación, número, tamaño y patrones de separación durante el embarazo6, 7,8, lo que impide estudios longitudinales sobre el mismo animal.
En la clínica, el ultrasonido es una herramienta confiable y valiosa para monitorear la viabilidad fetal humano y desarrollo en una manera no invasiva9,10,11. Más recientemente, el ultrasonido de alta frecuencia (HFUS) ha comenzado a encontrar aplicaciones limitadas en el ratón como un método de control de viabilidad fetal y crecimiento durante el embarazo12,13,14. Los recientes avances tecnológicos en proyección de imagen de ultrasonido han permitido la aplicación de datos tridimensionales (3D) para la reconstrucción visual de los órganos animales y posterior seguimiento de patologías15,16, 17. Uso de esta avanzada tecnología de imagen ha mejorado notablemente el poder de detectar fluctuaciones de volumen más pequeño, para reducir la variabilidad entre animales y para monitorizar la progresión de una patología o la eficacia de una intervención terapéutica17. Mientras que la principal utilidad de esta tecnología ha sido monitorear la progresión de la neoplasia en el oncorratón modelos15,16, 3-d imágenes HFUS sólo recientemente se ha utilizado para cuantificar y monitorear el crecimiento activo de la implantación del embrión y desarrollo del feto en el útero de ratón18.
Aquí, demostramos cómo realizar HFUS para producir datos 2-D y 3-d la proyección de imagen para generar reconstrucciones del útero de ratón embarazadas temprano. Demostramos la utilidad de este novedoso método para detectar estos eventos tempranos de la implantación embrionaria sin necesidad de interrupción del embarazo, permitiendo a los investigadores recolectar datos de manera no invasiva.
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Protocol
estos estudios se llevaron a cabo con arreglo a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicados por los institutos nacionales de salud y protocolos animal aprobados por la institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Baylor College of Medicine en protocolo número AN-4203.
1. preparación de la embarazada para ultrasonido
- tiempo de apareamiento
- lugar la presa con un macho fértil probada principio noche de ratón después de 1700. Separar presa y el hombre por las 0700 horas (horas), independientemente si existe tapón vaginal, para fechar exacto de embarazo.
Nota: La mañana después de aparearse se considera 0,5 día post coitum (d.p.c.).
- lugar la presa con un macho fértil probada principio noche de ratón después de 1700. Separar presa y el hombre por las 0700 horas (horas), independientemente si existe tapón vaginal, para fechar exacto de embarazo.
- Preparación de ultrasonido
- Coloque el ratón embarazado en un contenedor de inducción anestesia sellado.
- Calmante con anestésico isoflurano (2%) se inhala y oxígeno (1 L/min) hasta que el animal pierde el reflejo de adrizamiento (aproximadamente 1-2 min dependiendo del tamaño del ratón) y no se observan movimientos espontáneos (además de la respiración).
- Lugar sedada del ratón en la posición supina en el cono de nariz con isoflurano (2%) inhala anestesia y oxígeno (1 L/min). Aplique ungüento oftálmico al animal ' ojos s.
- Con un algodón, aplicar Crema depilatoria a todo abdomen, esternón a la vagina y lateral a los costados.
- Permite crema para permanecer por un máximo de 3 minutos y luego retire la crema y el pelo con el tejido. Asegurar que se elimina todo el pelo, como cualquier resto del cabello disminuirá la calidad de la imagen.
2. Preparación de la etapa de ultrasonido
- encienda el transductor de.
- Conectar etapa motor 3D motor etapa al transductor.
Motor
- enchufe en 3D mediante la conexión del cable del motor 3D para el conector del motor 3D en el panel trasero. Conectar el sistema de motor 3D para el sistema de montaje mediante el post de liberación rápida en la parte superior para conectar a la estación de proyección de imagen y la liberación rápida de montaje en la parte inferior para fijar la pinza transductor.
- Conecte la sonda a la pinza transductor.
3. Comience el ratón embarazadas la proyección de imagen
- ratón de lugar supina en la plataforma de monitoreo. El ratón continuamente recibe isoflurane anestésico (entre 1.5-2.5%) y oxígeno (1 L/min) a través del cono de nariz. Suavemente la cinta todas las patas a las almohadillas en la plataforma de control del ritmo cardiaco.
- Aplique 1-2 mL de gel de transmisión del ultrasonido en el abdomen.
- Con la etapa de motor manual, coloque la sonda del ultrasonido sobre el abdomen.
- Localizar la vejiga, que debe aparecer como un círculo oscuro lleno de líquido sólo cefálica a la abertura vaginal.
- Una vez que la vejiga se encuentra, mueva la sonda lentamente cefálica para visualizar útero durante el embarazo, que debe aparecer como una forma cilíndrica con áreas redondas en sitios de embarazo. Esto puede ser descrito como mirando como perlas de una cadena.
- Una vez que el útero embarazado ha sido identificado, comienza la proyección de imagen 2-D.
4. La proyección de imagen del ultrasonido de 2-D (Figura 1)
- una vez que se ha identificado el útero durante el embarazo, comienzan en el sitio de embarazo más cercano a la vejiga y lentamente y secuencialmente hacia cefálica determinar número y localización de sitios de embarazo.
- Si se visualiza el riñón, el bazo o el hígado, recolocar la sonda más caudal (más cerca de la vejiga) como el usuario ha ido demasiado lejos cephalad.
- El cuerno uterino contralateral de la imagen de la misma manera.
- Congelar la imagen cuando el marco de la ecografía está en el centro del sitio de implantación, embarazo a guardar para su posterior análisis y medidas de.
Nota: Tarda menos de un segundo para que la imagen de ser congelados y guardados para su posterior análisis. - Medida de distancia de implantación mediante la reacción de decidualization hyperechoic como marcador manualmente haciendo clic en la " medida " de la herramienta primero y luego haciendo clic en la ubicación de un sitio de implantación. A continuación, arrastre el cursor al próximo sitio de implantación y haga clic en para dibujar una línea que el equipo informará automáticamente su distancia. El software informará entonces qué es la medición manual. Este paso no es automatizado, pero depende del usuario para marcar la distancia entre sitios decidualized dibujando una línea entre los sitios decidualized, que el programa proporcionará una información de medición
- Medir tamaño de implantación, tamaño del saco gestacional y poste fetal tamaño.
5. La frecuencia cardíaca fetal
Nota: en 9,5 d.p.c., los latidos del corazón fetal deben visualizarse claramente.
- Manteniendo la sonda muy todavía, encienda la onda de pulso Doppler y coloque éste sobre el latido visible.
- Registro el cardiaco corazón latía pulsaciones.
Nota: Aparte del corazón, este procedimiento también puede grabar pulsaciones en el cordón umbilical.
6. adquisición de ultrasonido 3-d
- después de que el útero embarazado ha sido visualizado en proyección de imagen 2-D, coloque la sonda en un área que está en el punto medio aproximado de la imagen 3D deseado. Por ejemplo, si uno imagen una manzana en 3-d, la sonda debe inicialmente colocarse donde el núcleo apple predice que encuentra (es decir, en medio del objeto).
- Con la sonda en una posición en el centro de la imagen deseada, obtener una adquisición 3D. La etapa de motor 3D viajará esta distancia a través del útero en una serie de pasos o marcos, con la intención de captar en totalidad lo que el investigador desea.
- Confirmar que las estructuras previstas son capturadas completamente en la exploración 3D antes de completar la porción de ultrasonido en tiempo real. Guarde esta información 3D para procesamiento posterior en un momento posterior. El tiempo total para la adquisición de la ecografía 2-D y 3-d es aproximadamente 10-20 minutos cuando es realizada por un usuario experimentado de.
7. 3D procesamiento posterior reconstitución (Figura 2)
- carga los datos deseados para el procesamiento de imágenes 3-d.
- Elegir " métodos paralelos y rotación ", que cargará todos los cuadros de imagen 3D en 3-un d " caja de " que el usuario será entonces trazar el objeto deseado, fotograma por fotograma. Seleccione paso tamaño 0,08 mL. Comience en un extremo del bloque de la imagen y desplazarse para que se familiarice con las imágenes que han sido capturadas dentro del espacio.
- Comience en un extremo de la imagen y manualmente traza el contorno del objeto.
- Desplácese hasta la siguiente rebanada de imagen 2-D o " marco " y manualmente trazar el contorno del objeto.
- Continúe este proceso hasta que todos los marcos han sido anotado/remontado manualmente por el usuario.
- Haga clic en " final " para obtener la imagen 3D y cálculos de volumen total.
- Escoger entre la malla y recubrimiento sólido, que es una flecha en la esquina superior izquierda.
- Optar por mantener o eliminar la información de imagen de ultrasonido circundante para mayor claridad. Cada reconstrucción 3-d puede tomar entre 10 y 20 minutos
8. Cuidado posterior al procedimiento
- cuando el ultrasonido es completado, apague el gas de la anestesia, quitar el ratón de la plataforma y frotar con cuidado y lavar cualquier gel de ultrasonido del animal.
- Volver a colocar el ratón en la jaula en una posición prona en una zona acolchada. Seguimiento hasta que el animal está despierto y en movimiento espontáneamente.
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Representative Results
Como se muestra en la figura 1, el ultrasonido de alta frecuencia puede detectar la implantación sitio desarrollo comienza ya en el punto 5.5 del tiempo d.p.c. Usando el encendedor hyperechoic decidualized endometrio como marcador de sitios de implantación en 6.5 d.p.c permite al número de sitios de implantación y el espaciamiento de estos sitios para ser cuantificada. Como el embarazo progresa a 7.5 d.p.c., más oscuro saco gestacional hypoechoic y poste fetal también es fácilmente identificable.
Como se muestra en la figura 2, la completa composición post-processing de la reconstrucción tridimensional del útero de ratón es capaz de visualizar. En 6.5 d.p.c, la composición de ultrasonido 3-d de alta frecuencia en formatos sólido recubierto de malla y puede utilizarse para proporcionar una representación visual. Otro ejemplo, esta vez en 7.5 d.p.c, muestra la imagen compuesta final del útero otro con malla y recubrimiento sólido.
Figura 1: detección de ultrasonido de alta frecuencia de desarrollo de sitios de implantación y seguimiento del crecimiento fetal durante la gestación. Como se muestra en la figura 1A, d.p.c. 5.5 hyperechoic encendedor decidualized endometrio (D) permite al número de sitios de implantación y espaciado a cuantificarse. Como se muestra en la figura 1B, sitios decidualization (D) en el otro cuerno uterino se les unen el cuerno uterino (U). Por 7.5 d.p.c., más oscuro hypoechoic sac (GS) y poste fetal (F) son fácilmente identificables figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la reconstrucción tridimensional del útero de ratón durante el primer trimestre de embarazo. En 6.5 d.p.c, como se muestra en la figura 2A, 3-d alta frecuencia ultrasonido en malla y recubrimiento sólido se muestran formatos. En 7.5 d.p.c, como se muestra en la figura 2B, imágenes de ultrasonido de alta frecuencia 3-d con malla y recubrimiento sólido se muestran formatos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este nuevo uso de la proyección de imagen de 3-d HFUS demuestra la capacidad de detectar, visualizar y caracterizar sitios de implantación del embrión durante el embarazo temprano murino de manera no invasiva con éxito. La tecnología ofrece una mejora significativa sobre los métodos actuales, que se basan en la interrupción de embarazos para tejidos brutos y Caracterización histopatológica. Sin embargo cabe señalar que los métodos histológicos aún se consideraría más óptima cuando se desee caracterización de forma más ampliada y más celular, o cuando se requiere el análisis de genes y proteínas. Con un creciente número de nuevos modelos de ratón que muestra defectos de implantación y embarazo precoz pérdida19,20,21,22, la capacidad de esta avanzada técnica de ultrasonido para detectar temprano embarazos de 5.5 d.p.c adelante proporciona claras ventajas sobre los anteriores métodos de ultrasonido que se limita a la detección en el embarazo medio12,13. Además, este método detecta el movimiento cardiaco cuando el corazón comienza a batir, entre 8.5-9.5 d.p.c23,24 para confirmación de fetos viables. La capacidad para seguir los acontecimientos tempranos del embarazo en el mismo animal significa menos animales se requieren por experimento y análisis más preciso puede ser realizado con estos diseños experimentales longitudinal25,26, 27.
Cabe señalar que los tres pasos más importantes en el protocolo son: (1) saber el día exacto de gestación; (2) la capacidad del operador para localizar el útero y coloque la sonda sobre el sitio anatómico correcto; y (3) técnicas precisas para producir una reconstrucción 3-d. Las siguientes pautas de resolución de problemas han demostrado ser útiles: cuando es difícil ubicar el útero en el ultrasonido, el usuario puede empezar por asegurar que la vejiga se identifica en primer lugar. La vejiga es generalmente vista como un círculo negro y es inmediatamente cefálica a la abertura vaginal. Incluso en ratones que han sido sometidos a micción inmediatamente antes de la ecografía, la vejiga no está completamente vacía y así (en nuestra experiencia) puede ser un marcador confiable. Una vez que se identifica la vejiga, la sonda debe ser movida lentamente cefálica hasta que el útero se ve. Si la vejiga es pequeña o no se puede visualizar, el usuario puede también intentar visualizar el útero, comenzando en el ovario, que se puede encontrar en los flancos, inferiores al riñón. Usando este acercamiento sistemático, cada sitio de implantación y desarrollo del feto pueden observarse, como en la figura 1. En ocasiones, puede ser difícil obtener la región deseada del útero durante la ecografía debido a la manera en que el útero se encuentra en el abdomen, como se muestra en la figura 2 diversas formas y posiciones del útero en vivo. El usuario puede inclinar el plano de la plataforma de ratón para cambiar de puesto o realinear el útero internamente a una posición más favorable en el cual la región uterina deseada puede ser capturada por ultrasonido. Por último, el usuario puede confirmar que las imágenes deseadas uterinas fueron obtenidas durante la sonografía desplazándose rápidamente por las imágenes de ultrasonido adquirió pronto una vez finalizada la sesión de ultrasonido. Una limitación menor es que la superposición de malla 3-d/sólido para la reconstrucción visual no se puede realizar durante la sesión de ultrasonido. Para asegurarse de que las imágenes de ultrasonido obtenidas son exactas, se recomienda que como los investigadores están ganando la competencia, los animales son sacrificados después de ultrasonido con el fin de correlacionar la exactitud de los resultados del ultrasonido a la muestra de tejido grueso las mediciones y anatomía.
Mientras que aquí describimos el modelado de embarazo murino normal, futuras aplicaciones de esta técnica se aplicará para cuantificar eventos anormales de embarazo temprano. HFUS y reconstrucción 3D permitirá a los investigadores a detectar y controlar el número, tamaño y ubicación de embarazos que son anormales en el crecimiento y desarrollo. Por ejemplo, caracterización fenotípica no invasivo de anomalías,es decir defectuosos decidualization endometrial, distribución de la implantación del embrión aberrante e invasión trofoblástica inadecuada y crecimiento — muestra un aumento número de ratones modificados genéticamente puede ahora analizarse longitudinalmente sin interrupción de embarazo con esta metodología de proyección de imagen.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Apreciamos mucho la asistencia de Rong Zhao, Li Jie y Yan Ying.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
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