Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

ميكرويرادييشن الليزر لدراسة في فيفو الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56213
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2,3,4, 1
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

والهدف من هذا البروتوكول لوصف كيفية استخدام الليزر ميكرويرادييشن لحمل أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي، بما في ذلك فواصل حبلا بسيطة نسبيا والأضرار معقدة، لدراسة الحمض النووي الضرر إشارات وإصلاح عامل الجمعية في مواقع الضرر الحية .

Abstract

أضرار الحمض النووي يستحث ردود الإشارات وإصلاح محددة في الخلية، هو أمر حاسم لحماية سلامة الجينوم. ميكرويرادييشن الليزر أصبح أداة تجريبية قيمة للتحقيق الحمض النووي الضرر (DDR) وردا في فيفو. ويتيح تحليل خلية واحدة عالية الدقة في الوقت الحقيقي لديناميات الجزيئات في استجابة للأضرار التي يسببها الليزر تنحصر في منطقة سوبميكروميتير في نواة الخلية. ومع ذلك، استخدمت شروط مختلفة بالليزر دون تقدير للاختلافات في أنواع الأضرار التي يسببها. نتيجة لذلك طبيعة الأضرار التي كثيرا ما لا تكون كذلك تتميز أو يسيطر عليها، يسبب التضارب الواضح في التوظيف أو تعديل التشكيلات الجانبية. أظهرنا أن تشعيع مختلف الظروف (أي، أطوال موجية مختلفة، فضلا عن مختلف القوى الإدخال (إيراديانسيس) ليزر femtosecond (خ) القريبة من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)) الناجم عن التجميعات البروتين التسريح وإعادة الإدماج وإصلاح متميزة. وهذا يعكس نوع تلف الحمض النووي المنتجة. هذا البروتوكول ويصف كيف يسمح المعايرة لليزر مدخلات الطاقة التعريفي لكميات مختلفة وتعقيدات الأضرار الحمض النووي، والتي يمكن رصدها بسهولة بالكشف عن الأضرار قاعدة وكروسلينكينج، بولي التفاضلية (ADP-ريبوز) (PAR) الإشارات، و الإصلاح الخاصة بمسار الجمعيات عاملاً في مواقع الضرر. حالما يتم تحديد شروط الضرر، فمن الممكن للتحقيق في آثار تعقيد أضرار مختلفة ويشير إلى الأضرار التفاضلية وكذلك نضوب المنبع factor(s) على أي عامل للفائدة.

Introduction

في فيفو مما يشير إلى تلف الحمض النووي هي "ليست مفهومة جيدا"
في فيفو، الحمض الرصاصية مع هيستونيس وغيرها من العوامل إلى ألياف الكروماتين النموذج. تنظيم هيكل الكروماتين من الأهمية بالنسبة استقلاب الحمض النووي. على سبيل المثال، هو البديل هيستون H2AX فوسفوريلاتيد ترنح-توسع الشعريات تحور (ATM) والأخرى مؤنزم حبلا مزدوجة التالية فواصل التعريفي (جهاز تسوية المنازعات)، ومن المهم لتضخيم إشارة تلف جهاز تسوية المنازعات، فضلا عن توفير موقع إرساء للآخر العوامل. ينتشر من اختيار مسار الإشارات وإصلاح الأضرار تظهر خطيرة يمكن أن يتأثر بهيكل الكروماتين المحلية في مواقع الضرر1. عدد من الكروماتين إعادة عرض العوامل ومرافقين هيستون هستون تعديل الإنزيمات يعينون في الواقع إتلاف المواقع وهامة لكفاءة إصلاح الحمض النووي، تسليط الضوء على أهمية تنظيم الكروماتين في التسريح وإعادة الإدماج وإصلاح2 , 3 , 4-وعلاوة على ذلك، لوحظ الأضرار موقع تجميع أو إعادة تموضع في الخميرة و المورفولوجية5،6،،من78، تذكرنا ريلوكاليزاتيون الجيني المكاني في حجرة سوبنوكلير المرتبطة بالجينات البند9،10. أيضا كشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا في الماوس والخلايا البشرية تعبئة المواقع جهاز تسوية المنازعات، والتأثيرات التي إصلاح الإخلاص ومسار اختيار11،12. وهذا يثير احتمال أن التسريح وإعادة الإدماج/إصلاح قد أيضا يكون ارتباطاً وثيقا بالهندسة النووية، ومنظمة الكروماتين مرتبة أعلى، وكروموسوم الديناميات في نواة الخلية. وهكذا، أنها حاسمة لتطوير أساليب عالية الاستبانة دراسة التسريح وإعادة الإدماج، وإصلاح العمليات في سياق البيئة النووية الذاتية في خلية حية من أجل فهم الآثار القصيرة الأجل والطويلة الأجل لتلف الحمض النووي.

الدور الحاسم للإسمية بوليميراز (تسنى) في قياس مدى ونوع الضرر وتنظم الجمعية البروتين في موقع الضرر
PARP1 هو جهاز استشعار نك الحمض النووي سرعة تفعيلها بأضرار الحمض النووي التي تلعب دوراً حاسما في إصلاح الحمض النووي13. PARP1 كان يعتقد أصلاً أن تعمل جنبا إلى جنب مع الأشعة السينية إصلاح عبر تكملة 1 (XRCC1) لتسهيل إصلاح قاعدة الختان (البر)، ولكن الدراسات الحديثة تكشف عن دورها في سائر مسارات إصلاح الحمض النووي، بما في ذلك إصلاح جهاز تسوية المنازعات14. تنشيط PARP1 الاستخدامات نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NAD+) كركيزة لشرطة أبوظبي-ريبوسيلاتي البروتينات المستهدفة متعددة، بما في ذلك نفسها. هذا الإنزيم وأفراد الأسرة الآخرين اجتذبت قدرا كبيرا من الاهتمام في السنوات الأخيرة حيث ظهرت مثبطات نشطت واعدة العقاقير العلاجية لحالات السرطان. على الرغم من مثبطات نشطت عثر في بادئ الأمر أن تكون فعالة في مورثة سرطان الثدي (بركة)-تحور خلايا سرطان الثدي، وهناك الآن عدد كبير أدلة لما لها من الآثار في مونو-والجمع بين العلاجات جنبا إلى جنب مع الحمض النووي يضر وكلاء/تشعيع ضد طائفة واسعة من أنواع السرطان مع الطفرات التي لا تقتصر على بركا15،16،،من1718،،من1920.

على المستوى الجزيئي، أبدى التنشيط تسنى القيام بأدوار حاسمة في تنظيم هيكل الكروماتين المحلية في مواقع الضرر. التوظيف تعتمد على قدم المساواة للإنزيمات تعديل الكروماتين يسهل إصلاح جهاز تسوية المنازعات وإصلاح ما تمليه اختيارات المسار، مما يشير إلى دور هام السقالات التعديل الاسمية في مواقع الضرر. 13،21،،من2223،24،25،26،27،،من2829، 30،31 أثبتنا استبعاد البروتين p53-ملزمة 1 (53BP1) مؤخرا من أضرار المواقع الاسمية 32، تقديم أي تفسير بديل لتعتمد على 53BP1 هايبراكتيفيشن (اندجوينينج غير المتجانسة نهيج) التي نشطت المانع وتسليط الضوء على أهمية نشطت في جهاز تسوية المنازعات إصلاح مسار اختيار33،34. PARP1 أيضا مباشرة تصليح باريلاتيس ويؤثر على نشاط الحمض النووي متعددة العوامل14.

باستخدام ميكرويرادييشن الليزر كأداة لدراسة التسريح وإعادة الإدماج/إصلاح في فيفو
أولاً وصفت في عام 196935 ميكرويرادييشن الليزر لإنتاج التعديلات الفرعية ميكرون في الكروموسومات الفردية واستعرض بالتفصيل في 198136. منذ عدة عقود في وقت لاحق، ميكرويرادييشن الليزر كان سيظهر للحث على أضرار الحمض النووي في منطقة سوبميكروميتير محددة في نواة الخلية، وقد ثبت أن تقنية قيمة لدراسة التوظيف أو تعديلات للعوامل المختلفة للحمض النووي آفات فيفو 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41-هذا الأسلوب يتيح الكشف عن تلك العوامل التي لا تشكل البؤر التي يسببها الإشعاع متميزة (عريف) في تلف مواقع39،42. من الممكن أيضا لدراسة ديناميات التغيرات الهيكلية الكروماتين في مواقع الأضرار وفي بقية النواة الزمانية المكانية. نحن مقارنة بعناية DDRs الناجمة عن نظم الليزر المختلفة وإدخال القوى لتقييم العلاقة بين نوع الضرر الحمض النووي وميكرويرادييشن الظروف32،،من4344، 45. تكرار أنماط التوظيف المنحرف ل 53BP1 وتيلوميريك عامل ملزم 2 (TRF2) وقد لوحظت في الدراسات أضرار الليزر السابقة، التي وفرت الأساس لقلق متكرر على الطابع "غير الفسيولوجية" للأضرار التي يسببها الليزر46 47، ،،من4849. وجدنا أن هذه التناقضات الواضحة الآن يمكن أن تفسر التي نشطت التفاضلية الإشارات التي مقاييس كمية وتعقيد الأضرار العمدي32. أكدنا أن: 1) الخلايا الليزر-ميكرويرادياتيد (حتى بعد ارتفاع مدخلات الطاقة التشعيع) اعتقل في الطور البيني بطريقة تعتمد على مراقبة نقطة تفتيش أضرار والبقاء (على الأقل ما يصل إلى 48 س)50من32،؛ و 2) إصلاح عامل التوظيف/التعديلات إخلاص الخص تلك التي لوحظت مع المعاملة مع العوامل الضارة الحمض النووي التقليدية وتحريض جهاز تسوية المنازعات قبل39،اندونوكليسيس،من3242، 44،50،،من5152. بشدة دعم هذه النتائج أهمية فسيولوجية دراسة الاستجابات الخلوية الناجمة عن أضرار الليزر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الخلية الأساسية

ملاحظة: هذه الخطوة لكشف الفلورة القياسية لتجنيد البروتين الذاتية أو تعديلها، وعلى استخدام خط الخلية ستابلي معربا عن بروتين المؤتلف المعلمة فلوريسسينتلي. على سبيل المثال، دراسة بوتوروستريداكتيلوس (PtK2) الخلايا الظهارية الكلي جرابي ستابلي معربا عن اجفب-53BP11220-1711 أو TRF2-يفب استخدمت في أعمالنا السابقة (الشكل 1)32. في الحالة الأولى، التركيز تشكيل منطقة 53BP1 (حمض أميني 1220-1711) الذي يحتوي على المجال أوليجوميريزاتيون والمجال تيودور عزر أوبيكويتيلاتيون-تعتمد على التوظيف (UDR)، كانت تنصهر فيها إلى تعزيز التجارة والنقل (اجفب-53BP11220-1711). ويجمل هذا البروتين الانصهار تجنيد54،53،53BP1 كامل طول55موقع الضرر. في خلايا هيلا، فلوريسسينتلي المعلمة مفارز كوسين (مثلاً، hSMC1 التجارة والنقل51وبروتينات فلورية خضراء-Scc1 (Rad21)52والتجارة والنقل-SA2 51) يجب أن ستابلي يعبر عنه لضمان إدماج كفاءة في المجمع والخص S/G2 دورة الخلية الخاصة بمرحلة الضرر موقع تجنيد كوسين الذاتية51.

  1. البذور أي نوع خلية ملتصقة على طبق استنبات الأنسجة 35 ملم مع ساترة الشبكية للسماح بتحديد خلية فردية. ضبط عدد الخلايا الأولية لتحقيق كونفلوينسي 60% في ح 36-48 على أساس معدل انتشار لخط خلية معينة. على سبيل المثال:
    1. PtK2 الكلي جرابي الخلايا الظهارية (أما نوع البرية أو الذين يعبرون عن ستابلي اجفب-53BP11220-1711 أو TRF2-يفب): لوحة 2.0 × 104 خلايا في 2 مل المتقدمة المتوسطة الأساسية الدنيا (MEM) تستكمل مع 2 مم ل الجلوتامين، 4% بقرى الجنين مصل الدم (FBS)، والمضادات الحيوية (البنسلين يو/مليلتر 100 و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين)، واحتضان في 37 درجة مئوية مع شركة 7%2.
    2. للحلة معلم الخلايا مع ستابلي معربا عن فلوريسسينتلي المؤتلف البروتينات بروتينات فلورية خضراء-SA2: البذور 1.0 × 105 خلايا في 2 مل المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع 10% FBS ومم 2 لتر-الجلوتامين، 100 يو/مليلتر البنسلين وستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل، واحتضان في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. كما يمكن استخدام خلايا هيلا أخرى بما في ذلك خلايا غير معدلة أو خلايا معربا عن hSMC1-التجارة والنقل.
  2. السماح للخلايا التقيد وتتكاثر ح 36-48 قبل التعريفي تلف الحمض النووي في التقاء 30-60 في المائة (للسماح لتصور عدد الشبكة). انتقل إلى القسم 4.

2-عابر تعداء

ملاحظة: لا تتوفر الأجسام المضادة جيدة في بعض الأحيان للكشف عن البروتينات الذاتية. إذا لم تتوفر خطوط الخلايا ستابلي معربا عن البروتينات ماركر، الاضطلاع ترانسفيكتيونس عابرة لرصد البروتينات المسمى فلوريسسينتلي لتحليل الخلية الحية.

  1. لخلايا هيلا، في اليوم 1، البذور 6-8 × 104 خلايا في 0.5 مل الثقافة الإعلامية في بئر واحدة من صفيحة 24-جيدا واحتضان في حاضنة هوميديفيد 100% عند 37 درجة مئوية ومع أول أكسيد الكربون 5%2. راجع الخطوة 1.1 لشروط الثقافة الإعلامية.
  2. يوم 2، استخدام بلازميد تعبير الثدييات ترميز الحمض النووي فلوريسسينتلي المعلمة إصلاح عامل (مثلاً، NTH1 التجارة والنقل أو التجارة والنقل-OGG1 لقاعدة الضرر32،،من4456، بروتينات فلورية خضراء-كو لجرعة عالية دسبس57، التجارة والنقل-53BP1 32 دسبس بسيطة نسبيا، أو غيرها من البروتينات للفائدة التي تنصهر فيها علامة نيون) للقيام بوساطة الحويصلية تعداء الحمض النووي. تمييع 0.3 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي إلى 25 ميليلتر من وسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل في أنبوب 1.5 مل.
  3. في أنبوب 1.5 مل آخر، وتمييع 1 ميليلتر الحويصلية على أساس الحمض النووي تعداء الكاشف إلى 25 ميليلتر من وسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل وتخلط برفق.
  4. مزيج الوكيل الحمض النووي وتعداء المخفف بلطف، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) إلى نموذج المجمعات الحمض الدهني.
  5. شطف الخلايا مع وسائط الثقافة 0.5 مل مرة واحدة وقم بإزالة الوسائط وإضافة 0.5 مل الطازجة ثقافة وسائل الإعلام إلى الخلايا (كما في الخطوة 1، 1).
  6. إضافة مجمعات الدهنية الحمض النووي للخلايا. المزيج بلطف هزاز اللوحة بضع مرات. وضع الخلايا في الحاضنة كما في الخطوة 2، 1.
  7. بعد ح 4-6، قم بإزالة وسائط الثقافة من الخلايا، وإضافة 300 ميليلتر 0.05% يدتا التربسين. إزالته، وإضافة 200 ميليلتر التربسين-يدتا، واحتضان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3-4 دقيقة.
  8. بعد التأكد من أن يتم فصل الخلايا، إضافة 800 ميليلتر ثقافة الإعلام وريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج برفق تفتيت كتل الخلية. نقل تعليق خلية إلى طبق ثقافة 35 ملم مع ساترة الشبكية، وإضافة وسائط الثقافة إلى وحدة تخزين نهائي من 2 مل.
  9. احتضان الخلايا في الحاضنة كما في الخطوة 2، 1 ح 48، ثم انتقل إلى القسم 4.
    ملاحظة: إذا كان التعبير عن البروتين المؤتلف السامة (transfected الخلايا تظهر مورفولوجيا مستديرة أو غير منتظمة بعد حضانة في خطوة 2.8)، تقصير وقت التعبير، وإجراء ميكرويرادييشن ليزر (القسم 4) في ح 16-20 بعد تعداء طالما يمكن تأكيد التعبير البروتين (للكشف عن الأسفار، راجع الخطوة 4، 3). وفي هذه الحالة، تنفيذ تعداء مباشرة في الطبق 35 ملم. خلايا البذور 3.0 x 105 الحلة في طبق 35 ملم مع ساترة الشبكية لتحقيق التقاء 50-70% تقريبا بعد 30 h. "ترانسفيكت الحمض النووي" والبلازميدات، وتغيير الإعلام ح 2-6 بعد تعداء. المضي قدما مع الليزر ميكرويرادييشن ح 12-20 لاحق إذا كان التعبير البروتين معقولة وتظهر الخلايا السليمة.

3-دورة الخلية المزامنة

ملاحظة: جزئ مثلى إصلاح البروتينات (HR)، مثل Rad51 وكوسين، التوظيف أكثر بروزا في المرحلة S/G2 من دورة الخلية، في الموارد البشرية التي يستغرق إصلاح مكان51. وبالتالي، رصد تجنيد هذه البروتينات، تزامن الخلية إلى المرحلة S/G2 ضروري.

  1. المرحلة S/G2 التزامن
    1. استخدام البروتوكول كتلة thymidine مزدوجة لتزامن الخلية إلى S/G2 المرحلة50،51. وبعد زرع الخلايا في صحن ساترة الشبكية 35 ملم (راجع الخطوة 1، 1)، احتضان الخلايا مع thymidine (بتركيز نهائي من 2.5 ملم) في وسائل الإعلام الثقافة (كما في الخطوة 1، 1) لح 17 عند 37 درجة مئوية ومع أول أكسيد الكربون 5%2.
    2. شطف الخلايا مع 1 مل خالية thymidine وسائط الثقافة (كما في الخطوة 1، 1) مرتين، واحتضان الخلايا في 2 مل خالية thymidine ثقافة وسائل الإعلام لح 9 كما في الخطوة 1، 1.
    3. إضافة 200 ميليلتر من 27.5 مم thymidine الأسهم الحل (حل في الثقافة الإعلامية) إلى وسائط الإعلام الثقافة مع الخلايا إلى نهائي تركز thymidine 2.5 ملم. احتضان الخلايا كما هو الحال في الخطوة 3.1.1 لآخر 15 h. الشطف واحتضان الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة خالية من thymidine لح 4-6 والحث على تلف الحمض النووي (القسم 4).
    4. تأكيد الكفاءة المزامنة باستخدام علامات دورة الخلية (Cyclin A2 و B1 S/G2 و G2، على التوالي)، S/G2 المرحلة الحمض النووي الضرر إصلاح عوامل محددة (مثلاً، Rad51 أو كوهيسين)، أو عن طريق حقن المخدرات/إيدو التأسيس (للخلايا المرحلة S)51.
  2. تزامن المرحلة G1
    1. بذور 6-8 × 10 خلايا هيلا4 في صحن ثقافة 35 ملم مع ساترة الشبكية (الخطوة 2، 1).
    2. وبعد يومين، تحديد الخلايا الطورية، ورفع قليلاً وعلى شكل الجولة، تحت مجهر مقلوب استخدام 10 X الهدف وعدسات العين X 10. الحصول على الصور لتسجيل موقف الخلايا الطورية في ساترة الشبكية.
    3. بعد 3-4 ح، تأكيد انقسام الخلية إلى خليتين ابنه (في المرحلة G1)، والحث على تلف الحمض النووي (القسم 4).

4-معايرة الليزر مدخلات الطاقة

ملاحظة: في هذا البروتوكول، ونحن حمل تلف الحمض النووي باستخدام 780 نانومتر نابض خ نير نظام الليزر ملحقة مجهر [كنفوكل]، أو 800 نانومتر نابض خ نير الليزر بالإضافة إلى مجهر مقلوب برنامج التحصين الموسع-الأسفار. على الرغم من أن يختلف مدخلات الطاقة (الإشعاع الفعلية في جهة الليزر في العينة) اللازمة لحمل DDR قابلة للمقارنة في هذه النظم، المبدأ الأساسي لمعايرة مدخلات الطاقة ينطبق على كلا، أو أي، نير أنظمة32،57 . الطاقة في الموقع الواحد الإشعاع ليزر النبض والذروة في نقطة محورية لنظم الليزر اثنين كانوا في نطاق 5.33 × 10-2-4 × 10-1 nJ و 7 × 1010-5.24 × 1011 ث/سم2، على التوالي32.

  1. تشغيل الليزر الجرد والسماح لنظام الليزر بالاحماء ح 1 قبل الاستخدام.
  2. ضع طبق من الخلايا في مرحلة ساخنة (37 درجة مئوية) في غرفة التي يسمح CO2 (5 في المائة) ومراقبة الرطوبة (100%).
    ملاحظة: إذا لم يتوفر دائرة2 CO، استخدام CO2-وسائل الإعلام المستقلة في الثقافة لتصل إلى 5-6 ح. إذا لم يتوفر مرحلة تدفئة، إبقاء الخلايا تحت المجهر < 20 دقيقة واستبدالها فورا إلى حاضنة استنبات الأنسجة بدرجة حرارة مناسبة وأول أكسيد الكربون2التحكم في الرطوبة. قد تختلف هذه الشروط الثقافة تبعاً لنوع الخلية المحددة المستخدمة فضلا عن الكائنات الحية الاشتقاق (مثلاً، الثدييات مقابل البرمائيات).
  3. تحليل الخلية الحية للمعلمة فلوريسسينتلي البروتينات، حدد عامل تصفية التجارة والنقل (450-490 نانومتر الإثارة، الانبعاثات نانومتر 515-586) أو تصفية Cy3 (540 552 نانومتر الإثارة، الانبعاثات > 590 nm) للتجارة والنقل أو البروتين تنصهر متشيري، على التوالي، استخدام 100 X أو X 63 النفط الغمر والهدف.
  4. البحث عن الخلايا التي تحتوي على إشارات fluorescence قابلة للمقارنة، مما يعكس مستويات مماثلة من البروتين التعبير. تجنب الخلايا التي تحتوي على التعبير ضعيفة جداً أو قوية جداً من أجل الحد من خلية إلى التغير في قياسات الأسفار.
  5. تيتراتي الليزر مدخلات الطاقة.
    1. 780 نانومتر نير الليزر يعلق على مجهر [كنفوكل]
      1. استخدم الدالة التبييض البرمجيات لاستهداف المسارات الخطية داخل نواة الخلية للتعرض للأشعة الليزر واحد (القرار 512 × 512 بكسل، التكبير X1، مقصور المنطقة 4 × 50 بكسل، المايكروثانيه 12.8 بكسل يسكن المرة، التكرار x1) عن طريق الهدف النفط (100 X/1.3 غ).
      2. ضبط نسبة انتقال الليزر (باستخدام البرمجيات ومعدات في صلب النظام مجهر الليزر حسب الشركة المصنعة) بنسبة 5% دون تغيير أي إعدادات أخرى.
      3. وضع خلية في وسط الميدان. انقر فوق المنطقة أداة الفائدة (العائد على الاستثمار)، ورسم خط أو مربع (حوالي 4 × 50 بكسل) في نواة باستخدام الماوس وانقر فوق الزر "التبييض" للحث على ضرر الحمض النووي.
        ملاحظة: في الخطوات اللاحقة التشعيع، "تبييض" ينبغي زيادة تزايدات 5% إلى 40% أو حتى 100% إذا لزم الأمر.
      4. 800 نانومتر نير الليزر يعلق على برنامج التحصين الموسع-الأسفار المجهر
      5. التحكم في مدخلات الطاقة عن طريق (63 X/1.4 غ) مرحلة التباين النفط الغمر الهدف من بالتناوب يجهز لمرشح الاستقطاب أدخلت في مسار الشعاع وشنت على32،مرحلة تناوب يجهز الكمبيوتر الذي يسيطر39 , 58.
      6. ضبط زاوية المستقطب (°) وقياس مدخلات الطاقة (mW) إدخال المجهر، باستخدام مقياس قوة ليزر. تحديد الزوايا المستقطب التي توفر صلاحيات الإدخال التي تتراوح من 20 ميغاواط-155 ميغاواط في تزايدات 5 10 ميغاواط.
      7. تعيين زاوية المستقطب الذي يتوافق مع 20 ميغاواط مدخلات الطاقة.
        ملاحظة: لنظامنا الليزر، إذا كانت الزاوية المستقطب 40 °، مدخلات الطاقة هو 65 ميغاواط. زيادة مدخلات الطاقة مع زيادات 5-10 ميغاواط.
  6. لتحليل الخلية الحية، انتقل إلى الخطوات 6.1 و 6.3. للكشف عن الفلورة البروتينات الذاتية أو إدخال تعديلات على المضي قدما إلى الباب 5. وبعد التحليل، انتقل إلى الخطوة 4.7 لمعايرة مزيدا من قوة الليزر. لتحليل شرط عامل المنبع، انتقل إلى القسم 7.
    ملاحظة: هو توظيف عوامل البر ونهيج السريع (في غضون بضع دقائق) وعابرة (< ~ 30 دقيقة-1 ح تبعاً لوظيفة عامل و < ~ 4 ح الضرر التعريفي، على التوالي). وفي المقابل، توظيف الموارد البشرية العوامل Rad51 وكوسين قابلاً للاكتشاف ~ 30 دقيقة-1 ح وأنها تميل إلى أن تستمر أكثر من 8 ساعات في الحمض النووي التي لم يتم إصلاحها آفات44،،من5051. وبالتالي، من الضروري دراسة زمنية مختلفة النقاط بعد التشعيع لإصلاح مختلف العوامل.
  7. زيادة مدخلات الطاقة بالزيادات المطلوبة (أي5% لليزر نير 780 و 5-10 ميغاواط نير 800) كما هو الحال في الخطوة 4، 4، وكرر الخطوات 4، 4، 5-7 على مجموعة جديدة من الخلايا لتحديد عتبة (50 في المائة توظيف وتظهر الخلايا التالفة) والذروة (100% لإظهار الخلايا التوظيف) لكل البروتين.

5-الفلورة تلطيخ

ملاحظة: للكشف عن البروتين التساهمية التعديل، مثل الاسمية (العلامة الأضرار معقدة) والفسفره H2AX (γH2AX) (جهاز تسوية المنازعات العلامة)، فضلا عن سيكلوبوتاني بيريميدين ديمر (CPD)/(6-4) برومة (6-4PP) و 8-أوكسوجوانيني (8-أوكسوج) (crosslinking و وقاعدة علامات الضرر، على التوالي)، يجب أن يكون إصلاح الخلايا وملطخة بأجسام مضادة محددة. وباﻹضافة إلى ذلك، فمن الأفضل للتأكد من النتائج التي تحققت مع البروتينات المؤتلف فلوريسسينتلي الموسومة بكشف الأجسام المضادة من البروتينات الذاتية، التمييز بين النتائج الملموسة الناجمة عن overexpression بروتينات الانصهار المؤتلف.

  1. إصلاح الخلايا عند نقاط زمنية مختلفة بعد الأضرار التعريفي (الخطوة 4، 5) اعتماداً على العوامل بالاستعاضة عن ثقافة وسائل الإعلام (راجع الخطوة 1، 1) مع 1.5 مل من 4% بارافورمالدهيد/1 X برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في الرايت
    تنبيه: بارافورمالدهيد أبخرة سامة وينبغي القيام بكل العمل في غطاء دخان التهوية.
  2. إزالة 4% بارافورمالدهيد/برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 0.5% من المنظفات الصناعية/برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في الرايت
  3. إزالة خلايا المنظفات الصناعية/برنامج تلفزيوني وشطف 0.5% مع 2 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مرتين، واحتضان خلايا في 2 مل من عرقلة الحل (مصل العجل 10 ٪، 1 ٪ جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني) ح 1 في الرايت
  4. إزالة الحل حظر وإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني للخلايا، ويحل محل برنامج تلفزيوني مع 250 ميليلتر جسم الابتدائي حل 3% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو ح 1 في استخدام الرايت 1: 200-تمييع 1: 500 (تركيز نموذجي حوالي 1 ميكروغرام/مل، يحدد تجريبيا) للأجسام المضادة محددة لمختلف علامات تلف الحمض النووي (مثلاً، γH2AX/53BP1 (جهاز تسوية المنازعات)؛ كو (جهاز تسوية المنازعات، ونهيج)؛ Rad51/كوسين (جهاز تسوية المنازعات، والموارد البشرية)؛ وثيقة البرنامج القطري/6-4PP (crosslinking الضرر)؛ 8-أوكسوج/الحمض النووي جليكوسيلاسيس (مثلاً، NTH1) (قاعدة الضرر)؛ الاسمية (جرعة عالية الضرر معقدة)).
  5. إزالة الحل جسم وشطف مع 2 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مرتين، إزالة برنامج تلفزيوني، واحتضان مع 250 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوي 0.1% في 3% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني عن ح 1 في الظلام في الرايت
  6. إزالة الحل جسم الثانوي وإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مرتين وإبقاء الخلايا في 1.5-2 مل برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية للتصوير في خطوات 6.1 و 6.2.

6-الكمية Fluorescence تحليل إيمونوستينيد أو الخلايا الحية

  1. التقاط صور للخلايا الحية أو الملون (ن > 10) باستخدام مجهر المستخدمة للإشعاع. للنظام مجهر الأسفار برنامج التحصين الموسع، استخدم القرار 1,344 x 1,024 بكسل وحفظ الصور كملفات TIFF 16-بت. استخدام مجهر [كنفوكل]، 1 X التكبير؛ ليزر الأرغون للتجارة والنقل/فيتك، 594 زناد الليزر Cy3/متشيري؛ 512 × 512 أو 1,024 x 1,024 بكسل لصورة القرار؛ تفحص سرعة 5، رقم: 1 لفحص سريع أو + 2 للمتوسط عبر مسح متعددة لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء.
  2. استخدام تحليل صورة البرامج المصممة لقياس كثافة بكسل.
    1. استخدام "أداة المستطيل وحدة التخزين" لرسم عائد حول موقع الضرر في صورة خلايا فردية. استخدام نفس حجم العائد على الاستثمار لقياس الإشارات الخلفية fluorescence في نوكليوبلاسم المجاورة، ولكن ليست متداخلة مع مواقع الضرر. وهذا مهم لتطبيع فوتوبليتشينج المرتبطة بنظام المجهر غير [كنفوكل].
    2. لقياس إشارات الأسفار باستخدام برنامج تحليل الصورة، انقر فوق "تقرير تحليل وحدة التخزين" الموجودة في مربع الأدوات. سوف تظهر نافذة جديدة. ضمن المقطع "لعرض البيانات"، إلا "الاسم" و "الكثافة" خانات الاختيار. ثم انقر فوق "تم" لتصور القياسات.
    3. تصدير القيم إلى برنامج جدول بيانات عن طريق النقر على أيقونة الجدول وجدت في الجزء السفلي من إطار "حجم التقرير" وحدد "علامات التبويب (تنسيق excel)" لفواصل الحقل و "ملف" "تصدير الوجهة".
    4. للحصول على إشارات النسبي، استخدم برنامج جدول بيانات لتقسيم شدة الأسفار في موقع الضرر (العمود 1) بأنه في عنصر التحكم خلفية المنطقة (عمود 2) في نوكليوبلاسم واطرح 1 لتطبيع.
  3. تحليل الوقت بالطبع fluorescence الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر [كنفوكل]
    1. تحدد المعلمة فلوريسسينتلي البروتين-إيجابية الخلايا باستخدام المجهر كما في الخطوة 4، 3.
    2. أداء fluorescence الوقت الفاصل بين التصوير قبل الضرر وفي نقاط زمنية مختلفة بعد التعريفي الضرر في القسم 4. أولاً رسم التبييض عائد الاستثمار (لتحريض الضرر)، ثم حدد "اكتساب > السلاسل الزمنية" قائمة فرعية، على النحو '' عدد '' 20، و "تأخير دورة" ك 30 s، اختر "التبييض مرة بعد الفحص الأولى" ومن ثم النقر فوق "البدء ب". وفي هذه الحالة، تكتسب الصورة الأولى مباشرة قبل التعريفي الضرر، تليها 19 صورة التملك في فاصل s 30. فواصل ("تأخير دورة") يمكن أن تتغير تبعاً لغرض الدراسة.
    3. بمجرد اكتمال الحصول على الصور، انقر فوق "تعني"، ورسم العائد على الاستثمار في منطقة الضرر. انقر فوق "إظهار جدول" للحصول على قائمة بالكثافة داخل رويس المحدد. تطبيع البيانات بقسمة شدة الأسفار موقع الضرر في نقاط زمنية مختلفة بالكثافة من نفس المنطقة قبل الضرر، وطرح 1.

7-صغير التدخل من الحمض النووي الريبي (siRNA) تعداء

ملاحظة: نضوب البروتين المستهدف طريقة فعالة لتحديد شرط عامل المنبع لتعيين البروتين الملاحظة إتلاف مواقع (القسم 4). وعلاوة على ذلك، الاستراتيجية هو أفضل طريقة للتصدي لخصوصية جسم مضاد يستخدم للكشف عن الفلورة (انظر القسم 5).

  1. يوم 1: إعداد الآبار 2 خلايا هيلا في صفيحة 24-جيدا قبل البذر 6-8 × 10 خلايا هيلا4 في 0.5 مل الثقافة الإعلامية في كل بئر وواحد لعنصر التحكم siRNA تعداء وواحدة ل PARP1 siRNA (5 '-سی أغا محكمة الاستئناف الإدارية لجنة مكافحة الإرهاب TTA CCT الجهاز المركزي للمحاسبات-3').
  2. يوم 2: التأكد من أن الخلايا حوالي 40-50% روافد. إجراء الجولة الأولى من تعداء siRNA: إضافة 3 ميليلتر الدهون على أساس كاشف تعداء في الأنبوب siRNA pmol تخفف من 5 إلى 25 ميليلتر من وسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل، والمزيج بلطف واحتضانها لمدة 5-10 دقيقة في الرايت
  3. شطف الخلايا مع وسائط ثقافة جديدة 0.5 مل مرة واحدة، وإبقاء الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة جديدة 0.5 مل (راجع الخطوة 1، 1).
  4. إضافة مجمعات الجيش الملكي النيبالي-الدهن في الخلايا، وتخلط بلطف بإمالة الطبق ذهابا وإيابا. وضع الخلايا في الحاضنة كما في الخطوة 2، 1.
  5. نضح مزيج تعداء، وإضافة 0.5 مل الطازجة الثقافة الإعلامية (الخطوة 1، 1) بعد ح 6.
  6. يوم 3: إجراء الجولة الثانية من ترانسفيكشنز siRNA (راجع الخطوة 7، 2). ثم البذور 60-100 ٪ الخلايا إلى طبق ساترة الشبكية 35 ملم كما هو موضح في الخطوة 2، 3.
  7. اليوم الخامس: المضي قدما في ميكرويرادييشن الليزر باستخدام حالة طاقة الليزر الأمثل لتعيين الحد الأقصى للعامل الفائدة، كما تحددها المادة 4. عادة، يمكن ملاحظة استنفاد كفاءة في حوالي 60-90% خلايا هيلا.
    ملاحظة: كبديل ومكمل النهج، مثبطات، إذا كانت متوفرة، يمكن استخدام لتمنع وظيفة عامل الفائدة32،44. لتحليل أثر إعاقة إشارات التسريح وإعادة الإدماج، إضافة 20 ميكرومتر نشطت المانع، 1 ميكرومتر PAR جليكوهيدرولاسي (PARG) المانع، أو 10 ميكرون تعتمد على الحمض النووي البروتين كيناز مع مثبط الحفاز وحدة فرعية (الحمض النووي-PKcs) و 10 ميكرون ATM المانع في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) إلى أطباق ح 1 قبل التعريفي الضرر. إضافة [دمس] فقط إلى خلايا عنصر التحكم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام خلايا PtK2 ستابلي معربا عن اجفب-53BP11220-1711 أو TRF2-يفب، أجريت معايرة مدخلات الطاقة الليزر لتحديد الشرط الأمثل ل التوظيف (الشكل 1) على32.

في مواقع عالية المدخلات-السلطة الليزر الضرر، لوحظت تجميع كبيرة من وثيقة البرنامج القطري (crosslinking الضرر عادة إنشاؤها بواسطة الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضرر) فضلا عن جليكوسيلاسي التجارة والنقل-NTH1 "الحمض النووي" أن يسلم على وجه التحديد قاعدة الضرر. وباﻹضافة إلى ذلك، لوحظت إشارات XRCC1 وكتب أعلى، مما يعكس زيادة عدد فواصل ستراند، ومما يدل على أن فعل ضرر الحمض النووي المعقدة تحت هذا الشرط (الشكل 2A). جليكوسيلاسيس الحمض النووي الأخرى تنصهر فيها البروتينات الفلورية (مثلاً، والتجارة والنقل-نيي اندونوكلياسي مثل الثامن 2 (NEIL2) والتجارة والنقل-8-أوكسوجوانيني جليكوسيلاسي (OGG1)) فضلا عن كوندينسين أنا يمكن أن تستخدم أيضا كقاعدة الضرر علامات44،59. واتساقا مع ذلك، وجدنا أن رد الاسمية هو الناجمة إلى حد كبير الليزر مدخلات الطاقة العالية (أيالطاقة والإشعاع في النقطة المحورية في العينة)، لكن ضعيف فقط بالليزر منخفض الطاقة في بقعة المحورية (الشكل 2B، أعلى اليسار). إشارات اسمية، ولكن لا PARP1 البروتين التعريب، في مواقع الأضرار كانت حساسة للمانع نشطت (البيانات لا تظهر). بالإضافة إلى ذلك، تضاءلت siRNA محددة ل PARP1 PAR و PARP1 في مواقع الضرر (الشكل 2B، أعلى اليمين)32. بشرط ارتفاع مدخلات الطاقة، γH2AX يظهر في البداية في مواقع الضرر، وتنتشر بسرعة إلى نواة أسرة بطريقة الصراف إلى/الحمض النووي-كيه--تعتمد على (الشكل 2B، أسفل). وذكر مماثلة أجهزة الصراف الآلي/الحمض النووي-PK-تعتمد على نشر γH2AX γ-التشعيع60. تم الحصول على نتائج متسقة مع كل 800 و 780 نانومتر نير الليزر أنظمة32. وتكشف النتائج مجتمعة، أنه من الممكن تيتراتي الليزر مدخلات الطاقة (وبالتالي الطاقة والإشعاع في بقعة التنسيق في الخلية) لإيجاد الظروف التي تسبب درجات مختلفة من استجابة عملية ربط مع عدد دسبس تعقد تلف الحمض النووي.

النتائج المذكورة أعلاه اقترح في البداية أن وجود مجمع الحمض النووي الضرر قد تسببت في تجنيد فرق من 53BP1 و TRF2. من المثير للاهتمام، بيد تجنيد1220-1711 53BP1 إلى موقع أضرار الطاقة المنخفضة كانت فعالية تحول دون وجود الموقع الثاني الأضرار الناجمة عن السلطة-عالية-المدخلات في نواة الخلية نفسها (الشكل 3A خلافا الشكل 3B ). وتبين النتائج أن يمنع ضرر الليزر عالية-المدخلات-السلطة 53BP1 التوظيف في ترانس. تثبيط PAR المانع نشطت فضلا عن تثبيط γH2AX النووية على صعيد نشر من خلال أجهزة الصراف الآلي/الحمض النووي-PK مثبطات استعادة هذا التعيين حتى إلى موقع الضرر مدخلات الطاقة العالية (الشكل 3A). وهذا يختلف عن تعيين وسيط للحمض النووي الضرر حاجز 1 (MDC1) إلى مواقع الضرر، الذي كان يعوق أساسا بالتشتت γH2AX، وذلك، أعيدت بأجهزة الصراف الآلي/الحمض النووي-PK مثبطات، عدم تسنى المانع (الشكل 3 ألف، أسفل). الأهم من ذلك، هايبراكتيفيشن PAR بتثبيط PARG (بدون التأثير على حالة γH2AX) قمعت فعالية التوظيف الأولية 53BP1 حتى في مواقع منخفضة الطاقة الإدخال الأضرار التي تجند عادة 53BP1 كفاءة (الشكل 3B)32. أخذت معا، هذه النتائج تشير إلى أن إشارات الاسمية، وليس نوع من الضرر في حد ذاته، يتداخل مع تجنيد 53BP132. وهذا مثال على براعة ميكرويرادييشن الليزر، مما يسمح لنا بالنظر في كيفية العديد من مواقع الضرر التأثير وتتفاعل مع بعضها البعض.

Figure 1
الشكل 1 : معايرة الليزر مدخلات الطاقة. لتحديد قوة الليزر لاستخدامها للتجارب المقبلة، PtK2 الخلايا ستابلي معربا عن اجفب-53BP1 و TRF2-يفب تعرضوا لليزر ميكرويرادييشن مع الإدخال القوى تتراوح ما بين 20 ميغاواط و 155 ميغاواط 800 نانومتر نير الليزر/مقلوب برنامج التحصين الموسع-الأسفار باستخدام نظام المجهر. تم رصد تجنيد اجفب-53BP1 لمدة 15 دقيقة بعد التشعيع (بي)، بينما تم اتباعها الخلايا TRF2-يفب بي 6 دقيقة تمثل الأرقام مباشرة فوق القضبان عدد الخلايا التي أظهرت التوظيف الإيجابي اجفب-53BP1 أو TRF2-يفب إلى مواقع الضرر على العدد الكلي للخلايا التي تم اختبارها. تم تعديل هذا الرقم من كروز ساكويلابون32. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : الحث من أضرار المعقدة والتسريح وإعادة الإدماج قوية مما يشير إلى ارتفاع مدخلات الطاقة الليزر. (أ) ميكرويرادييشن ليزر عالية-المدخلات-السلطة يدفع الضرر المعقدة بما في ذلك فواصل حبلا (SSBs ودسبس)، كروسلينكينج، وقاعدة الضرر. وثيقة البرنامج القطري، XRCC1 (تضمين أحادي الجانب وجهاز تسوية المنازعات إصلاح)، NTH1 DNA glycosylase (البر)، وكتب (نج البديلة والموارد البشرية) وترد (فقط بروتينات فلورية خضراء-NTH1 صورة خلية حية وتحترم بقية على أثر تلطيخ الفلورة). يرد في بوكسبلوتس قياسات كثافة fluorescence الكمي لتعيين موقع الضرر وتم القيام به كما ورد في المادة 7 من البروتوكول. العدد الإجمالي للخلايا (ن) اختبار يمكن رؤيتها تحت كل البروتين كمياً. فقيمه < 0.05. (ب) أعلى (يسار): إشارات قوية الاسمية و PARP1 في مواقع عالية الطاقة الإدخال الضرر. أعلى (يمين): استنفاد siRNA PARP1 غير كافية لإلغاء ال32،PAR إشارة44. أسفل: إدخال الوقت بالطبع تحليل γH2AX في الخلايا مع منخفضة (أعلى) وعالية (أسفل) أضرار الطاقة كما هو مبين. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من كروز ساكويلابون32. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تفعيل التفاضلية للتسريح وإعادة الإدماج إشارات يؤثر على تجنيد 53BP1 أضرار المواقع. (أ) أعلى: الخلايا PtK2 ستابلي معربا عن اجفب-53BP11220-1711 تم ميكرويرادياتيد مع منخفضة (15 ٪) وعالية (25 في المائة) مدخلات الطاقة (الأبيض والأصفر رؤوس الأسهم، على التوالي) في نواة نفسها باستخدام نظام المجهر نير/[كنفوكل] 780 نانومتر. وأجرى هذا حضور [دمس]، نشطت المانع (Pi)، أو المزيج من أجهزة الصراف الآلي، PK الحمض النووي، ونشطت مثبطات (منظمة العفو الدولية + Di + Pi) كما هو مبين. تم القبض على خلية يعيش التصوير من اجفب-53BP11220-1711 في 30 دقيقة بعد التعريفي جهاز تسوية المنازعات. ثم الخلايا الثابتة وملطخة بجسم معين ل γH2AX كعلامة جهاز تسوية المنازعات. وتظهر التغييرات من شدة الأسفار من اجفب-53BP11220-1711 في مواقع الضرر على اليمين مع فالقيم (يعني القيم: [دمس]، ± 0.03 0.02؛ Pi، 0.34 ± 0.19؛ منظمة العفو الدولية + Di + Pi، 0.98 ± 0.23). أسفل: تأثير العلاج بي ومنظمة العفو الدولية + دي في الترجمة MDC1 مع ارتفاع مدخلات الطاقة الضرر كما هو مبين. شريط مقياس من 10 ميكرون. حق: التغييرات من إشارات الأسفار من MDC1 في ارتفاع مدخلات الطاقة تلف مواقع حضور [دمس] أو بي دي + منظمة العفو الدولية مع فالقيم (يعني القيم: [دمس]، ± 0.07 0.10؛ Pi، 0.05 ± 0.07؛ منظمة العفو الدولية + دي، 0.86 ± 0.26). شريط المقياس = 10 ميكرون. N = 10 لكل قياس كثافة. (ب) أثر تعزيز PAR إشارات بمعاملة بارجي على تجنيد 53BP1 الذاتية إلى مواقع منخفضة الطاقة الإدخال الضرر. حق: بوكسبلوتس يمثل التحليل الكمي للتوظيف 53BP1 الذاتية (الكشف عن طريق تلطيخ الفلورة) مع الليزر مدخلات الطاقة المنخفضة (60 ميغاواط في 800 نانومتر نير مقلوب الليزر/برنامج التحصين الموسع-الأسفار مجهر النظام) في 15 دقيقة بعد التشعيع بحضور [دمس] أو بارجي كما هو مبين. اليسار: الاسمية و 53BP1 الفلورة تلوين صور خلايا التالفة في نفس الظروف مع العلاج [دمس] أو بارجي. لعلاج [دمس]، فحص 100% خلايا (N = 25) عرضت توظيف قوي 53BP1 (يمين). وفي المقابل، أظهر 20/25 لا تجنيد 53BP1 حضور بارجي (أسفل اليمين)، والخلايا 5 أظهرت التوظيف ضعيفا. شريط المقياس = 10 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من كروز ساكويلابون32. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مزايا استخدام الليزر ميكرويرادييشن للتسريح وإعادة الإدماج للبحث:

1-من الممكن للحث على أنواع مختلفة وكميات من الحمض النووي الضرر من فواصل حبلا بسيط إلى مجمع الحمض النووي الضرر، والضرر إصلاح مختلف العوامل في الحمض النووي للكشف عن المواقع بضبط المعلمات إشعاع الليزر. من الممكن أيضا أن تلحق أضرارا عدة مرات في نواة الخلية نفسها من أجل تقييم الآثار العابرة (كما هو الحال في الشكل 3).

2-الأهم من ذلك، يمكن بسهولة تمييز الأحداث يحدث في مواقع الأضرار والأحداث الثانوية التي تحدث في أماكن أخرى في النواة.

3-ومن الممكن القيام بقياسات عالية الدقة في الوقت الحقيقي لديناميات البروتين فلوريسسينتلي الموسومة استجابة للضرر على مستوى خلية واحدة، بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على: فورستر الرنين الطاقة نقل (الحنق)، (Fluorescence عمر التصوير فليم)، "زوج ارتباط دالة" (الحزب الشيوعي الفرنسي)، إلخ، للقبض على التسريح وإعادة الإدماج في الخلايا الحية.

4. الجمع بين العلاج التدخل أو مثبط الحمض النووي الريبي، بسيط نسبيا لاختبار شرط عامل المنبع في عدد صغير من الخلايا.

5-وينبغي أيضا وأشار إلى أن قوائم الجرد الوطنية (أو الأخضر) إشعاع الليزر لا تتطلب التوعية قبل الحمض النووي مع النظير النوكليوتيدات أو الأصباغ إينتيركالاتينج الحمض النووي، وبالتالي تجنب غير المرغوب فيه الآثار الجانبية على التعبئة الكروماتين. وهذا على نقيض النظام الليزر الأشعة فوق البنفسجية يتطلب التوعية في الجرعات المنخفضة والتي تسبب DDR الشاذة في جرعة عالية39،،من4961.

الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول/التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
من المهم أن الخلايا يتم في ظروف صحية عندما يتم إجراء تحليلات للتسريح وإعادة الإدماج بغية التقليل من القطع الأثرية والاختلافات التجريبية. الحمض النووي أو siRNA transfected الخلايا عادة ما تكون أكثر حساسية أو منفصلة بسهولة عندما تنمو على ساترة الشبكية. أنه يساعد على إبقاء الخلايا لأوقات أقصر في الكاشف تعداء طالما يعمل تعداء، والبذور أكثر transfected الخلايا على الطبق ساترة الموزعة بالمقارنة بالخلايا أونترانسفيكتيد. وهذا ضروري لتحقيق كونفلوينسيس خلية قابلة للمقارنة للتجارب.

وأفيد أن كتلة thymidine يؤدي إلى زيادة مستويات γH2AX في خلايا متزامنة62، التي قد تؤثر على التسريح وإعادة الإدماج وتحرف النتائج. وعلاوة على ذلك، أبدى إشارة γH2AX خط الأساس تكون أعلى في المرحلة S و G2/M حتى بدون أي أضرار خارجية63،64. ، ومع ذلك، لا نلاحظ أي إشارة هامة γH2AX في نوكليوبلاسم التي من شأنها أن تؤثر على أو تتداخل مع استجابة γH2AX محددة في مواقع الأضرار التي يسببها الليزر في الخلايا متزامنة في المرحلة S/G2 ب كتلة thymidine مزدوجة51.

من أجل الحصول على نتائج متسقة، من الضروري فحص دوري لمعلمات الإخراج نظام ليزر (كل 2 إلى 4 أسابيع) والمحاذاة الضوئية (كل شهرين). مع مرور الوقت، مكونات نظام ليزر قد تحتاج إلى إعادة محاذاة عدسة الهدف قد تكون معطوبة وتحتاج إلى استبدال واستقرار مدخلات الطاقة الإجمالية قد تغير. المفتاح لتقييم وجود الضرر (crosslinking (وثيقة البرنامج القطري و/أو 6-4PP) وقاعدة الضرر (8-أوكسوج))، والبروتينات ماركر (مثلاً، جليكوسيلاسيس الحمض النووي، Rad51، كوهيسين، وكو)، وتعديل الاسمية المبينة في هذا البروتوكول لتحديد الجرعة و تعقد تلف الحمض النووي الناجم عن النظام مجهر الليزر المستخدمة.

القيود المفروضة على هذه التقنية
ميكرويرادييشن الليزر على القيود. ويتجمع تلف الحمض النووي الناجم عن أشعة الليزر عالية في مجال واحد في نواة طبيعيا بالمقارنة مع الأضرار التي قد تنتشر في جميع أنحاء النواة. قد يتغير هذا كيف يتم نشر إشارات الضرر في الكروماتين المجاورة أو في النواة. حيث يمكن أن يكون المشع عدد قليل نسبيا من الخلايا في وقت واحد، لا يمكن إجراء فحوصات الكيمياء الحيوية المستندة إلى السكان (مثلاً، لطخة غربية، وتنقية البروتين المعقدة، الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة)) بسهولة. الاعتماد على البروتينات فلوريسسينتلي الموسومة (مع تعبير البروتينات المؤتلف خارجية أو حتى مع تلك التي أعرب عن اندوجينوسلي باستخدام العلامة بوساطة كريسبر الإدراج) لتصوير ديناميكي يجعل الدراسات الضعيفة للبروتين التي يسببها الانصهار القطع الأثرية. الطابع الفريد للأضرار التي يسببها الليزر والآثار أرتيفاكتوال المحتملة للمعلمة البروتينات، ولذلك، يجب تقييم مقارنة النتائج باستخدام الحمض النووي التقليدية إتلاف أساليب (الأشعة تحت الحمراء، إتلاف العوامل الكيميائية) ومع الذاتية ليس تمييز البروتينات (على الرغم من أن في بعض الأحيان من غير الممكن القيام بتجارب موازية كاملة).

أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة
ويوفر استخدام اندونوكليسيس الخاصة بتسلسل مثل-اسوسﺗﻴﻚ فوكي، أسيسي و--بوي استراتيجية بديلة لحمل دسبس الخاصة بالموقع (دسبس دقة بسيطة). يمكن تحليل عامل التعيين أو التعديلات الخاصة بالموقع أو على نطاق الجينوم رقاقة تحليل65،66،67،،من6869. تحريض دسبس متزامن نسبيا يمكن أن يتحقق بوضع علامات اندونوكليسي مع مستقبلات هرمون ستيرويد وإشارة تدهور (ديجرون) إزفاء النووي السريع والتدهور، على التوالي65،66 , 67 , 68 , 69-واحد يجب أن تأخذ في الاعتبار، بيد أن كفاءة اندونوكلياسي التعبير والوصول إلى الموقع المستهدف، ومركز الإصلاح الجارية يمكن أن يكون متغير في خلايا مختلفة وفي مواقع مستهدفة مختلفة. سوف بلغ متوسط هذه التغاير في تحليل رقاقة المستندة إلى السكان، التي قد تحرف النتائج. من ناحية أخرى، يقدم ميكرويرادييشن الليزر، أعلى دقة الزمنية الممكنة (مللي ثانية) فضلا عن القرار المكانية (سوبميكروميتير) لديناميات استجابة الأضرار، التي يمكن تحليلها على مستوى خلية واحدة. كثافة عالية من الضرر، ومع ذلك، قد تؤثر النتائج. يمكن أن تكون كلتا الاستراتيجيتين الحساسة إلى النتائج الملموسة الناجمة عن إمكانية الوصول إلى جسم و/أو علامات الببتيد. ولذلك، فإنه من المهم فهم إيجابيات وسلبيات كل الاستراتيجيات التي يمكن استخدامها ليكمل كل منهما الآخر.

التطبيقات المستقبلية
مع التقدم السريع للتصوير بالأسفار وتقنيات حيوية، تعدد نظم الليزر لحمل كميات مختلفة وأنواع الضرر الحمض النووي في أماكن محددة ومرحلة دورة الخلية يوفر فرصة ثمينة لاستجواب الخلوي و الاستجابات الجزيئية للحمض النووي الضرر مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية على مستوى خلية واحدة. الممكن، على سبيل المثال، ندف من أضرار خاصة بالموقع والنواة والخلية-على صعيد الإدماج إشارة توصيل مع دقة ميلي ثانية واحدة (مثلاً، كشف بحث التفاعلات الجزيئية أو التعديلات التي تقع حصرا على مواقع الضرر، التغيرات الدينامية لهيكل الكروماتين في الوقت الحقيقي، أو مراقبة ينتشر في الوقت الحقيقي الضرر إشارات من مواقع الضرر إلى نواة كاملة). من الممكن أيضا اتباع نفس الخلية على مدى فترة طويلة من الوقت لدراسة آثار تلف الحمض النووي على مصير الخلية. ونحن نتصور أن أساليب ميكرويرادييشن الليزر، إذا ما استخدمت بشكل صحيح، ستواصل الإسهام إلى حد كبير في النهوض بمجال إصلاح الحمض النووي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر الدكتور أكيرا ين في جامعة توهوكو باليابان بلازميد تعبير بروتينات فلورية خضراء-NTH1، والدكتور دينتشي لازيريني إيروس في معهد أبحاث سكريبس، في لاجولا بكاليفورنيا يفب TRF2 واجفب-53BP11220-1711 التعبير والبلازميدات. هذا العمل كان يدعمها مكتب القوات الجوية للبحث العلمي (FA9550-04-1-0101) ومؤسسة وشركة معهد الليزر بيكمان (إلى M.W.B)، وزمالة مؤسسة فورد من الأكاديمية الوطنية للعلوم (B.A.S)، والمجلس جبهة الخلاص الوطني-1615701 والمؤسسة CRR-17-426665 (إلى "ك. ص".).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

علم الوراثة، ومسألة 131، ميكرويرادييشن الليزر، الليزر في الطب، تلف الحمض النووي، استجابة ضرر الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي، بوليميراز بولي (ADP-ريبوز) (تسنى)، الأضرار معقدة، حبلا فواصل، قاعدة الضرر
ميكرويرادييشن الليزر لدراسة <em>في فيفو</em> الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B.… More

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter