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Genetics

激光 Microirradiation 研究体内细胞对简单复杂 DNA 损伤的反应

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56213
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2,3,4, 1
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

该协议的目的是描述如何使用激光 microirradiation 诱导不同类型的 dna 损伤, 包括相对简单的断链和复杂的损害, 研究 dna 损伤信号和修复因子在损伤部位的组装在体内.

Abstract

DNA 损伤诱导细胞的特定信号和修复反应, 这对保护基因组完整性至关重要。激光 microirradiation 成了研究 DNA 损伤反应 (DDR)体内的有价值的实验工具。它允许实时高分辨率的单细胞分析大分子动力学, 以响应激光诱导的损伤局限于微米区域的细胞核。然而, 不同的激光条件已被使用, 不了解不同类型的损害引起的差异。因此, 损害的性质往往没有很好的特征或受到控制, 造成征聘或修改资料中明显的不一致。我们证明, 不同的辐照条件 (即, 不同的波长, 以及不同的输入功率 (度) 的飞秒 (fs) 近红外激光) 诱导不同的 DDR 和修复蛋白组件。这反映出 DNA 损伤的类型。该协议描述了如何滴定激光输入功率, 使不同数量和复杂的 DNA 损伤, 可以很容易地监测通过检测基地和交联损害, 差异聚 (ADP-核糖) (PAR) 信号,损伤部位的通路特定修复因子组件。一旦确定了损伤条件, 就有可能研究不同损伤复杂度和差异损伤信号的影响以及上游因素对任何感兴趣因素的损耗。

Introduction

在体内DNA 损伤信号不太清楚
在体内, DNA 与组蛋白和其他因素复合形成染色质纤维。染色质结构的调节对 DNA 代谢至关重要。例如, 组蛋白变体 H2AX 是由共济失调-扩张突变 (ATM) 和其他激酶后的双链断裂 (争端) 诱导磷酸化, 是重要的争端处理的损害信号放大, 以及提供一个对接地点的其他因素.损伤信号的传播和修复途径的选择似乎受到局部染色质结构的严重影响1。一些染色质重塑因子, 组蛋白的陪护, 和组蛋白修饰酶确实被招募到破坏地点, 是重要的有效的 DNA 修复, 突出了染色质调节的意义在 DDR 和修复2,3,4. 此外, 在酵母和果蝇5,6,7,8中观察到的损伤站点聚类或重新定位, 让人联想到孵育的基因座与基因调控相关的层次室9,10。最近在老鼠和人类细胞中的研究也显示了对争端修复点的动员, 这影响了维修保真度和路径选择11,12。这就增加了 DDR/修复也可能与核结构、高阶染色质组织和细胞核内的染色体动力学紧密相连的可能性。因此, 必须发展高分辨率的方法, 以研究在活细胞内核环境的背景下的 DDR 和修复过程, 以便了解 DNA 损伤的短期和长期后果。

PAR 聚合酶 (PARP) 在测量损伤部位的损伤程度和类型以及调节蛋白质组装方面的关键作用
PARP1 是 dna 尼克传感器迅速激活 dna 损伤, 在 dna 修复13中扮演关键角色。PARP1 最初被认为与 X 射线修复交叉配合 1 (XRCC1), 以促进基础切除修复 (BER), 但最近的研究显示它的作用在其他 DNA 修复途径, 包括争端修复14。活化 PARP1 使用烟酰胺腺嘌呤核苷酸 (和+) 作为基板, 以 ADP-ribosylate 多靶蛋白, 包括本身。近年来, 这种酶和其他家族成员引起了人们的广泛关注, 因为 PARP 抑制剂已经成为一种有前途的癌症治疗药物。虽然 PARP 抑制剂最初被发现是有效的乳腺癌基因 (BRCA)-突变乳腺癌细胞, 现在有大量的证据, 他们的影响, 在单一和联合治疗与 DNA 损伤的代理人/辐照广泛的癌症的突变不限于 BRCA15,16,17,1819。

在分子水平, PARP 活化被证明在组织地方染色质结构在损伤站点扮演重要角色。依赖于标准的染色质修饰酶的招募促进了争端修复, 并决定了修复路径的选择, 这表明了在损伤部位进行 par 修饰的重要脚手架作用。 13 ,21,22,,24,25,26,2728,2930,31我们最近演示了将 p53-binding 蛋白 1 (53BP1) 从损坏点排除在 PAR 32之外, 为非同源 endjoining 的53BP1 依赖 hyperactivation 提供了另一种解释 (NHEJ) 通过 PARP 抑制剂和突出 PARP 的意义在争端修复路径选择33,34。PARP1 也直接 PARylates 并影响多种 DNA 修复因子的活性14。

使用激光 Microirradiation 作为一种工具来研究 DDR/修复在体内
在 1969年35中首次描述了激光 microirradiation 在单个染色体上产生亚微米的变化, 并在1981年的36中进行了详细的回顾。几十年后, 激光 microirradiation 被证明是诱导 dna 损伤在一个明确的微米区域的细胞核, 并被证明是一个有价值的技术, 研究招募或修改各种因素的 dna 损害在体内13,37,38,39,40,41. 此方法允许检测未形成明显辐射诱发病灶 (IRIF) 在损伤部位的那些因素39,42。也可以在损伤部位和细胞核的其余部分研究染色质结构变化的时空动力学。我们仔细比较了不同激光系统诱导的 ddr 和输入功率, 以评估 DNA 损伤类型与 microirradiation 条件之间的关系32,43,44, 45。在先前的激光损伤研究中观察到了53BP1 和端重复约束因子 2 (TRF2) 的异常招聘模式, 这为激光损伤的 "非生理性" 特性的反复关注提供了依据46 ,47,48,49。我们发现, 这些明显的差异现在可以解释的差异 PARP 信号, 测量的数量和复杂的诱导损害32。我们证实: 1) 激光 microirradiated 细胞 (即使在高输入功率辐照后) 在界面中以损伤检查点控制的方式被逮捕, 并且保持可行 (至少 48 h)32,50;和 2) 修复因子的招募/修改忠实地重述那些观察与常规 DNA 损伤药物和争端处理酶32,39,42, 44、50、51、52。这些结果强烈支持研究激光损伤诱导的细胞反应的生理相关性。

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Protocol

1. 碱性细胞制备

注意: 这一步是为标准免疫荧光检测内源性蛋白质的招募或修改, 并为使用细胞系稳定表达荧光标记重组蛋白。例如, Potorustridactylus (PtK2) 袋肾上皮细胞稳定表达 EGFP-53BP11220-1711或 TRF2-YFP 在我们以前的研究 (图 1)32中使用。在前一种情况下, 53BP1 (氨基酸 1220-1711) 的焦点形成区, 其中包含的齐聚域, 都铎域, 和化依赖的招募 (UDR) 的主题, 被融合到增强 GFP (EGFP-53BP11220-1711)。这种融合蛋白重述的损伤现场招聘的全长 53BP153,54,55。在 HeLa 细胞中, 荧光标记的内聚力子单元 (例如、hSMC1-GFP51、GFP-Scc1 (Rad21)52和 GFP-SA2 51) 必须稳定地表达, 以确保有效地融入到复合体中, 并重述S/G2 细胞周期特定损伤部位的内源性内聚力的招募51。

  1. 种子任何附着的细胞类型到一个35毫米的组织培养皿与格片, 以允许单独的细胞识别。根据特定细胞系的增殖速率, 调整初始细胞数以达到36-48 小时内的 60% 70-100。例如:
    1. 为 PtK2 袋肾上皮细胞 (狂放的类型或那些稳定地表达 EGFP-53BP11220-1711或 TRF2-YFP): 在 2 mL 高级最低必需培养基 (记忆) 中板 2.0 x 104细胞补充2毫米 l-谷氨酰胺, 4% 胎牛血清 (FBS) 和抗生素 (100 U/毫升青霉素和100µg/毫升链霉素), 并孵育在37° c 与 7% CO2。
    2. 对于稳定表达荧光标记重组蛋白的 HeLa 细胞 GFP-SA2: 种子 1.0 x 105细胞在2毫升 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 补充 10% FBS, 2 毫米 l-谷氨酰胺, 100 U/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素,和孵育在37° c 与 5% CO2。其他 HeLa 细胞也可用于包括未修饰的细胞或表达 hSMC1-GFP 的细胞。
  2. 允许细胞坚持和增殖36-48 小时前 DNA 损伤诱导在30-60% 汇合 (允许可视化网格数)。进入4条。

2. 瞬态转染

注意: 有时, 好的抗体不能用于检测内源性蛋白质。如果不具备稳定表达标记蛋白的细胞系, 可进行瞬态染监测荧光标记蛋白的活细胞分析。

  1. 对于 HeLa 细胞, 在1天, 种子 6-8 x 104细胞在0.5 毫升培养基中的 24-井板中, 在100% ° c 和 37 CO5%中孵育, 并在一只很好的2个平板中孵化。有关区域性媒体条件, 请参见步骤1.1。
  2. 2天, 使用哺乳动物表达质粒编码荧光标记的 DNA 修复因子 (例如, GFP-NTH1 或 GFP-OGG1 基损伤32,44,56, GFP-Ku 为高剂量 DSBs57, GFP-53BP132相对简单的 DSBs, 或其他感兴趣的蛋白质融合到荧光标签) 执行脂质体介导的 DNA 转染。在1.5 毫升管中稀释0.3 µg 质粒 DNA 到25µL 无血清培养培养基中。
  3. 另外1.5 毫升管, 稀释1µL 脂质体的 DNA 转染试剂为25µL 无血清培养基, 并轻轻混合。
  4. 将稀释的 dna 和转染剂轻轻混合, 在室温下孵育10分钟, 形成 dna 脂质复合物。
  5. 用0.5 毫升培养基冲洗细胞一次, 取出介质, 并向单元格中添加0.5 毫升新鲜培养基 (如步骤 1.1)。
  6. 在细胞中加入 DNA 脂质配合物。轻轻摇晃盘子几次。将单元格放回孵化器, 如步骤2.1 所示。
  7. 4-6 小时后, 从细胞中取出培养基, 加入300µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。去除它, 增加200µL 胰蛋白酶-EDTA, 并且孵育在37° c 孵化器 3-4 min。
  8. 在确认细胞分离后, 加入800µL 培养基, 重细胞通过轻度移, 使细胞团簇破裂。将细胞悬浮液转移到一个格片的 35 mm 培养皿中, 并将培养基添加到2毫升的最后一卷。
  9. 孵育孵化器中的细胞, 如步骤2.1 所示48小时, 然后进行4节。
    注: 如果重组蛋白的表达是有毒的 (在2.8 步中孵化后转染细胞呈圆形或不规则形态), 缩短表达时间, 并在转染后16-20 小时执行激光 microirradiation (第4节), 只要蛋白质表达可以被证实 (为荧光检测, 参见步骤 4.3)。在这种情况下, 执行转染直接在35毫米的菜。种子 3.0 x 105 HeLa 细胞, 在35毫米的格片, 在 50-70% h. 染 DNA 质粒后达到约30汇合, 并在转染后改变培养基 2-6 h。如果蛋白质表达合理, 细胞出现健康, 则进行激光 microirradiation 12-20 小时。

3. 细胞周期同步

注: 对于同源重组修复 (hr) 蛋白, 如 Rad51 和内聚力, 在 S/G2 阶段的细胞周期中, 招聘更为突出, 其中 hr 修复发生在51。因此, 要监测这些蛋白质的招募, 细胞同步到 S/G2 阶段是必要的。

  1. S/G2 相位同步
    1. 使用双胸苷块协议进行单元同步, 以 S/G2 阶段50,51。在播种细胞在35毫米格片盘 (参见步 1.1) 之后, 孵育细胞与胸苷 (到最后的集中2.5 毫米) 在文化媒介 (和在步 1.1) 为 17 h 在37° c 和与 5% CO2。
    2. 冲洗细胞与1毫升无胸苷培养基 (如在步骤 1.1) 两次, 并孵育细胞在2毫升无胸苷培养基 9 h, 在步骤1.1。
    3. 添加200µL 27.5 mm 胸苷的股票解决方案 (溶解在培养基中) 进入培养基与细胞最终浓度2.5 毫米胸苷。孵育的细胞, 在步骤3.1.1 为另 15 h. 冲洗和孵育的细胞在胸苷自由培养基4-6 小时, 并诱导 DNA 损伤 (4 节)。
    4. 通过使用细胞周期标记 (分别为 S/G2 和 G2)、S/G2 相特异的 DNA 损伤修复因子 (例如、Rad51 或内聚力) 或 IdU/教育合并 (S 相细胞)51来确认同步效率。
  2. G1 相位同步
    1. 种子 6-8 x 104 HeLa 细胞在35毫米培养皿中与格片 (步骤 2.1)。
    2. 2天后, 在倒置显微镜下使用10X 物镜和10X 眼透镜, 确定中期细胞, 这是轻微提升和圆形的。获取图像以记录中期细胞在格片上的位置。
    3. 3-4 小时后, 确认细胞分裂成两个子细胞 (在 G1 阶段), 并诱导 DNA 损伤 (第4节)。

4. 激光输入功率的滴定

注: 在本协议中, 我们使用 780 nm 脉冲 fs 近红外激光系统的共聚焦显微镜, 或 800 nm 脉冲 fs 近红外激光耦合到倒置的 epi 荧光显微镜诱导 DNA 损伤。虽然在这些系统中, 输入功率 (在试样的激光焦点的实际辐照度) 需要诱导可比较的 DDR 不同, 但输入功率滴定的基本原理适用于两个或任何一个近红外系统32,57. 在两个激光系统的焦点上, 每激光脉冲和峰值辐照度的原位能量分别在 5.33 x 10-2-4 x 10-1 新泽西和 7 x 10 10-5.24 x 10 11 W/cm2, 分别为32。

  1. 打开近红外激光器并允许激光系统在使用前预热1小时。
  2. 在加热的 (37 ° c) 的腔室中放置一盘细胞, 允许 CO2 (5%) 和湿度 (100%) 控制。
    注意: 如果 co2室不可用, 请使用 co2独立的区域性媒体, 最多5-6 小时。如果没有加热阶段, 保持显微镜下的细胞 < 20 分钟, 并立即更换到组织培养孵化器与适当的温度, CO2, 和湿度控制。这些培养条件可能因所使用的特定细胞类型以及派生 (例如、哺乳动物与两栖动物) 的有机体的不同而有所不同。
  3. 对于荧光标记蛋白质的活细胞分析, 选择一个 gfp 过滤器 (450-490 nm 激发, 515-586 nm 发射) 或 Cy3 过滤器 (540-552 nm 激发, > 590 nm 发射) 的 gfp 或 mCherry 融合蛋白, 分别使用100X 或63X 油浸泡目的.
  4. 搜索具有可比较荧光信号的细胞, 反映蛋白质表达的可比水平。避免细胞有太弱或太强的表达, 以减少细胞对细胞的变异荧光测量。
  5. 滴定激光输入功率。
    1. 780纳米近红外激光在共焦显微镜上的附着
      1. 使用软件漂白功能的目标是在细胞核内的线性轨道曝光到单一的激光扫描 (分辨率 512 x 512 像素, 变焦 X1, 漂白区域 50 x 4 像素, 12.8 µs 像素停留时间, 迭代 x1) 通过石油目标 (100 x/1.3 NA)。
      2. 调整激光传输百分比 (使用由制造商在激光显微镜系统中内置的软件/硬件) 到 5%, 而不更改任何其他设置。
      3. 将单元格置于该字段的中心。单击 "感兴趣区域 (ROI)" 工具, 然后使用鼠标在细胞核中绘制一条线或框 (大约 50 x 4 像素), 然后单击 "漂白" 按钮以诱发 DNA 损伤。
        注: 在随后的辐照步骤中, "漂白" 应增加5% 增量, 以40% 或高达 100%, 如果需要。
      4. 800 nm 近红外激光与 epi 荧光显微镜的连接
      5. 控制输入功率通过一个 (63 x/1.4 NA) 相衬油浸泡目标由在光束路径引入的极化滤波器的机动旋转, 并安装在计算机控制的机动旋转阶段32,39,58。
      6. 调整偏光角 (°), 并测量输入功率 (兆瓦) 进入显微镜, 使用激光功率计。确定提供输入功率范围从 20 mW-155 兆瓦在5-10 兆瓦增量的偏光器角度。
      7. 设置与20兆瓦输入功率对应的偏光角。
        注: 对于我们的激光系统, 如果偏光角为40°, 输入功率为65兆瓦。增加5-10 兆瓦增量的输入功率。
  6. 对于活细胞分析, 请转到步骤6.1 和6.3。为免疫荧光检测内源性蛋白或修改进行5节。分析后, 转到步骤4.7 进一步滴定激光功率。要分析上游因素的要求, 请转到第7节。
    注: BER 和 NHEJ 因素的招聘迅速 (在几分钟内) 和瞬态 (< 〜 30 min-1 h 取决于因素和 < 〜 4 h 后损伤诱导, 分别)。相比之下, HR 因素 Rad51 和内聚力的招募是可检测的在〜 30 min-1 h 和他们倾向于坚持超过8小时在未 DNA 损伤44,50,51。因此, 有必要检查不同的时间点后照射不同的修复因素。
  7. 按预期的增量增加输入功率 (即, 5% 用于780近红外激光器和5-10 兆瓦的800的近红外线), 并在步骤4.4 中重复步骤 4.5-4.7, 在新的单元格上确定阈值 (50% 的受损细胞显示招募) 和峰值 (100% 的细胞显示招聘) 为每个蛋白质。

5. 免疫荧光染色

注: 用于检测共价蛋白质修饰, 如 PAR (复合损伤标记) 和 H2AX 磷酸化 (γH2AX) (争端处理标记), 以及丁烷嘧啶二聚体 (6-4) 化 (6-4PP) 和 8-嘌呤 (8-oxoG) (交联和基底损伤标记分别), 细胞必须固定和染色的特定抗体。此外, 最好通过抗体检测内源性蛋白来确认荧光标记重组蛋白的结果, 以区分重组融合蛋白过度表达引起的伪影。

  1. 在损伤诱导后在不同的时间点固定细胞 (步骤 4.5) 取决于因素通过替换文化媒介 (参见步骤 1.1) 与1.5 毫升 4% paraformaldehyde/1X PBS 为 10 min 在 RT。
    注意: 甲醛烟雾是有毒的, 所有的工作都应该在通风的油烟罩中进行。
  2. 删除4% 甲醛/pbs 和1毫升0.5% 洗涤剂/pbs 在 RT 10 分钟。
  3. 去除0.5% 洗涤剂/pbs 和冲洗细胞2毫升 pbs 5 分钟, 并孵育细胞在2毫升的阻断溶液 (10% 小牛血清, 1% BSA/PBS) 为1小时 RT。
  4. 去除阻断液, 并将 pbs 的2毫升添加到细胞中, 用250µL 抗体溶液在 RT 的4° c 或1小时内将 pbs 替换为 3% BSA/pbs. 使用 1:200-1: 500 稀释 (典型的集中大约1µg/毫升, 经验主义地确定) 为抗体特定于不同的 DNA 损伤标记 (例如, γH2AX/53BP1 (争端分析);Ku (争端 NHEJ);Rad51/cohesin (争端管理, 人力资源);CPD/6-4PP (交联损伤);8-oxoG/DNA glycosylases (例如, NTH1) (基底损伤);PAR (高剂量复合损伤))。
  5. 去除抗体溶液, 用2毫升 pbs 冲洗5分钟, 去除 pbs, 并在室温下的3% 小时内用250µL 0.1% 二次抗体孵育至 1 h。
  6. 去除二次抗体溶液, 并增加2毫升 pbs 为5分钟两次, 并保持细胞在 1.5-2 毫升 pbs 在4° c 的成像步骤6.1 和6.2。

6. Immunostained 或活细胞的定量荧光分析

  1. 使用用于照射的显微镜捕捉染色或活细胞的图像 (n > 10)。对于 epi 荧光显微镜系统, 使用分辨率为 1344 x 1024 像素, 并将图像保存为 TIFF 16 位文件。对于共焦显微镜, 使用1X 放大倍率;用于 GFP/FITC 的氩激光, 氖594激光用于 Cy3/mCherry;用于图像分辨率的 512 x 512 或 1024 x 1024 像素;扫描速度 5, 数字: 1 用于快速扫描或 2 +, 平均超过多个扫描, 以提高信噪比。
  2. 使用用于测量像素强度的图像分析程序。
    1. 使用 "体积矩形" 工具在单个单元格图像中的损坏站点周围绘制 ROI。使用相同大小的 ROI 来测量核附近的背景荧光信号, 但不能与损伤部位重叠。这对于与非共焦显微镜系统相关的漂白的正常化非常重要。
    2. 要使用图像分析程序测量荧光信号, 请单击工具箱中的 "音量分析报告"。将出现一个新窗口。在 "数据显示" 部分, 只检查 "名称" 和 "密度" 框。然后单击 "完成" 以可视化测量。
    3. 通过单击在 "卷报告" 窗口底部找到的表格图标, 将这些值导出到电子表格程序中, 然后为 "导出目标" 字段分隔符和 "文件" 选择 "制表符 (excel 格式)"。
    4. 为了获得相对的信号, 使用电子表格程序将损伤部位 (1 栏) 的荧光强度除以核的控制背景区域 (2 列), 然后减去1以进行正常化。
  3. 用共焦显微镜实时定量荧光时间-过程分析
    1. 在步骤4.3 中使用显微镜识别荧光标记的蛋白质阳性细胞。
    2. 在4节损伤诱导后, 在损伤前和不同时间点进行延时荧光成像。首先画出漂白剂的 ROI (对损伤感应), 然后选择 "获取 > 时间序列" 子菜单, 设置 "数字" 为 20, 和 "周期延迟" 为三十年代, 选择 "漂白一次后第一次扫描", 然后单击 "开始 B"。在这种情况下, 第一个图像是在损伤诱导前立即获得, 然后在三十年代的时间间隔内进行19次图像获取。时间间隔 ("周期延迟") 可以根据研究的目的而改变。
    3. 一旦图像采集完成, 点击 "平均值", 并在损害区域绘制 ROI。单击 "显示表" 以获得一个表, 列出所选 roi 中的强度。通过将损伤部位的荧光强度除以同一区域在损伤前的强度, 使数据正常化, 并减去1。

7. 小干扰 RNA (siRNA) 转染

注意: 目标蛋白的耗竭是描述被观察到的蛋白质招募到损伤部位的上游因素要求的有效方法 (4 节)。此外, 该战略是解决免疫荧光检测抗体特异性的最佳方法 (见5节)。

  1. 1天: 在24孔板上播种 6-8 x 104 hela 细胞, 在每口井的 0.5 mL 培养基中制备2口的 hela 细胞, 一个用于控制 siRNA 转染, 一个用于 PARP1 siRNA (5 CCG) TTA。
  2. 2天: 确认细胞约40-50% 汇合。执行第一轮 siRNA 转染: 稀释 5 pmol siRNA 成25µL 无血清培养基, 加入3µL 脂质基转染试剂到试管中, 轻轻混合, 孵育5-10 分钟。
  3. 用0.5 毫升新鲜培养基冲洗细胞一次, 在0.5 毫升新鲜培养基中保持细胞 (见步骤 1.1)。
  4. 将 RNA 脂复合物添加到细胞中, 然后通过来回倾斜来轻轻混合。将单元格放回孵化器, 如步骤2.1 所示。
  5. 吸入转染混合, 并添加0.5 毫升新鲜培养基 (步骤 1.1) 后6小时。
  6. 3天: 执行第二轮 siRNA 染 (参见步骤 7.2)。然后, 种子60-100% 的细胞成35毫米格片盘, 如步骤2.3 所述。
  7. 5天: 使用最佳激光功率条件进行激光 microirradiation, 以最大程度地招募感兴趣的因素, 如4节所确定的那样。通常, 在大约60-90% 的 HeLa 细胞中可以观察到有效的损耗。
    注: 作为一种替代和互补的方法, 抑制剂, 如果可用, 可以用来抑制功能的因素的利益32,44。为分析抑制 DDR 信令的效果, 添加20µM PARP 抑制剂, 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) 抑制剂, 或10µM dna 依赖性蛋白激酶与催化亚基 (dna-PKcs) 抑制剂和10µM ATM 抑制剂在二甲基亚砜 (砜) 的在损伤诱导前1小时的盘子。只将亚砜添加到控制单元中。

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Representative Results

使用 PtK2 细胞稳定表达 EGFP-53BP11220-1711或 TRF2-YFP, 进行激光输入功率滴定, 以确定他们的最佳招聘条件 (图 1)32。

在高输入功率激光损伤现场, 明显的 GFP-NTH1 (紫外线) 损伤引起的交联损伤, 以及专门识别基底损伤的 DNA glycosylase 的显著聚类。此外, 观察到较高的 XRCC1 和 CtIP 信号, 反映了链断裂数量的增加, 并证明在这种情况下引起复杂的 DNA 损伤 (图 2A)。其他 DNA glycosylases 融合到荧光蛋白 (例如, GFP-内切 VIII 样 2 (NEIL2) 和 GFP-8-Oxoguanine glycosylase (OGG1)) 以及 condensin 我也可以使用作为基础损害标记44,59。与此相一致, 我们发现, 高输入功率激光器 (即, 能量和辐照度在试样中的焦斑中) 引起的 PAR 响应很大, 但在焦斑中仅微弱的激光功率 (图 2B, 左上)。PAR 信号, 但不是 PARP1 蛋白定位, 在损伤部位是敏感的 PARP 抑制剂 (数据没有显示)。此外, siRNA 特定的 PARP1 在损坏站点 (图 2B, 右上)32中减少了 PAR 和 PARP1。在高输入功率条件下, γH2AX 最初出现在损伤部位, 并以 ATM/DNA PK 依赖的方式迅速扩散到整个原子核 (图 2B, 底部)。类似的 ATM/DNA PK 依赖传播的γH2AX 报告γ辐照60。通过800和780纳米近红外激光系统32得到了一致的结果。在一起, 结果表明, 它是可能的滴定激光输入功率 (因此, 能量和辐照度的焦点在细胞) 找到的条件, 诱发不同程度的 PARP 反应相关的数量 DSBs 和DNA 损伤的复杂性。

上述结果初步表明, 复杂 DNA 损伤的存在可能导致了53BP1 和 TRF2 的差异。然而, 有趣的是, 53BP11220-1711对低功耗站点的招募由于同一细胞核中高输入电源引起的第二个损伤站点的存在而受到了有效的抑制 (图 3A与图3B 的对比).结果表明, 高输入功率激光损伤抑制53BP1 的招聘在跨。PARP 抑制剂对 PAR 的抑制作用以及通过 ATM/DNA PK 抑制剂对核范围γH2AX 扩散的抑制作用将此招聘恢复到高输入电源损坏站点 (图 3A)。这是不同于招募的 DNA 损伤检查点 1 (MDC1) 的破坏地点, 这是主要抑制的γH2AX 分散, 因此, 恢复了 ATM/DNA PK 抑制剂, 而不是 PARP 抑制剂 (图 3A, 底部)。重要的是, hyperactivation 的 PARG 抑制 (不影响γH2AX 状态) 有效地抑制了初始53BP1 的招募, 即使在低输入功率损害的网站, 通常招聘53BP1 有效 (图 3B)32。同时, 这些结果表明, PAR 信号, 而不是本身的损坏类型, 会干扰 53BP1 32的招募。这是一个例子的多功能激光 microirradiation, 这使我们可以检查如何多个损伤网站相互影响和互动。

Figure 1
图 1: 激光输入功率的滴定.为了确定用于未来实验的激光功率, PtK2 细胞稳定表达 EGFP-53BP1 和 TRF2-YFP 是受激光 microirradiation 与输入功率范围20兆瓦和155兆瓦使用 800 nm 近红外激光/倒置 epi 荧光显微镜系统。EGFP-53BP1 招募被监测15分钟辐照 (私家侦探), 而 TRF2-YFP 细胞被跟踪6分钟私家侦探直接在条形图上方的数字表示在测试的单元总数中显示 EGFP-53BP1 或 TRF2-YFP 对损伤点的积极招募的细胞数量。此图是从 Saquilabon 克鲁兹32中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 利用高输入功率激光器对复杂损伤和强 DDR 信号进行诱导.(A) 高输入功率激光 microirradiation 诱导复杂的损伤, 包括链断裂 (办学和 DSBs), 交联, 和基础损害。XRCC1 (单边带和解决争端修复), NTH1 DNA glycosylase (BER) 和 CtIP (替代 NHEJ 和 HR) 显示 (只有 GFP-NTH1 是一个活细胞图像和其余的观察后, 免疫荧光染色)。定量荧光强度测量的损伤现场招聘是按照协议7节所述, 并在 boxplots。所测试的细胞总数 (n) 可以在每个量化的蛋白质下看到。*p-值 < 0.05。(B) 顶部 (左): 在高输入功率损伤位置的鲁棒 PAR 和 PARP1 信号。顶部 (右): PARP1 siRNA 损耗足以废除 PAR 信号32,44。底: γH2AX 在低 (顶) 和高 (下) 输入功率损伤的细胞中的时间过程分析。缩放条形图 = 10 µm。此图是从 Saquilabon 克鲁兹32中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: DDR 信号的差分激活将影响53BP1 的招聘到损坏站点.(A) 顶部: 使用 780 nm 近红外/共聚焦显微镜系统, 在同一核中稳定表达 EGFP-53BP11220-1711的 PtK2 细胞 microirradiated 低 (15%) 和高 (25%) 输入功率 (分别为白色和黄色箭头)。这是在存在的二甲基亚砜, PARP 抑制剂 (pi), 或结合 ATM, DNA PK, 和 PARP 抑制剂 (Ai + Di + Pi) 表明。EGFP-53BP11220-1711的活细胞成像在感应后30分钟被捕获。细胞, 然后固定和染色的抗体特定的γH2AX 作为一个争端解决标志。EGFP-53BP11220-1711在损伤部位的荧光强度变化在右侧显示为p值 (平均值为: 亚砜, 0.03 ± 0.02;Pi, 0.34 ± 0.19;Ai + Pi, 0.98 ± 0.23)。底: Pi 和 Ai + Di 处理对高输入功率损伤 MDC1 定位的影响。刻度条是10µm。右: MDC1 在高输入功率损伤部位的荧光信号的变化在二甲基亚砜, Pi, 或 Ai + Di 与p-值 (平均值是: 亚砜, 0.07 ± 0.10;Pi, 0.05 ± 0.07;Ai + Di, 0.86 ± 0.26)。缩放条 = 10 µm 每强度测量的10。(B) 通过 PARGi 处理提高 PAR 信号对低输入功率损伤部位内源性53BP1 的影响。右: Boxplots 代表定量分析的内源性53BP1 招募 (免疫荧光染色检测) 低输入功率激光 (60 兆瓦的 800 nm 近红外激光/倒置 epi-荧光显微镜系统) 在15分钟后照射在存在的亚甲基亚砜或 PARGi 如所示。左: PAR 和53BP1 免疫荧光染色细胞在相同条件下受损的亚甲基亚砜或 PARGi 治疗的图片。对于亚砜治疗, 100% 的细胞检查 (N = 25) 表现出强健的53BP1 招聘 (右)。相比之下, 20/25 的人在 PARGi (右下) 的存在中没有53BP1 的招募, 5 细胞表现出招募不力。缩放条 = 10 µm。此图是从 Saquilabon 克鲁兹32中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

使用激光 microirradiation 进行 DDR 研究的优点是:

1. 从简单的链断裂到复杂的 dna 损伤, 可以诱导不同类型和数量的 dna 损伤, 并通过调整激光辐照参数来检测 dna 损伤部位的不同修复因子。也可以在相同的细胞核中多次造成损伤, 以评估反式效果 (如图 3所示)。

2. 重要的是, 在受损地点发生的事件和发生在原子核其他地方的次要事件很容易被区分。

3. 可以对荧光标记蛋白动态进行高分辨率实时测量, 以响应单个细胞水平的损伤, 包括但不限于: rster 共振能量转移 (苦恼), 荧光寿命成像 (电影)、配对相关函数 (pCF)、等, 以捕获实时单元中的 DDR。

4。结合 RNA 干扰或抑制剂治疗, 在少量的细胞中测试上游因素的要求是相对简单的。

5. 还应指出的是, 近红外 (或绿色) 激光辐射不需要用核苷酸类似物或 dna 插染料对 dna 进行预敏化, 从而避免对染色质包装产生不必要的副作用。这与紫外线激光系统相比, 需要在低剂量下进行敏化, 并导致在高剂量时出现异常 DDR39,49,61。

协议/修改和疑难解答中的关键步骤
重要的是, 在进行 DDR 分析时, 细胞处于健康的状态, 以尽量减少伪影和实验变异。在格片上生长时, DNA 或 siRNA 转染的细胞通常更敏感或容易分离。它有助于保持细胞在转染试剂的短时间内, 只要转染的工作, 并种子更多的转基因细胞到格片盘相比, untransfected 细胞。这是必要的为了达到可比较的细胞汇流为实验。

据报道, 胸苷阻滞导致同步细胞中的γH2AX 含量增加62, 这可能会影响 DDR 并扭曲结果。此外, 基线γH2AX 信号在 S 和 G2/M 阶段显示更高, 即使没有任何外部损伤63,64。然而, 我们没有观察到核中的任何明显的γH2AX 信号, 它们会影响或干扰在 S/G2 相位中由双胸苷块51同步的细胞在激光诱导损伤部位的特定γH2AX 反应。

为了获得一致的结果, 有必要定期检查激光系统的输出参数 (每2到4周) 和光学对准 (每2月)。随着时间的推移, 激光系统组件可能需要重新对准, 物镜可能被损坏, 需要更换, 总输入功率的稳定性可能发生变化。关键是评估损伤的存在 (交联 (6-4PP) 和基底损伤 (8-oxoG)), 标记蛋白 (例如, DNA glycosylases, Rad51, 内聚力和 Ku), 以及在本协议中描述的 PAR 修饰来确定剂量和用激光显微镜系统引起的 DNA 损伤的复杂性。

技术的局限
激光 microirradiation 有局限性。激光束引起的 DNA 损伤在细胞核的一个区域内高度聚集, 与可能在细胞核内传播的自然损伤相比较。这可能会改变损伤信号在相邻的染色质或细胞核中传播的方式。由于细胞的数量相对较少, 可以一次照射, 基于人口的生化检测 (例如, 免疫印迹, 蛋白质复合纯化, 染色质沉淀 (芯片)) 不能轻易执行。依赖荧光标记的蛋白质 (与过度表达的外源性重组蛋白, 甚至与那些表达内使用 CRISPR 介导标签插入) 的动态成像, 使研究易受蛋白质融合诱导工件.因此, 需要通过与传统的 DNA 损伤方法 (IR、化学损伤剂) 和内源性的结果进行比较, 来评估激光诱导的损伤和标记蛋白的潜在 artifactual 效应的独特性。标签蛋白 (尽管有时不可能进行完全的平行实验)。

关于现有方法的意义
使用序列特定的酶, 如 i-SceI、FokI、AsiSI 和 i-PpoI 提供了一种替代策略, 以诱导特定于站点的 DSBs (严格简单的 DSBs)。因素招聘或修改可以通过特定站点或全基因组芯片分析65,66,67,68,69进行分析。DSBs 的相对同步诱导可以通过标记切与类固醇激素受体和退化信号 (degron) 的快速核易位和退化, 分别65,66,67,68,69. 但是, 必须考虑到切表达式和目标站点可访问性的效率, 以及正在进行的修复状态在不同的单元格和不同的目标站点上可以是可变的。这些质将在基于人口的芯片分析中得到平均值, 这可能会扭曲结果。激光 microirradiation, 另一方面, 提供了最高的时间分辨率 (毫秒), 以及空间分辨率 (微米) 的损伤响应动力学, 可以分析在单细胞水平。然而, 高损伤密度可能影响结果。这两种策略都可以对由抗体可达性和/或肽标记引起的工件敏感。因此, 理解这两种策略的利弊是很重要的, 它们可能会被用来相互补充。

未来应用
随着荧光成像和动力学技术的飞速发展, 激光系统在特定位置和细胞周期阶段诱导不同数量和类型的 DNA 损伤的多功能性提供了一个宝贵的机会来审问细胞和在单个细胞水平上的高时空分辨率对 DNA 损伤的分子反应。例如, 有可能以毫秒分辨率 (例如, 在损伤部位, 检测分子相互作用或改变, 以此来梳理损伤部位和细胞核和细胞范围内的 DDR 信号转导, 检查染色质结构的动态变化, 或实时观察损伤信号向整个核的传播。也可以在长时间内追踪同一细胞, 以检查 DNA 损伤对细胞命运的影响。我们设想, 激光 microirradiation 方法, 如果使用得当, 将继续为促进 DNA 修复领域作出重大贡献。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢 Dr. 野在东北大学, 日本 GFP-NTH1 表达质粒, 和 Dr. 爱神 Lazzerini Denchi 在斯研究所, la, 加利福尼亚为 TRF2-YFP 和 EGFP-53BP11220-1711表达的粒。这项工作得到了空军科研办公室 (FA9550-04-1-0101) 和贝克曼激光研究所 Inc. 基金会 (m.w. B)、美国国家科学院福特基金会奖学金 (美国)、NSF MCB-1615701 和中国CRR-17-426665 (阿莫亚科)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

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遗传学 问题 131 激光 microirradiation 医学中的激光 dna 损伤 dna 损伤反应 dna 修复 聚 (ADP-核糖) 聚合酶 (PARP) 复合损伤 链断裂 基底损伤
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Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B.… More

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).

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