Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56213
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2,3,4, 1
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

Abstract

נזק לדנ א מעוררת תגובות ספציפיות איתות ותיקון בתא, אשר חיוני להגנה של הגנום שלמות. לייזר microirradiation הפך כלי ניסויי חשוב לחקור את ה-DNA נזק התגובה (DDR) ויוו. היא מאפשרת ניתוח מתא בודד ברזולוציה גבוהה בזמן אמת של דינמיקה macromolecular בתגובה לייזר המושרה נזק מוגבל לאזור submicrometer בתוך גרעין התא. עם זאת, התנאים לייזר השונים שימשו ללא הערכה של הבדלים בין סוגי הנזק הנגרם. כתוצאה מכך, מהות הנזק הוא לעתים קרובות לא טוב מאופיין או נשלט, גורם חוסר עקביות לכאורה פרופילי גיוס או שינוי. להדגים כי תנאי הקרנה שונות (קרי, אורכי גל שונים וכן סמכויות קלט שונות (irradiances) של לייזר הפמטו-שנייה (fs)-סגול (ניר)) המושרה הרכבות חלבון ברורים של DDR ותיקון. זה משקף את סוג נזק לדנ א המיוצר. פרוטוקול זה מתאר איך טיטור של עוצמת הקלט הלייזר מאפשר אינדוקציה של כמויות שונות המורכבות של נזק לדנ א, אשר ניתן לנטר בקלות על ידי זיהוי של נזקים crosslinking, בסיס, פוליפוני דיפרנציאלית (ADP-ריבוז) (PAR) איתות, ו תיקון מסלול ספציפי הרכבות גורם נזק אתרים. ברגע נקבעים התנאים נזק, זה אפשרי לחקור את ההשפעות של נזק שונות המורכבות והאיתות נזק דיפרנציאלית, כמו גם דלדול של factor(s) נגד הזרם על כל גורם בעל עניין.

Introduction

אין ויוו ה-DNA נזק איתות זה אינם מובנים היטב
In vivo, ה-DNA הוא ומורכבת עם שינויים היסטוניים וגורמים אחרים כדי טופס כרומטין סיבים. ויסות הכרומטין היא בעלת חשיבות עליונה עבור ה-DNA חילוף החומרים. לדוגמה, הגרסה היסטון H2AX phosphorylated אטקסיה-telangiectasia מוטציה (ATM), אחרים kinases כפול הבאים-strand שובר אינדוקציה (DSB), ועל חשוב DSB נזק אות הגברה, כמו גם מתן אתר עגינה עבור השני גורמים. הפצת הבחירה מסלול איתות ותיקון הנזק מופיעים אנושות להיות מושפע הכרומטין מקומיים-נזק לאתרים1. מספר של כרומטין שיפוץ גורמים מלווים היסטון, היסטון שינוי אנזימים אכן גייסו לפגוע באתרים חשובים עבור תיקון דנ א יעיל, הדגשת החשיבות של כרומטין רגולציה ב- DDR ואת תיקון2 , 3 , 4. יתר על כן, נזק באתר קיבוץ באשכולות או שינוי מיקום נצפתה ב שמרים ו דרוזופילה5,6,7,8, מזכיר relocalization של ג'ין לוקוסים, תא subnuclear הקשורים עם ג'ין בתקנה9,10. מחקרים שנעשו לאחרונה העכבר, תאים אנושיים התגלה גם גיוס של אתרים DSB, אילו השפעות תיקון נאמנות ועל מסלול הבחירה11,12. זה מעלה את האפשרות כי DDR/תיקון גם בצורה אינטימית קשורה אדריכלות גרעיני כרומטין מיומנויות ארגון, כרומוזום דינאמיקה של גרעין התא. לפיכך, חיוני לפתח שיטות ברזולוציה גבוהה ללמוד DDR ולתקן תהליכים בהקשר של הסביבה גרעיני אנדוגני בתא חי כדי להבין קצר - ארוכת ההשלכות של נזק לדנ א.

תפקיד מכריע של PAR פולימראז (PARP) מודד במידה ואת סוג הנזק, ויסות חלבון הרכבה באתר נזק
PARP1 הוא חיישן ניק DNA מופעל במהירות על ידי נזק לדנ א שמשחקת תפקיד קריטי תיקון דנ א13. PARP1 חשבו תחילה לפעול יחד עם הרנטגן לתקן לחצות משלימים 1 (XRCC1) כדי להקל על כריתה הבסיס לתיקון (בער), אך מחקרים אחרונים לחשוף את תפקידה השני שמסלולי התיקון ה-DNA, כולל DSB תיקון14. PARP1 שימושים nicotinamide אדנין dinucleotide (NAD+) כמו מצע ל ADP-ribosylate מספר היעד החלבונים מופעל, כולל את עצמו. אנזים זה ובני משפחה אחרים משכו תשומת לב רבה בשנים האחרונות כפי מעכבי PARP הופיעו גם מבטיח תרופות טיפוליות עבור סרטן. למרות מעכבי PARP בתחילה נמצאו יעילים גנטי לסרטן השד (BRCA)-מוטציה תאים סרטניים בשד, עכשיו יש שפע של עדויות על ההשפעות שלהם במונו - שילוב טיפולים אלטרנטיביים יחד עם ה-DNA נזק סוכנים/הקרנה נגד קשת רחבה של סרטן עם מוטציות לא מוגבל ל- BRCA15,16,17,18,19,20.

ברמה המולקולרית, הפעלת PARP הוצגה לשחק תפקידים חיוניים בארגון הכרומטין מקומיים באתרים נזק. תלויי-PAR גיוס של כרומטין השינוי אנזימים מקלה DSB תיקון ותיקון מכתיבה בחירות מסלול, מציעה את תפקיד חשוב פיגומים PAR השינוי באתרים נזק. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 לאחרונה להדגים את החרגת מחייב p53 חלבון 1 (53BP1) מפני נזק אתרים על ידי PAR 32, מתן הסבר חלופי עבור תלויי-53BP1 hyperactivation של endjoining שאינם הומולוגיים ( NHEJ) על ידי PARP מעכב, המדגיש את חשיבות PARP ב DSB תיקון מסלול הבחירה33,34. PARP1 גם ישירות PARylates, משפיע על הפעילות של DNA מרובים תיקון גורמים14.

באמצעות לייזר Microirradiation ככלי לימודים DDR/תיקון In Vivo
לייזר microirradiation לייצר שינויים תת מיקרון על כרומוזומים בודדים היה תחילה תיאר בשנת 196935 , שנסקרו בפירוט 198136. כמה עשורים מאוחר יותר, לייזר microirradiation הוצגה כדי לגרום נזק לדנ א-אזור מוגדר submicrometer בתוך גרעין התא, ולא הוכח טכניקה יקר ללמוד גיוס או שינויים של גורמים שונים DNA נגעים vivo בתוך 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. שיטה זו מאפשרת זיהוי של גורמים אלו שיוצרות לא ברורים הקרנה-induced מוקדים (IRIF)-נזק לאתרים39,42. . זה גם ניתן לבחון את הדינמיקה ייתכן של שינויים מבניים כרומטין באתרים נזק והן בשאר חלקי הגרעין. השווינו בקפידה את DDRs המושרה על ידי מערכות לייזר שונים קלט כוחות כדי להעריך את הקשר בין סוג נזק לדנ א microirradiation תנאים32,43,44, 45. דפוסי גיוס aberrant של 53BP1 ושל telomeric חוזר מחייב פקטור 2 (TRF2) נצפו במחקרים קודמים לייזר נזק, אשר סיפקה את הבסיס על הדאגה מחזוריות הטבע "הלא-פיזיולוגיים" לנזק לייזר המושרה46 ,47,48,49. מצאנו כי אלו סתירות לכאורה יכול עכשיו להיות מוסברת על ידי PARP דיפרנציאלית איתות אשר בוחן את הכמות ואת המורכבות של נזק מושרה32. אנחנו אישר כי: 1) לייזר-microirradiated תאים (אפילו לאחר הקרנה גבוהה קלט-power) הם נעצרו ב לאטמוספרה באופן תלוי-בקרת מחסום נזק, מורדם (לפחות עד 48 שעות)32,50; ו- 2) תיקון גורם גיוס/שינויים בנאמנות מסכם את הדברים אלו נצפו עם טיפול קונבנציונאלי DNA סוכנים מזיק, אינדוקציה DSB endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. תוצאות אלה תומכים מאוד את הרלוונטיות פיזיולוגיים של הלומדים לייזר המושרה נזק הסלולר תגובות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התא הבסיסי הכנה

הערה: השלב זה לגילוי סטנדרטי immunofluorescence של חלבון אנדוגני גיוס או שינוי, לשימוש של קו תא stably ביטוי חלבון רקומביננטי מתויגות fluorescently. לדוגמה, בתאי אפיתל של הכליה כיס Potorustridactylus (PtK2) לבטא stably EGFP-53BP11220-1711 או TRF2-YFP שימשו קודמות שלנו לומדים (איור 1)32. במקרה הראשון, המוקד ויוצרים אזור של 53BP1 (חומצה אמינית 1220-1711) המכיל את התחום oligomerization התחום טיודור, המוטיב גיוס תלויי-ubiquitylation (UDR), שהיה מחובר לגבו GFP משופרת (EGFP-53BP11220-1711). חלבון כימרי זה recapitulates נזק באתר הגיוס של54,53,5553BP1 באורך מלא. הלה תאים, מתויגות fluorescently subunits של cohesin (למשל, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52ו- GFP-SA2 51) חייב stably להביע כדי להבטיח השתלבות יעילה המתחם וכדי מסכם את הדברים S/G2 מחזור התא נזק ספציפי שלב באתר הגיוס של cohesin אנדוגני51.

  1. זרע בכל סוג התא חסיד על גבי מאכל תרביות רקמה 35 מ מ עם coverslip gridded כדי לאפשר זיהוי תא בודד. להתאים את מספר התא הראשוני להשגת 60% confluency ב 36-48 h מבוסס על קצב התפשטות של הקו לתא מסוים. לדוגמה:
    1. עבור PtK2 כיס אפיתל תאי הכליה (פראי סוג או אלה לבטא stably EGFP-53BP11220-1711 או TRF2-YFP): צלחת 2.0 x 10 תאים4 ב 2 mL מתקדם מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 2 מ מגלוטמין, שור עוברית 4% סרום (FBS) ואנטיביוטיקה (פניצילין U/mL 100 ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL), דגירה ב 37 ° C עם 7% CO2.
    2. עבור הלה תאים עם stably לבטא fluorescently מתויג חומרים GFP-SA2: תאי זרע 1.0 x 105 2 מ"ל בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין U/mL 100 ו- 100 µg/mL סטרפטומיצין, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2. שאר התאים הלה עשוי לשמש גם כולל תאים שלא שונתה או תאים לבטא hSMC1-GFP.
  2. לאפשר תאים לדבוק ולאחר להתרבות במשך 36-48 שעות לפני DNA נזק אינדוקציה-30-60% הנהרות (כדי לאפשר ויזואליזציה של המספר לרשת). המשך סעיף 4.

2. ארעי תרביות תאים

הערה: לפעמים טוב נוגדנים אינן זמינות לזהות את החלבונים אנדוגני. אם שורות תאים stably המבטאים חלבונים סמן אינם זמינים, לבצע את transfections ארעית כדי לפקח חלבונים fluorescently עם תוויות עבור ניתוחים תא חי.

  1. עבור תאים הלה, ביום 1, זרע 6-8 x 10 תאים4 בתקשורת תרבות 0.5 mL בבאר אחת של צלחת 24-ובכן, דגירה ב חממה humidified 100% ב- 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2. ראה שלב 1.1 תנאים תרבות המדיה.
  2. יום 2, שימוש פלסמיד ביטוי בתרבית של קידוד של DNA מתויגות fluorescently לתקן פקטור (למשל, ה-GFP-NTH1 או ה-GFP-OGG1 עבור נזק הבסיס32,44,56GFP-Ku עבור מינון גבוה DSBs57, GFP-53BP1 32 DSBs פשוט יחסית, או חלבונים אחרים עניין דבוקה תגית פלורסנט) כדי לבצע בתיווך ליפוזום תקנים הדנ א. לדלל פלסמיד µg 0.3 DNA לתוך µL 25 של סרום ללא תרבות התקשורת צינור 1.5 מ.
  3. עוד צינור 1.5 mL, לדלל 1 µL מבוססי ליפוזום DNA תרביות תאים ריאגנט לתוך µL 25 ללא סרום תרבות המדיה ומערבבים בעדינות.
  4. מערבבים בעדינות את הסוכן מדוללת של DNA ו תרביות תאים, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) אל טופס DNA-השומנים מתחמי.
  5. שטיפה תאים עם 0.5 mL תרבות המדיה פעם אחת, מסיר את המדיה, וכן להוסיף 0.5 mL טריים תרבות המדיה על התאים (כמו שלב 1.1).
  6. הוסף את מתחמי ה-DNA-השומנים לתאים. מערבבים בעדינות במוזיקת שלוחית מספר פעמים. להחזיר את התאים החממה כמו שלב 2.1.
  7. לאחר 4-6 ה', להסיר את המדיה התרבות התאים ולהוסיף 300 µL 0.05% טריפסין-EDTA. להסיר אותו, להוסיף 200 µL טריפסין-EDTA, דגירה בחממה 37 º C למשך 3-4 דקות.
  8. לאחר שנוכח כי התאים מנותקים, להוסיף 800 µL תרבות המדיה, resuspend את התאים על ידי בעדינות pipetting להיפרד כגיהנום התא. להעביר התליה תא לצלחת תרבות 35 מ מ עם coverslip gridded ולאחר הוספת מדיה תרבות לאמצעי הסופי של 2 מ.
  9. דגירה תאים בחממה כמו שלב 2.1 במשך 48 שעות, ולאחר מכן להמשיך בסעיף 4.
    הערה: אם הביטוי של חלבון רקומביננטי רעיל (transfected תאים להציג מורפולוגיה עגולים או לא סדיר לאחר דגירה בשלב 2.8), לקצר את זמן הביטוי, ולבצע microirradiation לייזר (סעיף 4) ב- 16-20 h לאחר תרביות תאים כל עוד ביטוי חלבון יכול להיות מאושרות (לגילוי קרינה פלואורסצנטית, ראה שלב 4.3). במקרה זה, לבצע תרביות תאים ישירות לתוך המנה 35 מ מ. זרע 3.0 x 105 הלה תאים בצלחת 35 מ מ עם coverslip gridded כדי להשיג כ 50-70% זרימה לאחר 30 ה Transfect DNA פלסמידים, ולשנות מדיה h 2-6 לאחר תרביות תאים. . המשך עם לייזר microirradiation 12-20 h מאוחר יותר אם ביטוי חלבון סביר ותאים בריאים.

3. מחזור התא סינכרון

הערה: עבור רקומבינציה הומולוגית לתקן (HR) חלבונים, כמו Rad51 ו cohesin, הגיוס הוא בולט יותר בשלב S/G2 של מחזור התא, אשר בנוסף תיקון לוקח מקום51. לפיכך, כדי לפקח על הגיוס של חלבונים אלה, התא לשלב S/G2 דרוש סנכרון.

  1. שלב S/G2 סינכרון
    1. השתמש בפרוטוקול בלוק תימידין כפול עבור סינכרון תא S/G2 לשלב50,51. לאחר זריעה התאים בצלחת gridded coverslip 35 מ מ (ראה שלב 1.1), דגירה התאים תימידין (כדי ריכוז סופי של 2.5 מ מ) בתקשורת תרבות (כמו שלב 1.1) עבור h 17 ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2.
    2. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל תימידין ללא תרבות המדיה (כמו שלב 1.1) פעמיים, דגירה התאים 2 מ"ל תימידין ללא תרבות המדיה עבור h 9 כמו שלב 1.1.
    3. להוסיף µL 200 מ מ 27.5 תימידין מניות פתרון (מומס תרבות המדיה) לתוך תרבות התקשורת עם תאי ריכוז סופי של תימידין 2.5 מ מ. דגירה התאים כמו צעד 3.1.1 ה 15 עוד שטיפה דגירה התאים ללא תימידין תרבות המדיה עבור 4-6 h, לגרום נזק לדנ א (סעיף 4).
    4. לאשר את יעילות סינכרון באמצעות סמנים מחזור התא (Cyclin A2 ו- B1 S/G2 ו G2, בהתאמה), S/G2 ספציפיות שלב DNA נזק תיקון גורמים (למשל, Rad51 או cohesin), או על-ידי IdU/עידו ההתאגדות (עבור תאים שלב S)51.
  2. סינכרון שלב G1
    1. זרע 6-8 x 10 הלה4 תאים בצלחת תרבות 35 מ מ עם gridded coverslip (שלב 2.1).
    2. לאחר יומיים, לזהות מפה של תאים, אשר הינם מעט והרימה אותה בצורת עגול, תחת מיקרוסקופ הפוכה באמצעות המטרה X 10 X 10 עדשות עינית. לרכוש תמונות כדי להקליט את המיקום של מפה של תאים ב- coverslip gridded.
    3. לאחר 3-4 h, לאשר חלוקת התא לתוך שני תאי הבת (בשלב G1), לגרום נזק לדנ א (סעיף 4).

4. טיטור של לייזר כוח קלט

הערה: פרוטוקול זה, ואנחנו יוצרים נזק לדנ א באמצעות של 780 nm פעמו לייזר fs ניר מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי, או 800 nm פעמו לייזר ניר fs מצמידים במיקרוסקופ אפינפרין הפוכה-זריחה. למרות כוח קלט (בפועל בקרינה בנקודת המוקד לייזר הדגימה) צריך זירוז DDR דומות שונה במערכות אלו, העיקרון הבסיסי של כוח קלט טיטור חל בשני, אם בכלל, ניר מערכות32,57 . האנרגיה בחיי עיר לפי הדופק לייזר irradiance שיא-מוקד עבור מערכות לייזר שני היו בטווח של-2-4 × 10 × 10 5.33 מטרים-1 nJ ו- 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, בהתאמה32.

  1. להפעיל את הלייזר ניר ולאפשר את מערכת הלייזר לחימום לשעה לפני השימוש.
  2. במקום מנה של תאים על שלב מחוממת (37 מעלות צלזיוס) בתוך תא המאפשר CO2 (5%) ובקרת לחות (100%).
    הערה: אם תא2 CO אינה זמינה, השתמש CO2-תקשורת תרבות עצמאית במשך עד 5-6 שעות. אם שלב החימום אינו זמין, להשאיר את התאים במיקרוסקופ < כעשרים דקות, להחליף מיד לתוך החממה תרביות רקמה עם טמפרטורה נכונה, CO2בקרת לחות. תנאים תרבות אלה עשויים להשתנות בהתאם לסוג תאים מסוים בשימוש כמו גם האורגניזם נגזרת (למשל, יונקים לעומת דו-חיים).
  3. לניתוח תא בשידור חי של חלבונים מתויג fluorescently, בחר מסנן GFP (450-490 nm עירור, פליטה nm 515-586) או מסנן Cy3 (540-552 nm עירור, פליטה nm > 590) GFP או התמזגו mCherry חלבון, בהתאמה, באמצעות 100 X או טבילה שמן X 63 המטרה.
  4. לחפש תאים בעלי אותות פלורסצנטיות דומות, המשקפים רמות דומות של ביטוי חלבון. הימנע תאי יש ביטוי חלש מדי או חזקים מדי על מנת להפחית את השתנות לתא במדידות קרינה פלואורסצנטית.
  5. Titrate את עוצמת הקלט של הלייזר.
    1. 780 ניר ננומטר לייזר המחוברים מיקרוסקופ קונפוקלי
      1. השתמש בפונקציה אקונומיקה התוכנה למטרה רצועות ליניארית בתוך גרעין התא חשיפה סריקות לייזר יחיד (רזולוציה 512 x 512 פיקסלים, זום X1, מולבן אזור 50 x 4 פיקסלים, 12.8 µs פיקסל להתעכב זמן, איטראציה x1) דרך המטרה שמן (100 X / 1.3 נה).
      2. להתאים את האחוז שידור לייזר (באמצעות התוכנה/חומרה בנוי למערכת מיקרוסקופ לייזר על ידי היצרן) ל 5% מבלי לשנות הגדרות אחרות כלשהן.
      3. המקום תא במרכז השדה. לחץ על האזור של כלי הריבית (ROI), ואת לצייר קו או תיבת (כ 50 x 4 פיקסלים) בגרעין באמצעות העכבר, ולחץ על הלחצן "אקונומיקה" כדי לגרום נזק לדנ א.
        הערה: בשלבים הבאים הקרנה, "הלבנת" צריך להיות מוגברת במרווחים של 5% ל-40% או עד 100% במידת הצורך.
      4. 800 ננומטר לייזר ניר המצורפת מיקרוסקופ epi-זריחה
      5. לשלוט כוח קלט (63 X / 1.4 NA) שלב ניגודיות שמן טבילה אובייקטיבית שסיבוב ממונע של מסנן קיטוב הציג הנתיב של קרן, רכוב על32,מבוקר-מחשב הבמה המסתובבת ממונע39 , 58.
      6. להתאים את הזווית מקטב (°) ומדידת כוח קלט (mW) הזנת המיקרוסקופ, באמצעות מד כוח לייזר. לקבוע את הזוויות מקטב לספק קלט כוחות שנעים בטווח שבין 20 mW-155 mW ב 5-10 mW במרווחים.
      7. לקבוע את זווית מקטב המתאים כדי 20 mW הספק קלט.
        הערה: עבור מערכת הלייזר שלנו, אם הזווית מקטב הוא 40 °, הכוח קלט הוא 65 מגוואט. להגדיל את כוח קלט עם גידול של 5-10 מגה-וואט.
  6. לניתוח תא חי, ללכת שלבים 6.1 ו- 6.3. לגילוי immunofluorescence של חלבונים אנדוגני או שינויים המשך סעיף 5. לאחר הניתוח, עבור לשלב 4.7 עבור טיטור נוספת של הכוח לייזר. כדי לנתח את הדרישה פקטור נגד הזרם, עבור אל סעיף 7.
    הערה: גיוס של גורמים BER והן NHEJ היא מהירה (בתוך דקות ספורות), ארעי (< ~ 30 דקות h - 1 בהתאם הפוסט גורם ו- < ~ 4 h נזק אינדוקציה, בהתאמה). לעומת זאת, הגיוס של גורמים HR Rad51 ו cohesin לזיהוי ב ~ 30 min - 1 h, הם נוטים להימשך יותר מ 8 שעות לא מתוקן DNA נגעים44,50,51. לכן, זה הכרחי לבחון בתקופה שונה נקודות פוסט הקרנה עבור גורמים שונים לתיקון.
  7. עולה כוח קלט במרווחים הרצוי (כלומר, 5% 780 ניר לייזר ו- 5-10 mW עבור ניר 800) כמו שלב 4.4, וחזור על הצעדים 4.5-4.7 על סט חדש של תאים כדי לקבוע את הסף (50% של תאים פגומים הצג הגיוס) ואת שיא (100% של תאים הצג גיוס) עבור כל חלבון.

5. immunofluorescence מכתים

הערה: לצורך זיהוי של שינוי חלבון קוולנטיות, כגון נקוב (סמן נזק מורכבות) ו- H2AX זרחון (γH2AX) (DSB מרקר), כמו גם cyclobutane פירימידין דיימר (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) ו- 8-oxoguanine (8-oxoG) (crosslinking ו בסיס נזק סמנים, בהתאמה), תאים חייב להיות קבוע, מוכתם נוגדנים ספציפיים. בנוסף, מומלץ לאשר התוצאות המתקבלות עם החלבונים רקומביננטי מתויגות fluorescently על ידי זיהוי נוגדנים של החלבונים אנדוגני, כדי להבחין בין חפצים המושרה על ידי ביטוי של חלבונים פיוז'ן רקומביננטי.

  1. לתקן תאים בנקודות זמן שונות לאחר נזק אינדוקציה (שלב 4.5) תלוי בגורמים על-ידי החלפת המדיה תרבות (ראה שלב 1.1) 1.5 מ של 4% paraformaldehyde/1 X PBS 10 דקות ב- RT.
    התראה: Paraformaldehyde אדים רעילים, כל העבודה צריכה להיעשות בשכונה fume מאוורר.
  2. להסיר 4% paraformaldehyde/PBS ולהוסיף 1 מ"ל של 0.5% סבון/PBS 10 דקות ב- RT.
  3. להסיר תאים דטרגנט/PBS ולשטוף 0.5% 2 מ ל- PBS, עבור 5 דקות פעמיים, דגירה בתאים 2 מ"ל של חסימת פתרון (10% עגל סרום, 1% BSA/PBS) עבור h 1-RT.
  4. הסרת חסימה פתרון, להוסיף 2 מ של PBS לתאים, והחלף PBS 250 µL פתרון נוגדן ראשוני של 3% BSA/PBS לילה 4 ° C או h 1 בשימוש RT. 1:200-שבערך דילול (ריכוז טיפוסי כ 1 µg/mL, נחוש מדעית) עבור נוגדנים ספציפיות עבור סימני נזק-דנ א שונים (למשל, γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); רופאות/6-4PP (נזק crosslinking); 8-oxoG/DNA glycosylases (למשל, NTH1) (בסיס נזק); PAR (נזק מורכבות במינון גבוה)).
  5. הסר את הפתרון נוגדן לשטוף עם 2 מ של PBS עבור 5 דקות פעמיים, הסר PBS ואת דגירה עם משני-נוגדן 250 של µL 0.1%, 3% BSA/PBS עבור h 1 בחושך-RT.
  6. להסיר את הפתרון נוגדנים משניים, להוסיף 2 מ של PBS עבור 5 דקות פעמיים ולהשאיר תאים ב- 1.5-2 מ"ל PBS ב 4 ° C עבור הדמיה בשלבים 6.1 ו- 6.2.

6. ניתוח כמותי זריחה של Immunostained או תאים חיים

  1. לכידת תמונות של תאים מוכתם או חי (n > 10) באמצעות מיקרוסקופ המשמש הקרנה. למערכת מיקרוסקופ epi-זריחה, להשתמש ברזולוציה של 1,344 x 1,024 פיקסלים ולשמור תמונות כקובצי TIFF 16 סיביות. לשימוש מיקרוסקופ קונפוקלי, 1 X הגדלה; ללייזר עבור GFP/FITC, 594 הנה לייזר עבור Cy3/mCherry; 512 x 512 או 1,024 x 1,024 פיקסלים עבור רזולוציית התמונה; סריקה מהירות 5, מספר: 1 עבור סריקה מהירה או 2 + עבור ממוצע של מעל סריקות מרובות כדי לשפר את האות לרעש יחס.
  2. השתמש ניתוח התמונה תוכניות שנועדו למדוד את עוצמת פיקסל.
    1. השתמש בכלי מלבן אמצעי האחסון כדי לצייר רועי סביב האתר נזק בתמונה תא בודד. השתמש באותו גודל רועי כדי למדוד את האות פלורסצנטיות רקע את נוקלאופלזמה הסמוך, אך לא חופפים עם האתרים נזק. . זה חשוב עבור נרמול photobleaching הקשורים במערכת מיקרוסקופ קונפוקלי
    2. למדידת קרינה פלואורסצנטית אותות באמצעות תוכנית ניתוח תמונה, לחץ על "נפח דו ח ניתוח" מצאה שבתיבה הכלי. יופיע חלון חדש. תחת הסעיף "נתונים כדי להציג", רק את "שם" ו- "צפיפות" התיבות הסימון. ואז לחץ על "סיום" כדי להמחיש את המידות.
    3. לייצא את ערכי תוכנית גיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על סמל שולחן נמצא בחלק התחתון של חלון דוח אמצעי האחסון, בחר "הלשוניות (בפורמט אקסל)" עבור שדה מפרידים ו- "קובץ" עבור ייצוא היעד.
    4. כדי לקבל אותות יחסית, להשתמש בתוכנית גיליון אלקטרוני כדי לחלק את עוצמת קרינה פלואורסצנטית באתר נזק (עמודה 1) מאת בפקד זה רקע (עמודה 2) באזור נוקלאופלזמה ולחסר 1 עבור נרמול.
  3. קרינה פלואורסצנטית כמותיים בזמן אמת זמן-קורס ניתוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי
    1. לזהות תאים חלבון-חיוביות מתויגות fluorescently באמצעות המיקרוסקופ כמו שלב 4.3.
    2. לבצע הדמיה זריחה זמן לשגות לפני הנזק, בנקודות זמן שונות לאחר נזק אינדוקציה בסעיף 4. קודם צייר את מלבין ROI (עבור נזק אינדוקציה) ולאחר מכן בחר "רכוש > סדרות זמן"-תפריט להגדיר "מספר" 20, וכן את "עיכוב מחזור" בתור 30 s, לבחור "מלבין פעם אחת אחרי הסריקה הראשונה" ולאחר מכן לחיצה על 'התחל ב''. במקרה זה, התמונה הראשונה היא רכשה מייד לפני הנזק אינדוקציה, ואחריו רכישות תמונה 19 במרווח s 30. מרווחי הזמן ("עיכוב מחזור") יכול להשתנות בהתאם למטרת המחקר.
    3. לאחר השלמת ייבוא תמונות, לחץ על "מתכוון", לצייר את רועי-האזור נזק. לחץ על "הצג טבלה" כדי להשיג שולחן המפרט את העוצמה בתוך ROIs שנבחר. לנרמל את הנתונים על-ידי חלוקת עוצמת קרינה פלואורסצנטית האתר נזק בנקודות זמן שונות מעוצמת באותו האזור לפני הנזק, לחסר ב- 1.

7. קטן Interfering RNA (siRNA) תרביות תאים

הערה: דלדול של החלבון המטרה היא דרך יעילה ניסחו את הדרישה במעלה הזרם גורם לגיוס חלבון שנצפה נזק לאתרים (סעיף 4). יתר על כן, האסטרטגיה היא הדרך הטובה ביותר לטפל יחודיות של נוגדן המשמש לצורך זיהוי immunofluorescence (ראה סעיף 5).

  1. יום 1: הכן בארות 2 תאים הלה לתוך צלחת 24-ובכן על ידי זריעה 6-8 x 10 תאים הלה4 בתקשורת תרבות 0.5 mL מכל קידוח, אחד עבור פקד siRNA תרביות תאים, אחד עבור PARP1 siRNA (5'-CCG אגא AAT CTC TTA סי טי סי-3').
  2. יום 2: לאשר כי תאים הם כ- 40-50% confluent. לבצע בסיבוב הראשון של תרביות תאים siRNA: לדלל 5 siRNA pmol לתוך µL 25 ללא סרום תרבות המדיה, להוסיף 3 µL שומנים מבוסס תקנים ריאגנט לתוך הצינור, מערבבים בעדינות, תקופת דגירה של 5-10 דקות ב- RT.
  3. לשטוף את התאים עם מדיה תרבות טריים 0.5 מ ל פעם אחת, ולשמור את התאים בתקשורת תרבות טריים 0.5 mL (ראה שלב 1.1).
  4. הוסף את מתחמי ה-RNA-השומנים לתאים, לערבב בעדינות על ידי הטיית המנה אחורה וקדימה. להחזיר את התאים החממה כמו שלב 2.1.
  5. תשאף המיקס תרביות תאים, וכן להוסיף 0.5 mL טריים תרבות המדיה (שלב 1.1) לאחר 6 שעות.
  6. יום 3: ביצוע השלב השני של siRNA transfections (ראה צעד 7.2). זרע לאחר מכן, 60-100% של התאים לתוך תבשיל gridded coverslip 35 מ מ, כפי שמתואר בשלב 2.3.
  7. יום 5: להמשיך עם microirradiation לייזר באמצעות התנאי כוח לייזר אופטימלית לגיוס מירבי של הגורם של עניין, כפי שנקבע על-ידי סעיף 4. בדרך כלל, דלדול יעיל יכול להיות שנצפו בכ-60-90% של תאים הלה.
    הערה: כחלופה ומשלימים הגישה, מעכבי, אם הוא זמין, ניתן לעכב את הפונקציה של הגורם של עניין32,44. ניתוח ההשפעה של עיכוב DDR איתות, להוסיף 20 מעכבי PARP מיקרומטר, 1 מיקרומטר PAR glycohydrolase (PARG) המעכב או 10 מיקרומטר, DNA תלוית חלבון קינאז עם מעכב קטליטי יחידה משנית (DNA-PKcs) ו- 10 מיקרומטר כספומט מעכב ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) מנות h 1 לפני הנזק אינדוקציה. להוסיף דימתיל סולפוקסיד רק לתאים שליטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות תאים PtK2 stably להביע את EGFP-53BP11220-1711 או TRF2-YFP, לייזר כוח קלט טיטור בוצע כדי לקבוע את המצב האופטימלי עבור שלהם גיוס (איור 1)32.

באתרים נזק גבוה קלט-כוח לייזר, משמעותי התקבצות של שיקגו (crosslinking נזק שנוצר בדרך כלל על ידי אולטרה סגול (UV) נזק) כמו גם glycosylase DNA GFP-NTH1 במיוחד מזהה נזק הבסיס נצפו. בנוסף, אותות XRCC1 ו- CtIP גבוה נצפו, המשקף עלייה במספר מעברי סטרנד ולאחר הוכחת נזק לדנ א מורכב הוא המושרה בתנאים האלה (איור 2 א). Glycosylases DNA אחרות התמזגו חלבונים פלורסנט (לדוגמה, ה-GFP-nei endonuclease השמיני דמוי 2 (NEIL2) ו- GFP-8-Oxoguanine glycosylase (OGG1)) כמו גם condensin אני יכול לשמש גם נזק הבסיס סמני44,59. בקנה אחד עם זה, מצאנו כי התגובה PAR הוא המושרה באופן משמעותי על ידי לייזר קלט-כוח גבוה (כלומר, אנרגיה, irradiance במקום מוקד הדגימה), אבל רק חלש על ידי לייזר נמוך עוצמה במקום מוקד (איור 2B, למעלה משמאל). אותות נקוב, אבל לא PARP1 חלבון לוקליזציה, באתרים נזק היו רגישים לחומר המדכא PARP (נתונים לא מוצג). בנוסף, siRNA ספציפיות עבור PARP1 פחתה PAR והן PARP1 באתרים נזק (איור 2B, למעלה מימין)32. בתנאי מתח גבוה קלט, γH2AX מופיע בתחילה באתרים נזק, מתפשט במהירות את הגרעין כולו בצורה כספומט/DNA-PK-תלוי (איור 2B, התחתון). כספומט/DNA-PK-תלוי דומה הפצה של γH2AX דווח γ-הקרנה60. תוצאות עקביות התקבלו עם 800 והן 780 nm ניר לייזר מערכות32. יחדיו, התוצאות מגלים שזה אפשרי titrate עוצמת הקלט הלייזר (ולכן, אנרגיה, irradiance במקום מוקד בתא) כדי למצוא את התנאים שבהם זירוז דרגות שונות של התגובה PARP מתאם עם המספר של DSBs ו המורכבות של נזק לדנ א.

התוצאות לעיל בתחילה הציע כי הנוכחות של נזק לדנ א מורכב שייתכן שגרמו גיוס דיפרנציאלית של 53BP1 ושל TRF2. מעניין, עם זאת, גיוס1220-1711 53BP1 לאתר נזק צריכת חשמל נמוכה היה ביעילות מעוכבים על ידי הנוכחות של האתר השני נזק הנגרם על ידי גבוהה-קלט-כוח בתוך גרעין התא אותו (איור 3 א בניגוד איור 3B ). התוצאות מצביעות על נזק גבוה-קלט-כוח לייזר העלמת 53BP1 גיוס טרנס. עיכוב של PAR על ידי מעכבי PARP, כמו גם עיכוב של γH2AX גרעיני רחב מתפשט על ידי שחזור מעכבי כספומט/DNA-PK הגיוס הזה אפילו לאתר את הספק גבוה קלט הנזק (איור 3 א). . זה נבדל הגיוס של המתווך של DNA נזק מחסום 1 (MDC1) לאתרים נזק, אשר היה בעיקר מעוכבים על ידי פיזור γH2AX, לכן, שוחזר על ידי מעכבי כספומט/DNA-PK, לא מעכבי PARP (איור 3A, התחתון). חשוב לציין, hyperactivation של PAR על ידי עיכוב טירוף עוצר (מבלי להשפיע על מצב γH2AX) ביעילות מדכאת הגיוס הראשוני 53BP1 אפילו באתרים נזק קלט צריכת חשמל נמוכה בדרך כלל המגייסות 53BP1 ביעילות (איור 3B)32. יחדיו, תוצאות אלה מציינים את PAR איתות, ואת לא הסוג של נזק כשלעצמה, משבשת גיוס 53BP132. זה דוגמה צדדיות של microirradiation לייזר, אשר מאפשר לנו לבחון כיצד מספר אתרי נזק ולהשפיע לתקשר אחד עם השני.

Figure 1
איור 1 : כוח קלט טיטור של לייזר. כדי לקבוע את עוצמת הלייזר לשימוש עבור ניסויים עתידיים, תאים PtK2 stably להביע את EGFP-53BP1 ו- TRF2-YFP היו נתונים לייזר microirradiation עם כוחות קלט הנעים בין 20 mW, 155 mW באמצעות את 800 nm ניר הפוכה/לייזר epi-קרינה פלואורסצנטית מערכת מיקרוסקופ. EGFP-53BP1 גיוס היה במעקב במשך 15 דקות פוסט הקרנה (עבודות שירות), בעוד TRF2-YFP התאים היו במעקב במשך 6 דקות חוקר פרטי המספרים מעל פסי מייצגים את מספר התאים הראה גיוס חיובי של EGFP-53BP1 או TRF2-YFP לאתרים נזק מעל המספר הכולל של תאים נבדק. איור זה שונה מקרוז Saquilabon32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : אינדוקציה של נזק מורכבות ו- DDR חזקים איתות על ידי לייזר קלט-כוח גבוהה. (א) גבוהה-קלט-כוח לייזר microirradiation גורם נזק מורכבות לרבות מעברי סטרנד (גם SSBs וגם DSBs), crosslinking נזק הבסיס. רופאות, XRCC1 (חלטורה, DSB תיקון), NTH1 אן glycosylase (בער), CtIP (אלטרנטיבית NHEJ ו HR) מוצגים (רק GFP-NTH1 היא תמונה תא חי, השאר הם נצפו בעקבות immunofluorescence מכתים). קרינה פלואורסצנטית כמותיים מדידות בעוצמה של נזק באתר הגיוס נעשו כאמור בפרוטוקול בסעיף 7, מוצגים בו boxplots. המספר הכולל של תאים (n) שנבדקו ניתן לראות תחת כל חלבון כימות. p-הערך < 0.05. (B) העליונה (משמאל): אותות חזקים PAR ו PARP1 באתרים נזק קלט-כוח גבוה. העליון (מימין): PARP1 siRNA דלדול מספיקה לבטל את PAR אות32,44. למטה: זמן הקורס ניתוח של γH2AX בתאים עם נמוך (למעלה) וגבוה (למטה) קלט כוח נזק כמצוין. גודל ברים = 10 מיקרומטר. איור זה שונה מקרוז Saquilabon32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הפעלה דיפרנציאלית של DDR איתות משפיע על גיוס 53BP1 נזק אתרים- (A) העליון: תאים PtK2 stably לבטא EGFP-53BP11220-1711 היו microirradiated עם נמוך (15%) וגם גבוהה (25%) כוח קלט (לבן, צהוב ראשי חץ, בהתאמה) בגרעין אותו באמצעות nm 780 מערכת ניר/קונאפוקלית מיקרוסקופ. זה היה מתבצע בנוכחות דימתיל סולפוקסיד, PARP מעכב (Pi), או השילוב של ATM, DNA-PK, מעכבי PARP (Ai + Di + Pi) כמצוין. הדמיה לחיות תאים של EGFP-53BP11220-1711 נכבשה ב 30 דקות לאחר DSB אינדוקציה. התאים היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עם נוגדן ספציפי γH2AX כסמן DSB. שינויים בעוצמה זריחה של EGFP-53BP11220-1711 באתרים נזק מוצגים מימין עם p-ערכים (ז"א ערכים: דימתיל סולפוקסיד, ± 0.03 נקודות 0.02; Pi, 0.34 ± 0.19; Ai + Di + Pi, 0.98 ± 0.23). למטה: את ההשפעה של הטיפול Pi ל- Ai + Di על לוקליזציה MDC1 עם נזק קלט-כוח גבוה כפי שצוין. סולם בר הוא 10 מיקרומטר. מימין: שינויים של אותות זריחה של MDC1-קלט-מתח גבוה נזק אתרים בנוכחות דימתיל סולפוקסיד, Pi או Ai + Di עם p-ערכים (ז"א ערכים: דימתיל סולפוקסיד, 0.07 ± 0.10; Pi, ± 0.05 0.07; Ai + Di, 0.86 ± 0.26). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. N = 10 עבור כל אחת מהמידות בעוצמה. (B) ההשפעה של שיפור של PAR אותות על ידי טיפול PARGi על גיוס 53BP1 אנדוגני לאתרים נזק קלט צריכת חשמל נמוכה. מימין: Boxplots המייצג את ניתוח כמותי של הגיוס 53BP1 אנדוגני (שזוהה על-ידי immunofluorescence מכתים) עם לייזר קלט צריכת חשמל נמוכה (60 mW 800 nm ניר הפוכה/לייזר epi-זריחה מיקרוסקופ למערכת) ב 15 דקות לפרסם הקרנה בנוכחות דימתיל סולפוקסיד או PARGi כמצוין. משמאל: PAR ו 53BP1 immunofluorescence צביעת תמונות של תאים פגומים בתנאים אותו עם טיפול דימתיל סולפוקסיד או PARGi. לטיפול דימתיל סולפוקסיד, בחן 100% של תאים (N = 25) הציג 53BP1 חזקים גיוס (מימין). לעומת זאת, הראה 20/25 אין גיוס 53BP1 בנוכחות PARGi (למטה מימין) ותאים 5 הראה גיוס חלש. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. איור זה שונה מקרוז Saquilabon32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יתרונות השימוש microirradiation לייזר למחקר DDR הם:

1. זה ריאלי לזירוז סוגים שונים, כמויות של ה-DNA נזק ממעברי סטרנד פשוטים מורכבים נזק לדנ א, כדי לזהות גורמים שונים לתיקון על ה-DNA נזק אתרים על-ידי התאמת הפרמטרים הקרנה לייזר. זה גם אפשרי לגרום נזק מספר פעמים, גרעין התא אותו, על מנת להעריך את ההשפעות טרנסג'נדרים (כמו איור 3).

2. חשוב, אירועים-נזק ואתרי משני האירועים המתרחשים במקומות אחרים בגרעין ניתן בקלות להבחין.

3. זה אפשרי לבצע מדידות בזמן אמת ברזולוציה גבוהה של חלבון מתויגות fluorescently dynamics בתגובה נזק ברמה תא בודד, כולל, אבל לא מוגבל: פורסטר תהודה אנרגיה העברה (סריג), קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה ( FLIM), זוג קורלציה לפונקציה (ביחד), וכדומה, כדי ללכוד DDR בתאים חיים.

4. שילוב עם טיפול הפרעה או מעכבי RNA, זה פשוט למדי לבדוק את הדרישה במעלה הזרם גורם במספר קטן של תאים.

5. זה צריך להיות גם ציין את ניר (או הירוק) קרינת לייזר אינו דורש רגישות עולה מראש של ה-DNA עם תחליפי נוקלאוטיד או צבעי DNA intercalating, וכך להימנע לא רצויות תופעות לוואי על האריזה כרומטין. זאת בניגוד מערכת לייזר UV דורש רגישות עולה במינון נמוך וגורם aberrant DDR-מינון גבוה-39,-49,-61.

שלבים קריטיים בתוך השינויים/הפרוטוקול ופתרון בעיות
חשוב כי התאים נמצאים בתנאים בריא כאשר DDR הניתוחים מבוצעים על מנת למזער את החפץ ווריאציות ניסיוני. תאים transfected דנ א או siRNA הם בדרך כלל יותר רגישים או מנותק בקלות כאשר גדל על coverslip gridded. זה עוזר לשמור תאים לתקופה קצרה ב הכימית תרביות תאים כל עוד תקנים עובד, ואת הזרעים יותר תאים הנמצאות transfected על המנה gridded coverslip לעומת התאים untransfected. דבר זה הכרחי על מנת להשיג confluences תא דומות עבור הניסויים.

בעבר דווח כי הרחוב תימידין מוביל רמות גבוהות של γH2AX ב תאים מסונכרן62, אשר עשויים להשפיע על DDR, להטות את התוצאות. יתר על כן, האות γH2AX קו הבסיס הוצגה להיות גבוה בשלב G2/מאזו גם ללא כל נזק אקסוגני63,64. אנחנו, לעומת זאת, אסור לצפות כל אות γH2AX משמעותית ב נוקלאופלזמה להשפיע או להפריע התגובה γH2AX ספציפיים באתרים נזק לייזר המושרה בתאי מסונכרנים בשלב S/G2 על ידי בלוק תימידין זוגי51.

על מנת לקבל תוצאות עקביות, יש צורך לבדוק מעת לעת את פרמטרי פלט מערכת הלייזר (כל 2-4 שבועות) ואת יישור אופטי (כל חודשיים). לאורך זמן, רכיבי מערכת לייזר ייתכן שתצטרך להיות מסודרים מחדש, המטרה עדשה עלולים להינזק צורך להחליף ו היציבות של האנרגיה קלט עשויים להשתנות. המפתח הוא להעריך את הנוכחות של נזק (crosslinking (שיקגו ו/או 6-4PP), נזק הבסיס (8-oxoG)), סמן חלבונים (למשל, ה-DNA glycosylases, Rad51, cohesin ו- Ku) ו PAR השינוי המתואר פרוטוקול זה כדי לקבוע את המינון ואת המורכבות של נזק לדנ א המושרה על ידי מערכת מיקרוסקופ לייזר משמש.

מגבלות של הטכניקה
Microirradiation לייזר יש מגבלות. נזק לדנ א המושרה על ידי קרן הלייזר מאוד מרוכזים באזור אחד בגרעין בהשוואה באופן טבעי נזק זה עלול להתפשט ברחבי לגרעין. זה עשוי להשתנות כמה נזק איתות הופץ בכרומטין של השכן או בגרעין. מאז מספר נמוך יחסית של תאים יכול להיות מוקרן בבת אחת, מבוסס-אוכלוסייה הביוכימי מבחני (למשל, תספיג, חלבונים מורכבים טיהור, immunoprecipitation כרומטין (ChIP)) לא ניתן בקלות לבצע. הסתמכות על חלבונים מתויגות fluorescently (עם הביטוי של חומרים אקסוגניים או אפילו עם אלו לידי ביטוי endogenously באמצעות תג בתיווך CRISPR ההכנסה) עבור הדמיה דינמי גורם המחקרים לפגיע חלבון פיוז'ן-induced חפצים. את טיבה של נזק לייזר המושרה ואת ההשפעות האפשריות מלאכותית של מתויג חלבונים, ולכן, צורך להעריך by comparison with את התוצאות תוך שימוש הדי קונבנציונאלי פגיעה שיטות (IR, כימיקל מזיק סוכנים), ועם את אנדוגני חלבונים לא מתויגים (אבל לפעמים זה לא ניתן לבצע ניסויים מקבילה מלאה).

משמעות לגבי שיטות קיימות
השימוש endonucleases רצף ספציפי כגון-SceI, FokI, AsiSI ו- PpoI מספק אסטרטגיית חלופה לזירוז בייעודי לאתר DSBs (DSBs פשוטה בתכלית האיסור). ניתן לנתח גורם גיוס או שינויים על-ידי בייעודי לאתר או ברמת הגנום שבב ניתוח65,66,67,68,69. אינדוקציה יחסית סינכרונית של DSBs יכולה להיות מושגת על-ידי תיוג של endonuclease עם קולטן הורמונים סטרואידים, אות השפלה (degron) עבור רוברטסונית גרעינית מהירה והשפלה, בהתאמה65,66 , 67 , 68 , 69. אחד יש לקחת בחשבון, עם זאת, זה את היעילות של הביטוי endonuclease ונגישות באתר היעד, וניתן המתמשכת תיקון המצב המשתנה בתאים שונים באתרי היעד השונות. Heterogeneities אלה ייכללו בממוצע בניתוח צ'יפ מבוסס-אוכלוסייה, אשר עשויים להטות את התוצאות. לייזר microirradiation, מצד שני, מציע ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרי טמפורלית (אלפיות שניה) כמו גם רזולוציה מרחבית (submicrometer) של דינמיקה התגובה נזק, אשר יכול להיות מנותח ברמת תא בודד. צפיפות נזק גבוה, לעומת זאת, עשויים להשפיע על התוצאות. שתי אסטרטגיות יכול להיות רגיש לחפצים הנגרמת על ידי נוגדנים נגישות ו/או פפטיד תיוג. זה, לכן, חשוב להבין את היתרונות והחסרונות של שתי אסטרטגיות, אשר עשויים פוטנציאלית לשמש משלימים אחד את השני.

יישומים עתידיים
עם קידום מהיר של קרינה פלואורסצנטית הדמיה וטכניקות dynamics, הרב-גוניות של מערכות לייזר לזירוז כמויות שונות וסוגים של נזק לדנ א מיקומים ספציפיים ועל הבמה מחזור התא מספק הזדמנות חשוב יחקור את הפלאפון, תגובות מולקולרית DNA נזק עם רזולוציה גבוהה ייתכן ברמה תא בודד. ניתן יהיה, לדוגמה, לבדוק נזק ספציפי לאתר, גרעין, תא-ברוחב DDR האות התמרה חושית עם רזולוציה של אלפיות השנייה (למשל, יזהה אינטראקציות מולקולרי או שינויים המתרחשים באופן בלעדי באתרי נזק, לבחון שינויים דינמיים של הכרומטין ב בזמן אמת, או להתבונן בזמן אמת הפצת נזק איתות מאתרי נזק את הגרעין כולו). זה גם אפשרי לעקוב אחר באותו התא על פני תקופה ארוכה של זמן לבחון את ההשפעות של נזק לדנ א על גורל. אנחנו לדמיין כי השיטות microirradiation לייזר, אם משתמשים בו כראוי, ימשיך לתרום באופן משמעותי לקידום של השדה תיקון ה-DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ד ר אקירה Yasui ב אוניברסיטת Tohoku, יפן על פלסמיד ביטוי GFP-NTH1, ד ר ארוס Lazzerini Denchi המחקר סקריפס המכון, הויה שבקליפורניה עבור TRF2-YFP ו- EGFP-53BP11220-1711 ביטוי פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי חיל האוויר Office של המחקר המדעי (FA9550-04-1-0101), בקמן לייזר המכון inc. לקרן (M.W.B), את מלגת קרן פורד של האקדמיה הלאומית למדעים (ל B.A.S), ואת ה-NSF MCB-1615701 CRCC CRR-17-426665 (ל- Y ק.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

גנטיקה גיליון 131 לייזר microirradiation לייזרים ברפואה נזק לדנ א DNA נזק תגובה תיקון ה-DNA פוליפוני (ADP-ריבוז) פולימראז (PARP) נזק מורכבות לנטישה של מעברי נזק הבסיס
לייזר Microirradiation ללמוד <em>In Vivo</em> הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B.… More

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter