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Genetics

लेजर Microirradiation Vivo में अध्ययन करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं सरल और जटिल डीएनए क्षति

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56213
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2,3,4, 1
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य का वर्णन कैसे लेजर microirradiation का उपयोग करने के लिए डीएनए क्षति के विभिंन प्रकार के प्रेरित अपेक्षाकृत सरल किनारा टूट जाता है और जटिल क्षति सहित, का अध्ययन करने के लिए डीएनए नुकसान संकेतन और vivo में नुकसान साइटों पर मरंमत फैक्टर विधानसभा .

Abstract

डीएनए नुकसान सेल में विशिष्ट संकेतन और मरंमत प्रतिक्रियाओं लाती है, जो जीनोम अखंडता के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है । लेजर microirradiation एक मूल्यवान प्रयोगात्मक उपकरण vivo मेंडीएनए क्षति प्रतिक्रिया (DDR) की जांच करने के लिए बन गया । यह सेल नाभिक में एक submicrometer क्षेत्र तक ही सीमित लेजर प्रेरित नुकसान के जवाब में macromolecular गतिशीलता के वास्तविक समय उच्च संकल्प एकल सेल विश्लेषण की अनुमति देता है । हालांकि, विभिंन लेजर शर्तों प्रेरित नुकसान के प्रकार में मतभेदों की सराहना के बिना इस्तेमाल किया गया है । एक परिणाम के रूप में, क्षति की प्रकृति अक्सर अच्छी तरह से लक्षण या नियंत्रित नहीं है, भर्ती या संशोधन प्रोफाइल में स्पष्ट विसंगतियों के कारण । हम प्रदर्शन किया है कि विभिंन विकिरण की स्थिति (यानी, विभिंन तरंग दैर्ध्य के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विभिंन इनपुट शक्तियों (irradiances) के पास एक femtosecond (एफएस) के पास अवरक्त (NIR) लेजर) अलग DDR और मरंमत प्रोटीन विधानसभाओं प्रेरित किया । यह डीएनए के प्रकार का उत्पादन नुकसान को दर्शाता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे अनुमापन लेजर इनपुट शक्ति के विभिंन मात्रा और डीएनए क्षति की जटिलताओं, जो आसानी से आधार और crosslinking नुकसान, अंतर पाली (ADP ribose) (सममूल्य) संकेत का पता लगाने के द्वारा निगरानी कर सकते है की प्रेरण की अनुमति देता है, और मार्ग-विशिष्ट मरंमत फैक्टर नुकसान साइटों पर विधानसभाओं । एक बार नुकसान की स्थिति निर्धारित कर रहे हैं, यह अलग नुकसान जटिलता और अंतर के रूप में अच्छी तरह से ब्याज के किसी भी पहलू पर ऊपर कारक (एस) की कमी संकेतन नुकसान के प्रभाव की जांच संभव है ।

Introduction

Vivo में डीएनए क्षति संकेतन अच्छी तरह से समझ नहीं है
vivo में, डीएनए histones और अन्य कारकों क्रोमेटिन फाइबर के रूप में के साथ जटिल है. क्रोमेटिन संरचना का विनियमन डीएनए चयापचय के लिए सर्वोपरि महत्व का है । उदाहरण के लिए, citrullinated वैरिएंट H2AX द्वारा phosphorylated है गतिभंग-telangiectasia (एटीएम) और अन्य kinases निम्नलिखित डबल-किनारा टूटता है (DSB) प्रेरण, और DSB क्षति संकेत प्रवर्धन के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य के लिए एक डॉकिंग साइट प्रदान करने के रूप में कारकों. क्षति सिग्नलिंग और मरंमत मार्ग पसंद के प्रसार को गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त साइटों पर स्थानीय क्रोमेटिन संरचना से प्रभावित हो1। क्रोमेटिन remodeling कारकों में से एक नंबर, citrullinated chaperones, और citrullinated संशोधित एंजाइमों वास्तव में नुकसान साइटों को भर्ती कर रहे है और कुशल डीएनए की मरंमत के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्रोमेटिन में DDR विनियमन के महत्व पर प्रकाश डाला और2 मरंमत , 3 , 4. इसके अलावा, क्षति साइट clustering या स्थिति खमीर और drosophila5,6,7,8, में जीन loci के स्थानीयकरण की याद ताजा में मनाया गया था उपपरमाणु डिब्बा जीन विनियमन9,10के साथ जुड़े । माउस और मानव कोशिकाओं में हाल के अध्ययनों से भी DSB साइटों, जो मरंमत निष्ठा और मार्ग विकल्प11,12प्रभाव का जमावड़ा पता चला । यह संभावना है कि DDR/मरंमत भी परिचित परमाणु वास्तुकला, उच्च क्रम क्रोमेटिन संगठन, और कोशिका नाभिक में गुणसूत्र गतिशीलता से जुड़ा हो सकता है उठाती है । इस प्रकार, यह उच्च संकल्प तरीकों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है के लिए एक जीवित कोशिका में अंतर्जात परमाणु पर्यावरण के संदर्भ में DDR और मरंमत की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए कम समझ और दीर्घकालिक डीएनए क्षति के परिणाम ।

Gauging में सममूल्य पोलीमरेज़ (प्प) की महत्वपूर्ण भूमिका हद तक और नुकसान के प्रकार और नुकसान स्थल पर प्रोटीन विधानसभा विनियमन
PARP1 एक डीएनए निक संवेदक तेजी से डीएनए क्षति है कि डीएनए की मरंमत13में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता द्वारा सक्रिय है । PARP1 मूलतः एक्स के साथ कार्य करने के लिए सोचा था रे मरंमत पार 1 पूरक (XRCC1) के आधार पर उत्पाद शुल्क की मरंमत (मांक) की सुविधा है, लेकिन हाल के अध्ययनों से अंय डीएनए मरंमत रास्ते में अपनी भूमिका प्रकट DSB मरंमत सहित14। सक्रिय PARP1 का उपयोग करता है nicotinamide adenine dinucleotide (णड+) के रूप में एक सब्सट्रेट करने के लिए ADP-ribosylate खुद सहित कई लक्ष्य प्रोटीन, । इस एंजाइम और परिवार के अंय सदस्यों प्प अवरोधकों के रूप में हाल के वर्षों में ज्यादा ध्यान आकर्षित किया है कैंसर के लिए चिकित्सकीय दवाओं के होनहार के रूप में उभरा है । हालांकि प्प अवरोधकों शुरू में स्तन कैंसर जीन में प्रभावी होना पाया गया (BRCA)-स्तन कैंसर की कोशिकाओं में रूपांतरित हो, वहां अब मोनो में अपने प्रभाव के लिए सबूत के ढेर सारे है और डीएनए के साथ संयोजन चिकित्सा हानिकारक एजेंटों/ उत्परिवर्तनों के साथ कैंसर का एक व्यापक स्पेक्ट्रम BRCA15,16,17,18,19,20के लिए सीमित नहीं है ।

आणविक स्तर पर, प्प सक्रियण क्षतिग्रस्त स्थलों पर स्थानीय क्रोमेटिन संरचना के आयोजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया था । बराबर क्रोमेटिन संशोधन एंजाइमों के आश्रित भर्ती DSB मरंमत की सुविधा और मरंमत मार्ग विकल्प हुक्म, नुकसान स्थलों पर बराबर संशोधन के महत्वपूर्ण मचान भूमिका का सुझाव । 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 हम हाल ही में p53-बाध्यकारी प्रोटीन 1 के अपवर्जन (53BP1) बराबर ३२से नुकसान साइटों से प्रदर्शन, 53BP1 के लिए एक वैकल्पिक विवरण प्रदान गैर मुताबिक़ endjoining के आश्रित hyperactivation ( NHEJ) द्वारा प्प अवरोध करनेवाला और DSB मरम्मत मार्ग विकल्प में प्प के महत्व पर प्रकाश डाला३३,३४. PARP1 भी सीधे PARylates और कई डीएनए की मरंमत कारकों की गतिविधि को प्रभावित करता है14।

Vivo में DDR/मरंमत का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में लेजर Microirradiation का प्रयोग
व्यक्तिगत गुणसूत्रों पर उप-माइक्रोन परिवर्तन का उत्पादन करने के लिए लेजर microirradiation पहले १९६९३५ में वर्णित किया गया था और १९८१३६में विस्तार से समीक्षा की । कई दशकों बाद, लेजर microirradiation कोशिका नाभिक में एक परिभाषित submicrometer क्षेत्र में डीएनए क्षति प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था, और एक मूल्यवान तकनीक भर्ती या vivo में डीएनए घावों के लिए विभिन्न कारकों के संशोधनों का अध्ययन करने के लिए सिद्ध किया गया था 13 , ३७ , ३८ , ३९ , ४० , ४१. इस विधि से उन कारकों का पता लगाने की अनुमति देता है जो विशिष्ट विकिरण-प्रेरित घावों (IRIF) को क्षति साइटों३९,४२पर नहीं बनाते हैं । यह भी क्षति साइटों पर दोनों और नाभिक के बाकी हिस्सों में क्रोमेटिन संरचनात्मक परिवर्तन की spatiotemporal गतिशीलता की जांच करने के लिए संभव है । हम ध्यान से विभिंन लेजर प्रणालियों और इनपुट शक्तियों द्वारा प्रेरित DDRs की तुलना में डीएनए क्षति के प्रकार और microirradiation स्थितियों के बीच संबंध का मूल्यांकन करने के लिए३२,४३,४४, ४५. 53BP1 और telomeric के ंयायपालिका भर्ती पैटर्न दोहराने बाध्यकारी कारक 2 (TRF2) पिछले लेजर क्षति अध्ययन में मनाया गया, जो "गैर शारीरिक" लेजर की प्रकृति-प्रेरित नुकसान के लिए आवर्ती चिंता का आधार प्रदान की४६ ,४७,४८,४९. हमने पाया है कि इन स्पष्ट विसंगतियों अब अंतर प्प द्वारा समझाया जा सकता है जो संकेत है कि राशि और प्रेरित नुकसान की जटिलता३२गेज । हम पुष्टि की है कि: 1) लेजर-microirradiated कोशिकाओं (उच्च इनपुट-पावर विकिरण के बाद भी) एक क्षति चौकी नियंत्रण पर निर्भर तरीके से चरण में गिरफ्तार कर रहे हैं और (कम से ४८ ज)३२,५०के लिए व्यवहार्य बने रहते हैं; और 2) मरंमत कारक भर्ती/ईमानदारी पारंपरिक डीएनए हानिकारक एजेंटों और DSB प्रेरण के साथ endonucleases३२,३९,४२द्वारा उपचार के साथ मनाया उन दोहराऊंगा, ४४,५०,५१,५२. इन परिणामों को दृढ़ता से लेजर क्षति प्रेरित सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन की शारीरिक प्रासंगिकता का समर्थन ।

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Protocol

1. बेसिक सेल की तैयारी

नोट: यह कदम अंतर्जात प्रोटीन भर्ती या संशोधन के मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस पता लगाने के लिए है, और एक सेल लाइन के उपयोग के लिए छुरा एक फ्लोरोसेंट टैग संयोजक प्रोटीन व्यक्त । उदाहरण के लिए, Potorustridactylus (PtK2) धानी गुर्दा उपकला कोशिकाओं छुरा व्यक्त EGFP-53BP11220-1711 या TRF2-YFP हमारे पिछले अध्ययन में इस्तेमाल किया गया (चित्रा 1)३२. पूर्व मामले में, 53BP1 (एमिनो एसिड 1220-1711) है कि oligomerization डोमेन, ट्यूडर डोमेन, और ubiquitylation निर्भर भर्ती (UDR) आकृति शामिल है, के क्षेत्र के गठन को बढ़ाया GFP (EGFP-53BP11220-1711) से जुड़े हुए थे । यह फ्यूजन प्रोटीन पूर्ण लंबाई 53BP1५३,५४,५५के नुकसान स्थल भर्ती recapitulates । हेला कोशिकाओं में, फ्लोरोसेंट टैग cohesin के उप यूनिटों (जैसे, hSMC1-GFP५१, GFP-Scc1 (Rad21)५२, और GFP-SA2 ५१) के लिए परिसर में कुशल निगमन सुनिश्चित करने के लिए और दोहराऊंगा करने के लिए व्यक्त किया जाना चाहिए S/G2 कोशिका चक्र चरण-विशिष्ट क्षति साइट भर्ती अंतर्जात cohesin५१।

  1. एक gridded coverslip के साथ एक ३५ mm टिशू कल्चर डिश पर किसी भी अनुयाई सेल प्रकार के बीज व्यक्तिगत कोशिका पहचान के लिए अनुमति देने के लिए । विशेष सेल लाइन के प्रसार दर के आधार पर 36-48 एच में ६०% प्रवाह को प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक कक्ष संख्या समायोजित करें । उदाहरण के लिए:
    1. PtK2 धानी गुर्दे की उपकला कोशिकाओं के लिए (या तो जंगली प्रकार या उन छुरा व्यक्त EGFP-53BP11220-1711 या TRF2-YFP): प्लेट २.० x 104 कोशिकाओं में 2 मिलीलीटर उन्नत न्यूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) 2 मिमी एल के साथ पूरक-Glutamine, 4% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और एंटीबायोटिक दवाओं (१०० यू/एमएल पेनिसिलिन और १०० µ g/एमएल streptomycin), और 7% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन ।
    2. छुरा के साथ हेला कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट संयोजक प्रोटीन GFP-SA2 टैग व्यक्त: बीज १.० x 105 कोशिकाओं में 2 मिलीलीटर Dulbecco है संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% FBS के साथ पूरक, 2 मिमी L-Glutamine, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और १०० µ g/एमएल streptomycin, और 5% CO2के साथ ३७ ° c पर मशीन । अंय हेला कक्षों का उपयोग अनसंशोधित कक्षों या hSMC1-GFP को व्यक्त करने वाले कक्षों सहित भी किया जा सकता है ।
  2. कोशिकाओं का पालन करें और 30-60% संगम पर डीएनए क्षति प्रेरण (ग्रिड संख्या के दृश्य की अनुमति देने के लिए) से पहले 36-48 ज के लिए पैदा करने की अनुमति दें । धारा 4 के लिए आगे बढ़ें ।

2. क्षणिक अभिकर्मक

नोट: अंतर्जात प्रोटीन का पता लगाने के लिए कभी-कभार अच्छे एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं होते. अगर सेल लाइनों वार मार्कर प्रोटीन व्यक्त उपलब्ध नहीं हैं, क्षणिक transfections बाहर ले रहते सेल विश्लेषण के लिए फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन की निगरानी ।

  1. हेला कोशिकाओं के लिए, 1 दिन पर, बीज 6-8 x 104 में ०.५ मिलीलीटर संस्कृति मीडिया में एक 24 अच्छी तरह से प्लेट और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक १००% humidified मशीन में मशीन और 5% CO2के साथ में कोशिकाओं । संस्कृति मीडिया शर्तों के लिए चरण १.१ देखें ।
  2. 2 दिन, एक स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड एक फ्लोरोसेंट टैग डीएनए मरंमत कारक एंकोडिंग का उपयोग करें (उदा, GFP-NTH1 या GFP-OGG1 के लिए आधार क्षति३२,४४,५६, GFP-कू के लिए उच्च खुराक DSBs५७, GFP-53BP1 ३२ अपेक्षाकृत सरल DSBs, या ब्याज की अंय प्रोटीन फ्लोरोसेंट टैग से जुड़े के लिए) liposome-मध्यस्थता डीएनए अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए । पतला ०.३ µ जी प्लाज्मिड डीएनए में सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया के 25 µ एल में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब ।
  3. एक और १.५ मिलीलीटर ट्यूब में पतला 1 µ एल liposome-आधारित डीएनए अभिकर्मक एजेंट सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया के 25 µ एल में और धीरे मिश्रण ।
  4. पतला डीएनए और अभिकर्मक एजेंट धीरे मिश्रण, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन (आरटी) डीएनए-लिपिड परिसरों के रूप में ।
  5. ०.५ मिलीलीटर संस्कृति मीडिया के साथ कुल्ला कोशिकाओं एक बार, मीडिया को हटा दें, और ०.५ मिलीलीटर ताजा संस्कृति मीडिया (के रूप में चरण १.१ में) कक्षों में जोड़ें ।
  6. डीएनए-लिपिड परिसरों कोशिकाओं को जोड़ें । प्लेट को कई बार हिलाते हुए धीरे से मिक्स कर लें । कोशिकाओं को वापस मशीन में डाल के रूप में २.१ कदम ।
  7. 4-6 h के बाद, कल्चर मीडिया को कक्षों से निकालें, और ३०० µ l ०.०५% Trypsin-EDTA जोड़ें । इसे निकालें, २०० µ l Trypsin-EDTA जोड़ें, और 3-4 मिनट के लिए ३७ ° c मशीन में मशीन ।
  8. पुष्टि करने के बाद कि कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, जोड़ें ८०० µ एल संस्कृति मीडिया और धीरे pipetting द्वारा कोशिकाओं को फिर से स्थगित करने के लिए सेल के झुरमुट को तोड़ने के लिए । एक gridded coverslip के साथ एक ३५ mm संस्कृति डिश के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण, और 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए संस्कृति मीडिया जोड़ें ।
  9. मशीन में ४८ घंटे के लिए २.१ चरण में के रूप में कोशिकाओं की मशीन, तो धारा 4 के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: यदि संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति विषाक्त है (transfected कोशिकाओं दिखाने के दौर या अनियमित आकृति विज्ञान के बाद २.८ कदम में गर्मी), अभिव्यक्ति समय कम है, और लेजर microirradiation (धारा 4) प्रदर्शन 16-20 ज पर जब तक अभिकर्मक के बाद प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि की जा सकती (प्रतिदीप्ति डिटेक्शन के लिए, चरण ४.३ देखें) । इस मामले में, ३५ mm डिश में सीधे अभिकर्मक प्रदर्शन करते हैं । बीज ३.० x 105 हेला कोशिकाओं में एक ३५ मिमी डिश के साथ एक gridded coverslip के बाद लगभग 50-70% संगम हासिल करने के लिए 30 ज. Transfect डीएनए plasmids, और अभिकर्मक के बाद मीडिया 2-6 एच बदल जाते हैं । लेजर microirradiation के साथ आगे बढ़ें 12-20 ज बाद में यदि प्रोटीन अभिव्यक्ति उचित है और कोशिकाओं को स्वस्थ दिखाई देते हैं ।

3. सेल चक्र तुल्यकालन

नोट: मुताबिक़ पुनर्संयोजन मरंमत (hr) प्रोटीन, जैसे Rad51 और cohesin के लिए, भर्ती सेल चक्र, जिसमें मानव संसाधन की मरंमत जगह लेता है के S/G2 चरण में अधिक प्रमुख है५१। इस प्रकार, इन प्रोटीन की भर्ती की निगरानी करने के लिए S/G2 चरण के लिए सेल तुल्यकालन आवश्यक है ।

  1. S/G2 चरण सिंक्रनाइज़ेशन
    1. S/G2 चरण५०,५१के लिए कक्ष सिंक्रनाइज़ेशन के लिए डबल thymidine ब्लॉक प्रोटोकॉल का उपयोग करें । एक ३५ mm gridded coverslip डिश में कोशिकाओं बोने के बाद (१.१ कदम देखें), संस्कृति मीडिया में thymidine (२.५ मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए) के साथ कोशिकाओं गर्मी 17 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर और 5% के साथ सह2।
    2. 1 मिलीलीटर thymidine के साथ कोशिकाओं कुल्ला-मुक्त संस्कृति मीडिया (के रूप में १.१ कदम में) दो बार, और 2 मिलीलीटर thymidine में कोशिकाओं गर्मी 9 एच के लिए नि: शुल्क संस्कृति मीडिया १.१ चरण में के रूप में ।
    3. २७.५ mm thymidine शेयर समाधान के २०० µ एल जोड़ें (संस्कृति मीडिया में भंग) २.५ mm thymidine की एक अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं के साथ संस्कृति मीडिया में । एक और 15 एच कुल्ला के लिए कदम 3.1.1 में के रूप में कोशिकाओं की मशीन और thymidine में कोशिकाओं गर्मी 4-6 एच के लिए मुक्त संस्कृति मीडिया और प्रेरित डीएनए क्षति (धारा 4) ।
    4. कक्ष चक्र मार्कर का उपयोग करके सिंक्रनाइज़ेशन दक्षता की पुष्टि करें (S/g2 और g2 के लिए Cyclin A2 और B1, क्रमशः), s/G2 चरण-विशिष्ट डीएनए क्षति की मरंमत कारकों (उदा, Rad51 या cohesin), या इदु/EdU (एस चरण कोशिकाओं के लिए)५१के द्वारा ।
  2. G1 चरण सिंक्रनाइज़ेशन
    1. बीज 6-8 x 104 हेला gridded coverslip (चरण २.१) के साथ एक ३५ mm संस्कृति डिश में कोशिकाओं ।
    2. 2 दिनों के बाद, metaphase कोशिकाओं की पहचान, जो थोड़ा उठा रहे हैं और गोल के आकार का, एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत 10x उद्देश्य और 10x नेत्र लेंस का उपयोग कर. gridded coverslip पर metaphase कोशिकाओं की स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए छवियां प्राप्त करें ।
    3. 3-4 एच के बाद, दो बेटी कोशिकाओं में सेल विभाजन की पुष्टि (G1 चरण में), और डीएनए क्षति (धारा 4) प्रेरित ।

4. लेजर इनपुट पावर का अनुमापन

नोट: इस प्रोटोकॉल में, हम डीएनए क्षति एक ७८० एनएम का उपयोग कर प्रेरित एफएस NIR लेजर एक फोकल माइक्रोस्कोप से जुड़ी प्रणाली, या एक ८०० एनएम स्पंदित एफएस NIR एक औंधा महामारी-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप को युग्मित लेजर । हालांकि इनपुट पावर (नमूना में लेजर फोकल प्वाइंट पर वास्तविक विकिरण) तुलनीय DDR प्रेरित करने की जरूरत इन प्रणालियों में अलग है, इनपुट पावर अनुमापन के बुनियादी सिद्धांत दोनों के लिए लागू है, या किसी भी, NIR सिस्टम३२,५७ . दो लेजर प्रणालियों के लिए फोकल प्वाइंट पर लेजर पल्स और पीक विकिरण प्रति सीटू में ऊर्जा ५.३३ × 10-2-4 की सीमा में थे× 10-1 एनजे और 7 × 1010-५.२४ × 1011 डब्ल्यू/

  1. NIR लेजर को चालू करें और उपयोग करने से पहले 1 h के लिए लेजर प्रणाली को वार्म-अप करने की अनुमति दें ।
  2. एक कक्ष में एक गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) चरण पर कोशिकाओं की एक डिश जगह है कि सह की अनुमति देता है2 (5%) और आर्द्रता (१००%) नियंत्रण ।
    नोट: यदि कोई सह2 कक्ष उपलब्ध नहीं है, तो 5-6 h तक के लिए सह2-स्वतंत्र संस्कृति मीडिया का उपयोग करें । एक हीटिंग चरण उपलब्ध नहीं है, तो < 20 मिनट के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं रखें और तुरंत उचित तापमान, CO2, और आर्द्रता नियंत्रण के साथ ऊतक संस्कृति मशीन में बदलें । इन संस्कृति की स्थिति विशिष्ट कोशिका प्रकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्युत्पत्ति के जीव के रूप में इस्तेमाल के आधार पर भिंन हो सकते है (उदा, स्तनधारी बनाम उभयचर) ।
  3. फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन के लाइव सेल विश्लेषण के लिए, एक GFP फ़िल्टर का चयन करें (450-490 एनएम उत्तेजना, 515-586 एनएम उत्सर्जन) या Cy3 फ़िल्टर (540-552 एनएम उत्तेजना, > ५९० एनएम उत्सर्जन) GFP या mCherry से जुड़े प्रोटीन के लिए, क्रमशः, एक 100X या 63X तेल विसर्जन का उपयोग उद्देश्य.
  4. कोशिकाओं है कि तुलनीय प्रतिदीप्ति संकेतों के लिए खोज, प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलनीय स्तर को दर्शाती है. प्रतिदीप्ति मापन में सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए बहुत कमज़ोर या बहुत सशक्त व्यंजक वाले कक्षों से बचें.
  5. लेजर इनपुट पावर को अनुमापन ।
    1. ७८० एनएम NIR लेजर एक फोकल माइक्रोस्कोप से जुड़ी
      1. एक लेज़र स्कैन करने के लिए जोखिम के लिए सेल नाभिक के अंदर रैखिक पटरियों को लक्षित करने के लिए सॉफ्टवेयर ब्लीच समारोह का प्रयोग करें (संकल्प ५१२ x ५१२ पिक्सल, ज़ूम X1, ब्लीच्ड क्षेत्र ५० x 4 पिक्सल, १२.८ µs पिक्सेल समय, चलना X1) तेल उद्देश्य के माध्यम से (100X/
      2. लेजर संचरण प्रतिशत समायोजित करें (सॉफ्टवेयर का उपयोग कर/हार्डवेयर के निर्माता द्वारा लेजर माइक्रोस्कोप प्रणाली में निर्मित) के लिए 5% किसी भी अंय सेटिंग्स को बदलने के बिना ।
      3. क्षेत्र के केंद्र में एक कक्ष रखें । ब्याज के क्षेत्र (रॉय) उपकरण पर क्लिक करें, और एक लाइन या बॉक्स (लगभग ५० x 4 पिक्सल) के नाभिक में माउस का उपयोग कर, और क्लिक करें "ब्लीच" बटन डीएनए क्षति को प्रेरित करने के लिए आकर्षित ।
        नोट: बाद में विकिरण चरणों में, "ब्लीचिंग" 5% वेतन वृद्धि में ४०% या १००% करने के लिए यदि आवश्यक हो तो वृद्धि की जानी चाहिए ।
      4. ८०० एनएम NIR लेजर महामारी से जुड़ी-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप
      5. एक (63X/1.4 NA) के माध्यम से इनपुट शक्ति को नियंत्रित एक ध्रुवीकरण फिल्टर बीम पथ में शुरू की मोटर चालित रोटेशन द्वारा चरण कंट्रास्ट तेल विसर्जन उद्देश्य और एक कंप्यूटर नियंत्रित मोटर चालित घूर्णन मंच पर मुहिम शुरू की३२,३९ , ५८.
      6. ध्रुवक कोण (°) को समायोजित करें और इनपुट पावर (मेगावाट) माइक्रोस्कोप में प्रवेश करने, एक लेजर बिजली मीटर का उपयोग कर । ध्रुवीकरण कोण है कि इनपुट शक्तियों कि 20 मेगावाट से लेकर 5-10 मेगावाट वेतन वृद्धि पर १५५ मेगावाट की सीमा निर्धारित करते हैं ।
      7. 20 मेगावाट इनपुट शक्ति के अनुरूप है कि ध्रुवीकरण कोण सेट करें ।
        नोट: हमारे लेजर प्रणाली के लिए, अगर ध्रुवीकरण कोण ४० डिग्री है, इनपुट शक्ति ६५ मेगावाट है । 5-10 मेगावाट की वृद्धि के साथ इनपुट पावर बढ़ाएं ।
  6. लाइव सेल विश्लेषण के लिए, चरण ६.१ और ६.३ पर जाएं । अंतर्जात प्रोटीन या संशोधनों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस पता लगाने के लिए धारा 5 के लिए आगे बढ़ना । विश्लेषण के बाद, लेजर शक्ति के आगे अनुमापन के लिए ४.७ कदम पर जाएं । ऊपर के कारक की आवश्यकता का विश्लेषण करने के लिए, अनुभाग 7 पर जाएं ।
    नोट: मांक और NHEJ कारकों की भर्ती तेजी से (कुछ ही मिनटों के भीतर) और क्षणिक (< ~ 30 min-1 h कारक पर निर्भर करता है और < ~ 4 h पोस्ट क्षति प्रेरण, क्रमशः) । इसके विपरीत, मानव संसाधन कारकों Rad51 और cohesin की भर्ती ~ 30 मिनट-1 एच में detectable है और वे unpaired डीएनए घावों४४,५०,५१पर 8 से अधिक एच बनाए रखने के लिए करते हैं । इस प्रकार, यह विभिंन मरंमत कारकों के लिए विभिंन समय अंक पोस्ट विकिरण की जांच करने के लिए आवश्यक है ।
  7. वांछित वेतन वृद्धि द्वारा इनपुट शक्ति में वृद्धि (यानी, 5% के लिए ७८० NIR लेज़र और 5-10 मेगावाट ८०० NIR के लिए) के रूप में चरण ४.४, और चरणों को दोहराएं 4.5-4.7 कक्षों का एक नया सेट पर थ्रेशोल्ड (५०% क्षतिग्रस्त कक्षों की भर्ती दिखाएं) और पीक (१००% कक्षों का पता लगाएं भर्ती) प्रत्येक प्रोटीन के लिए ।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलाना

नोट: आबंध प्रोटीन संशोधन का पता लगाने के लिए, जैसे सममूल्य (जटिल क्षति मार्कर) और H2AX फास्फारिलीकरण (γH2AX) (DSB मार्कर), साथ ही cyclobutane न्यूक्लियोटाइड डिमर (सीपीडी)/(6-4) photoproducts (6-4PP) और 8-oxoguanine (8-oxoG) (crosslinking और आधार क्षति मार्करों, क्रमशः), कोशिकाओं और तय किया जाना चाहिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग । इसके अलावा, यह एंटीबॉडी अंतर्जात प्रोटीन का पता लगाने के द्वारा फ्लोरोसेंट टैग संयोजक प्रोटीन के साथ प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए सबसे अच्छा है, संयोजक फ्यूजन प्रोटीन की अधिकता से प्रेरित कलाकृतियों भेद करने के लिए.

  1. नुकसान प्रेरण (चरण ४.५) के बाद अलग समय बिंदुओं पर कोशिकाओं को फिक्स संस्कृति मीडिया की जगह द्वारा कारकों पर निर्भर करता है (चरण १.१) के साथ 4% paraformaldehyde/1x पंजाबियों के १.५ मिलीलीटर पर 10 मिनट के लिए आरटी ।
    चेतावनी: Paraformaldehyde धुएं विषाक्त कर रहे है और सभी काम एक हवादार धुएं हुड में किया जाना चाहिए ।
  2. 4% paraformaldehyde/पंजाबियों निकालें और RT पर 10 मिनट के लिए ०.५% डिटर्जेंट/
  3. 5 मिनट दो बार के लिए पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ ०.५% डिटर्जेंट/पंजाबियों और कुल्ला कोशिकाओं को हटा दें, और समाधान अवरुद्ध की 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं की मशीन (10% बछड़ा सीरम, 1% BSA/
  4. समाधान अवरुद्ध निकालें और सेल के लिए पंजाब के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और २५० µ एल के प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ पंजाब की जगह 4 ° c या 1 ज पर रात भर BSA/एक 1:200-1:500 कमजोर पड़ने का उपयोग करें (विशिष्ट एकाग्रता लगभग 1 µ g/एमएल, empirically निर्धारित) एंटीबॉडी के लिए अलग डीएनए क्षति मार्करों के लिए विशिष्ट (उदा, γH2AX/53BP1 (DSB); कू (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); सीपीडी/6-4PP (crosslinking क्षति); 8-oxoG/DNA glycosylases (जैसे, NTH1) (आधार क्षति); सममूल्य (उच्च खुराक जटिल क्षति)) ।
  5. एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए दो बार पंजाब की मिलीलीटर के साथ कुल्ला, पंजाबियों को हटा दें, और २५० µ एल ०.१% माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन 3% BSA/
  6. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए दो बार पंजाबियों के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 1.5-2 एमएल पंजाबियों में 4 ° c पर चरण ६.१ और ६.२ में इमेजिंग के लिए कोशिकाओं रखें ।

6. Immunostained या जीवित कोशिकाओं की मात्रात्मक प्रतिदीप्ति विश्लेषण

  1. दाग या जीवित कोशिकाओं की छवियों पर कब्जा (एन > 10) विकिरण के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप का उपयोग कर. महामारी-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए, १,३४४ x १,०२४ पिक्सेल के संकल्प का उपयोग करें और TIFF 16-bit फ़ाइलों के रूप में छवियां सहेजें । एक फोकल माइक्रोस्कोप के लिए, 1x आवर्धन का उपयोग करें; GFP/FITC, HeNe ५९४ लेजर के लिए आर्गन Cy3/mCherry के लिए लेजर; छवि समाधान के लिए ५१२ x ५१२ या १,०२४ x १,०२४ पिक्सेल; स्कैन स्पीड 5, संख्या: त्वरित स्कैन या 2 के लिए 1 + कई स्कैन पर औसत के लिए शोर अनुपात के लिए संकेत में सुधार करने के लिए.
  2. पिक्सेल तीव्रता मापने के लिए डिज़ाइन किए गए एक छवि विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग करें ।
    1. व्यक्तिगत सेल छवि में नुकसान साइट के आसपास एक रॉय आकर्षित करने के लिए वॉल्यूम आयत उपकरण का उपयोग करें । एक ही आकार रॉय का प्रयोग करने के लिए आसंन nucleoplasm में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत मापने के लिए, लेकिन नुकसान साइटों के साथ अतिव्यापी नहीं । यह गैर-फोकल माइक्रोस्कोप प्रणाली के साथ जुड़े photobleaching के सामान्यीकरण के लिए महत्वपूर्ण है ।
    2. छवि विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग करके प्रतिदीप्ति संकेतों को मापने के लिए, टूल बॉक्स में "वॉल्यूम विश्लेषण रिपोर्ट" पर क्लिक करें. एक नई विंडो दिखाई देगी । "डेटा को प्रदर्शित करने के लिए" अनुभाग के अंतर्गत, केवल "नाम" और "घनत्व" बक्सों की जांच करें । तो माप की कल्पना करने के लिए "किया" क्लिक करें ।
    3. वॉल्यूम रिपोर्ट विंडो के निचले भाग पर पाए गए तालिका चिह्न पर क्लिक करके और निर्यात गंतव्य के लिए "फ़ाइल" फ़ील्ड विभाजकों के लिए "टैब्स (excel स्वरूप)" का चयन करके किसी स्प्रेडशीट प्रोग्राम में मानों को निर्यात करें.
    4. संबंधित संकेतों को प्राप्त करने के लिए, प्रतिदीप्ति तीव्रता क्षति साइट (स्तंभ 1) में nucleoplasm में नियंत्रण पृष्ठभूमि क्षेत्र (स्तंभ 2) में विभाजित करने के लिए स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करें और सामान्यीकरण के लिए 1 से घटाएँ ।
  3. फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके वास्तविक समय मात्रात्मक प्रतिदीप्ति समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण
    1. फ्लोरोसेंट टैग की पहचान प्रोटीन-सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में ४.३ कदम में माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ।
    2. क्षति से पहले समय-चूक प्रतिदीप्ति इमेजिंग निष्पादित करें और खंड 4 में क्षति प्रेरण के बाद अलग समय बिंदुओं पर । पहले ब्लीच रॉय आकर्षित (क्षति प्रेरण के लिए), तो "प्राप्त > समय श्रृंखला" सबमेनू, सेट का चयन करें "संख्या" 20 के रूप में, और "चक्र देरी" के रूप में 30 एस, चुनें "ब्लीच एक बार पहले स्कैन के बाद", और फिर क्लिक "शुरू बी" । इस मामले में, पहली छवि को नुकसान प्रेरण, एक 30 एस अंतराल पर 19 छवि अधिग्रहण से पहले के बाद तुरंत अधिग्रहण कर लिया है । अंतराल ("चक्र देरी") अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर बदला जा सकता है ।
    3. एक बार छवि अधिग्रहण पूरा हो गया है, क्लिक करें "मतलब", और नुकसान क्षेत्र पर रॉय आकर्षित । चयनित ROIs के भीतर तीव्रता सूचीबद्ध करने के लिए तालिका प्राप्त करने के लिए "तालिका दिखाएं" क्लिक करें । नुकसान से पहले एक ही क्षेत्र की तीव्रता के द्वारा अलग समय बिंदुओं पर क्षति साइट की प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजित करके डेटा को सामान्य, और 1 से घटाना.

7. छोटा सा हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) अभिकर्मक

नोट: लक्ष्य प्रोटीन की कमी मनाया प्रोटीन भर्ती के लिए ऊपर कारक आवश्यकता चित्रित के लिए एक प्रभावी तरीका है नुकसान साइटों (धारा 4) । इसके अलावा, रणनीति इम्यूनोफ्लोरेसेंस पता लगाने के लिए इस्तेमाल एक एंटीबॉडी की विशिष्टता का पता करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है (खंड 5 देखें) ।

  1. Day 1: हेला कोशिकाओं के 2 कुओं को एक 24 वेल प्लेट में सीडिंग करके 6-8 x 104 हेला सेल में ०.५ एमएल कल्चरल मीडिया में प्रत्येक वेल में, कंट्रोल सिरना अभिकर्मक के लिए एक और PARP1 सिरना (5 '-CCG आगा AAT सीटीसी TTA CCT CAA-3 ') के लिए एक तैयार करें ।
  2. 2 दिन: पुष्टि करें कि कोशिकाओं लगभग 40-50% धाराप्रवाह हैं । सिरना अभिकर्मक के पहले दौर में प्रदर्शन: पतला 5 pmol सिरना सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया के 25 µ एल में, जोड़ें 3 µ l लिपिड ट्यूब में अभिकर्मक रिएजेंट आधारित, धीरे मिश्रण, और आरटी पर 5-10 मिनट के लिए मशीन ।
  3. कुल्ला ०.५ मिलीलीटर ताजा संस्कृति मीडिया के साथ कोशिकाओं को एक बार, और ०.५ मिलीलीटर ताजा संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं को रखने के (चरण १.१ देखें) ।
  4. कोशिकाओं को आरएनए-लिपिड परिसरों जोड़ें, और पकवान आगे और पीछे झुकाव से धीरे से मिश्रण । कोशिकाओं को वापस मशीन में डाल के रूप में २.१ कदम ।
  5. महाप्राण अभिकर्मक मिश्रण, और जोड़ने के ०.५ मिलीलीटर ताजा संस्कृति मीडिया (चरण १.१) के बाद 6 ज ।
  6. 3 दिवस: सिरना transfections के दूसरे दौर प्रदर्शन (७.२ कदम देखें) । फिर, बीज 60-100% कोशिकाओं में एक ३५ mm gridded coverslip डिश के रूप में चरण २.३ में वर्णित है ।
  7. 5 दिवस: ब्याज के कारक के अधिकतम भर्ती के लिए इष्टतम लेजर बिजली की स्थिति का उपयोग लेजर microirradiation के साथ आगे बढ़ना, के रूप में धारा 4 द्वारा निर्धारित । आमतौर पर, कुशल कमी हेला कोशिकाओं के लगभग 60-90% में मनाया जा सकता है ।
    नोट: एक वैकल्पिक और पूरक दृष्टिकोण के रूप में, अवरोधकों, अगर उपलब्ध है, के लिए ब्याज के कारक के समारोह को बाधित किया जा सकता है३२,४४। DDR सिग्नलिंग बाधा के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, 20 µ एम प्प अवरोधक, 1 µ m PAR glycohydrolase (PARG) अवरोध करनेवाला, या 10 µ एम डीएनए-निर्भर प्रोटीन उत्प्रेरक उपइकाई (डीएनए कळेनासे) अवरोध करनेवाला और 10 PKcs एम एटीएम अवरोधक के साथ µ dimethyl (sulfoxide) में जोड़ें व्यंजन 1 एच से पहले नुकसान प्रेरण । केवल कक्षों को नियंत्रित करने के लिए DMSO जोड़ें ।

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Representative Results

छुरा EGFP-53BP11220-1711 या TRF2-YFP, लेजर इनपुट पावर अनुमापन व्यक्त PtK2 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए उनकी भर्ती (चित्रा 1)३२के लिए इष्टतम स्थिति निर्धारित किया गया था ।

उच्च इनपुट-पावर लेजर क्षति साइटों पर, सीपीडी के महत्वपूर्ण clustering (crosslinking क्षति आम तौर पर पराबैंगनी (यूवी) क्षति द्वारा उत्पंन) के रूप में अच्छी तरह के रूप में GFP-NTH1 डीएनए glycosylase है कि विशेष रूप से आधार क्षति पहचानता था मनाया गया । इसके अलावा, उच्च XRCC1 और CtIP संकेत देखा गया, कतरा टूट की वृद्धि हुई संख्या को प्रतिबिंबित, और प्रदर्शन है कि जटिल डीएनए क्षति इस हालत (चित्र 2a) के तहत प्रेरित है. अंय डीएनए फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े glycosylases (जैसे, GFP-नेि endonuclease VIII-2 की तरह (NEIL2) और GFP-8-Oxoguanine glycosylase (OGG1)) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से condensin मैं भी आधार क्षति मार्करों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है४४,५९। इस के साथ संगत, हमने पाया है कि बराबर प्रतिक्रिया काफी उच्च इनपुट-पावर लेजर (यानी, ऊर्जा और विकिरण में फोकल स्पॉट में नमूना), लेकिन केवल कमजोर द्वारा फोकल स्पॉट में कम लेजर शक्ति द्वारा प्रेरित (चित्रा बी., ऊपर छोड़ दिया है) । सममूल्य संकेतों, लेकिन नहीं PARP1 प्रोटीन स्थानीयकरण, क्षति साइटों पर प्प अवरोधक के प्रति संवेदनशील थे (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इसके अतिरिक्त, सिरना PARP1 के लिए विशिष्ट दोनों बराबर और नुकसान साइटों पर PARP1 (चित्र बी, ऊपर सही)३२कम । उच्च इनपुट बिजली की स्थिति के तहत, γH2AX शुरू में नुकसान साइटों पर प्रकट होता है, और तेजी से एक एटीएम/डीएनए-PK-निर्भर तरीके से पूरे नाभिक को फैलता है (चित्रा बीसी, नीचे) । इसी तरह के एटीएम/डीएनए-PK-γH2AX के आश्रित प्रसार γ-विकिरण६०के लिए सूचित किया गया था । लगातार परिणाम दोनों ८०० और ७८० एनएम NIR लेजर सिस्टम३२के साथ प्राप्त किया गया । एक साथ ले लिया, परिणाम पता चलता है कि यह अनुमापन लेजर इनपुट शक्ति (और इसलिए, ऊर्जा और विकिरण के फोकल स्थान में सेल में) के लिए शर्तों है कि DSBs की संख्या के साथ प्प प्रतिक्रिया correlating के विभिंन डिग्री प्रेरित खोजने के लिए संभव है और डीएनए क्षति की जटिलता ।

इसके बाद के संस्करण परिणाम शुरू में सुझाव दिया कि जटिल डीएनए क्षति की उपस्थिति 53BP1 और TRF2 की अंतर भर्ती का कारण हो सकता है । दिलचस्प है, तथापि, 53BP11220-1711 एक कम शक्ति क्षति साइट के लिए भर्ती प्रभावी ढंग से दूसरी क्षति एक ही सेल नाभिक में उच्च इनपुट-शक्ति द्वारा प्रेरित साइट की उपस्थिति से बाधित किया गया था (चित्रा 3 ए के विपरीत में चित्र बी ). परिणाम संकेत मिलता है कि उच्च इनपुट-पावर लेजर क्षति ट्रांस में53BP1 भर्ती को रोकता है । प्प अवरोधक द्वारा सममूल्य के निषेध के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परमाणु-चौड़ा γH2AX एटीएम/डीएनए-पीके अवरोधकों द्वारा फैलाने के निषेध इस भर्ती को भी उच्च इनपुट बिजली क्षति साइट (चित्र 3/ यह डीएनए क्षति चेकपॉइंट 1 (MDC1) के मध्यस्थ की भर्ती से अलग है, जो मुख्य रूप से γH2AX फैलाव द्वारा बाधित किया गया था, और इसलिए, एटीएम/डीएनए-PK अवरोधकों द्वारा बहाल किया गया था, नहीं प्प अवरोध करनेवाला (चित्र 3ए, नीचे) । महत्वपूर्ण बात, PARG निषेध द्वारा सममूल्य के hyperactivation (γH2AX स्थिति को प्रभावित किए बिना) प्रभावी रूप से भी कम इनपुट-पावर क्षति साइटों है कि आम तौर पर 53BP1 कुशलता से भर्ती में प्रारंभिक 53BP1 भर्ती दबा (चित्र बी)३२। एक साथ ले लिया, इन परिणामों संकेत मिलता है कि बराबर संकेत है, और नहीं नुकसान का प्रकार प्रति, 53BP1३२की भर्ती के साथ हस्तक्षेप । यह लेजर microirradiation की बहुमुखी प्रतिभा का एक उदाहरण है, जो हमें कैसे कई नुकसान साइटों के प्रभाव की जांच करने के लिए और एक दूसरे के साथ बातचीत की अनुमति देता है ।

Figure 1
चित्र 1 : लेजर इनपुट शक्ति का अनुमापन । भविष्य के प्रयोगों के लिए उपयोग करने के लिए लेजर शक्ति का निर्धारण करने के लिए, PtK2 कोशिकाओं छुरा व्यक्त EGFP-53BP1 और TRF2-YFP 20 मेगावाट और १५५ मेगावाट के बीच ८०० एनएम microirradiation लेजर का उपयोग करके इनपुट शक्तियों के साथ लेजर NIR के अधीन थे/उल्टे महामारी-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रणाली । EGFP-53BP1 भर्ती 15 मिन पद विकिरण (p.i.) के लिए निगरानी की गई थी, जबकि TRF2-YFP कोशिकाओं 6 मिनट के लिए पीछा किया गया था p.i. सलाखों के ऊपर सीधे संख्या कोशिकाओं है कि परीक्षण कोशिकाओं की कुल संख्या से अधिक क्षति साइटों के लिए EGFP-53BP1 या TRF2-YFP की सकारात्मक भर्ती दिखाया की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा Saquilabon Cruz३२से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : जटिल नुकसान और मजबूत DDR उच्च इनपुट-पावर लेजर द्वारा संकेतन की प्रेरण । (A) उच्च-इनपुट-पावर लेजर microirradiation कतरा टूटता (दोनों एसएसबी और DSBs), crosslinking, और आधार क्षति सहित जटिल क्षति लाती है । सीपीडी, XRCC1 (एसएसबी और DSB मरंमत), NTH1 डीएनए glycosylase (मांक), और CtIP (वैकल्पिक NHEJ और मानव संसाधन) दिखाए जाते है (केवल GFP-NTH1 एक जीवित कोशिका छवि है और बाकी इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के बाद मनाया जाता है) । मात्रात्मक प्रतिदीप्ति क्षति साइट भर्ती की तीव्रता माप प्रोटोकॉल खंड 7 में कहा गया है और boxplots में दिखाया गया है के रूप में किया गया । कोशिकाओं की कुल संख्या (n) का परीक्षण प्रत्येक मात्रा प्रोटीन के तहत देखा जा सकता है । *p-मान < 0.05 । (B) शीर्ष (बाएं): उच्च इनपुट-पावर क्षति साइटों पर मजबूत सममूल्य और PARP1 संकेत । शीर्ष (दाएं): PARP1 सिरना घट बराबर संकेत३२,४४को समाप्त करने के लिए पर्याप्त है । नीचे: कम (ऊपर) और उच्च (नीचे) इनपुट बिजली के नुकसान के साथ कोशिकाओं में γH2AX का समय पाठ्यक्रम विश्लेषण के रूप में संकेत दिया । स्केल पट्टियां = 10 µm । यह आंकड़ा Saquilabon Cruz३२से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : DDR सिगनल के अवकलन सक्रियण को प्रभावित करता है 53BP1 भर्ती के लिए साइटों को नुकसान । (A) Top: PtK2 कोशिकाओं छुरा EGFP-53BP1 व्यक्त1220-1711 दोनों कम (15%) और उच्च (25%) इनपुट पावर (सफेद और पीले ऐरोहेड, क्रमशः) एक ही नाभिक में ७८० एनएम NIR का उपयोग कर के साथ microirradiated/ यह संकेत के रूप में DMSO, प्प अवरोध करनेवाला (pi), या एटीएम, डीएनए-पीके, और प्प अवरोधकों (ऐ + Di + Pi) के संयोजन की उपस्थिति में किया गया था । लाइव-सेल इमेजिंग के EGFP-53BP11220-1711 DSB प्रेरण के बाद 30 मिनट पर कब्जा कर लिया गया था । कोशिकाओं को तो तय कर रहे थे और एक DSB मार्कर के रूप में γH2AX के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग । क्षति साइटों पर EGFP-53BP11220-1711 के प्रतिदीप्ति तीव्रता के परिवर्तन के साथ सही पर दिखाए जाते हैं p-मान (माध्य मान हैं: DMSO, ०.०३ ± ०.०२; Pi, ०.३४ ± ०.१९; ऐ + डि + Pi, ०.९८ ± ०.२३) । नीचे: संकेत के रूप में उच्च इनपुट-पावर क्षति के साथ MDC1 स्थानीयकरण पर Pi और ऐ + Di उपचार के प्रभाव । स्केल बार 10 µm है । सही: pमानों के साथ DMSO, Pi, या Ai + Di की उपस्थिति में उच्च इनपुट-पावर क्षति साइटों पर MDC1 के प्रतिदीप्ति संकेतों के परिवर्तन (माध्य मान हैं: DMSO, ०.०७ ± ०.१०; Pi, ०.०५ ± ०.०७; ऐ + डि, ०.८६ ± ०.२६) । स्केल बार = 10 µm. N = 10 प्रत्येक तीव्रता माप के लिए । (ख) कम इनपुट-पावर क्षति साइटों को अंतर्जात 53BP1 भर्ती पर पारगी उपचार द्वारा सममूल्य संकेतों की वृद्धि का प्रभाव । सही: Boxplots अंतर्जात 53BP1 भर्ती के मात्रात्मक विश्लेषण का प्रतिनिधित्व (इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा पता चला) कम इनपुट के साथ-पावर लेजर (८०० एनएम NIR लेजर/उल्टे महामारी-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रणाली में ६० मेगावाट) 15 मिनट के बाद विकिरण DMSO या पारगी की उपस्थिति में संकेत के रूप में । बाएं: सममूल्य और 53BP1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस DMSO या पारगी उपचार के साथ ही शर्तों के तहत क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के दाग चित्रों । DMSO उपचार के लिए, १००% कोशिकाओं की जांच की (N = 25) मजबूत 53BP1 भर्ती प्रदर्शित (सही) । इसके विपरीत, 20/25 पारगी (नीचे सही) की उपस्थिति में कोई 53BP1 भर्ती दिखाया, और 5 कोशिकाओं को कमजोर भर्ती दिखाया । स्केल बार = 10 µm । यह आंकड़ा Saquilabon Cruz३२से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

DDR अनुसंधान के लिए लेजर microirradiation का उपयोग करने के फायदे हैं:

1. यह जटिल डीएनए क्षति के लिए सरल किनारा टूटता से विभिन्न प्रकार और डीएनए क्षति की मात्रा पैदा करने के लिए संभव है, और लेजर विकिरण मापदंडों का समायोजन करके डीएनए क्षति साइटों पर अलग मरम्मत कारकों का पता लगाने के लिए । यह भी एक ही कोशिका नाभिक में कई बार नुकसान दण्ड संभव है क्रम में ट्रांस प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए ( चित्रा 3के रूप में) ।

2. महत्वपूर्ण बात, नुकसान साइटों पर हो रहा घटनाओं और माध्यमिक घटनाओं है कि नाभिक में कहीं भी हो आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।

3. यह एक एकल कोशिका स्तर पर नुकसान के जवाब में फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन गतिशीलता के उच्च संकल्प वास्तविक समय माप बाहर ले जाने के लिए संभव है, सहित, लेकिन करने के लिए सीमित नहीं: Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट), प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग ( FLIM), जोड़ी सहसंबंध समारोह (पीसीएफ), आदि, लाइव कोशिकाओं में DDR पर कब्जा करने के लिए ।

4. आरएनए हस्तक्षेप या अवरोधक उपचार के साथ संयोजन, यह अपेक्षाकृत कोशिकाओं की एक छोटी संख्या में नदी के ऊपर कारक की आवश्यकता का परीक्षण करने के लिए सरल है ।

5. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि NIR (या हरा) लेजर विकिरण न्यूक्लियोटाइड अनुरूप या डीएनए intercalating रंजक के साथ डीएनए के पूर्व संवेदीकरण की आवश्यकता नहीं है, इस प्रकार क्रोमेटिन पैकिंग पर अवांछित दुष्प्रभावों से बचने. इस यूवी लेजर प्रणाली है कि कम मात्रा में संवेदीकरण की आवश्यकता है और उच्च खुराक३९,४९,६१पर ंयायपालिका DDR कारणों के विपरीत है ।

प्रोटोकॉल/संशोधनों और समस्या निवारण के भीतर महत्वपूर्ण कदम
यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को स्वस्थ परिस्थितियों में कर रहे है जब DDR विश्लेषण के लिए विरूपण साक्ष्य और प्रयोगात्मक विविधताओं को कम करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । डीएनए-या सिरना-transfected कोशिकाओं को आमतौर पर अधिक संवेदनशील है या आसानी से अलग जब gridded coverslip पर बढ़ रही है । यह अभिकर्मक रिएजेंट में कम समय के लिए कोशिकाओं को अभिकर्मक के रूप में लंबे समय के रूप में रखने में मदद करता है, और बीज coverslip कोशिकाओं की तुलना में gridded untransfected पकवान पर अधिक transfected कोशिकाओं । इस क्रम में आवश्यक है के लिए तुलनीय सेल को प्राप्त करने के प्रयोगों के लिए प्रभावित ।

यह सूचित किया गया है कि thymidine ब्लॉक सिंक्रनाइज़ किए गए कक्ष६२में γH2AX के स्तर में वृद्धि की ओर जाता है, जो DDR को प्रभावित कर सकता है और परिणाम तिरछा कर सकते हैं । इसके अलावा, बेस लाइन γH2AX संकेत भी किसी भी exogenous नुकसान६३,६४के बिना एस और G2/ हम, तथापि, nucleoplasm में किसी भी महत्वपूर्ण γH2AX संकेत है कि प्रभावित या एक डबल thymidine ब्लॉक५१द्वारा S/G2 चरण में सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं में लेजर प्रेरित क्षति साइटों पर विशिष्ट γH2AX प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप करेंगे निरीक्षण नहीं करते ।

आदेश में लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह समय-लेजर प्रणाली उत्पादन मापदंडों (हर 2 से 4 सप्ताह) और ऑप्टिकल संरेखण (हर 2 महीने) की जांच करने के लिए आवश्यक है । समय के साथ, लेजर सिस्टम घटकों को फिर से संरेखित करने की आवश्यकता हो सकती है, उद्देश्य लेंस क्षतिग्रस्त हो सकता है और इसे प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता हो सकती है, और कुल इनपुट पावर की स्थिरता बदल सकती है । कुंजी क्षति की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए है (crosslinking (सीपीडी और/6-4PP) और आधार क्षति (8-oxoG)), मार्कर प्रोटीन (जैसे, डीएनए glycosylases, Rad51, cohesin, और कू), और सममूल्य संशोधन इस प्रोटोकॉल में वर्णित करने के लिए खुराक का निर्धारण और डीएनए की जटिलता लेजर माइक्रोस्कोप इस्तेमाल प्रणाली द्वारा प्रेरित नुकसान ।

तकनीक की सीमाएं
लेजर microirradiation की सीमाएं हैं । डीएनए लेजर बीम द्वारा प्रेरित नुकसान उच्च नाभिक में एक क्षेत्र में स्वाभाविक रूप से होने वाली क्षति है कि नाभिक भर में फैल सकता है की तुलना में संकुलित है । यह कैसे क्षतिग्रस्त संकेत पड़ोसी क्रोमेटिन में या नाभिक में प्रचारित किया जाता है बदल सकते हैं । चूंकि कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत कम संख्या में एक समय पर विकिरणित जा सकता है, जनसंख्या आधारित जैव रासायनिक परख (जैसे, पश्चिमी दाग, प्रोटीन जटिल शुद्धि, क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप)) आसानी से नहीं किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट पर निर्भरता टैग प्रोटीन (exogenous संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ या यहां तक कि उन व्यक्त endogenously CRISPR का उपयोग कर के साथ-मध्यस्थता टैग प्रविष्टि) गतिशील इमेजिंग के लिए अध्ययन करने के लिए कमजोर बनाता है प्रोटीन फ्यूजन प्रेरित कलाकृतियों. लेजर प्रेरित नुकसान और टैग प्रोटीन के संभावित artifactual प्रभाव की अनूठी प्रकृति, इसलिए, पारंपरिक डीएनए हानिकारक तरीकों (आईआर, रासायनिक हानिकारक एजेंटों) और अंतर्जात के साथ का उपयोग कर परिणामों के साथ तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए टैग न किए गए प्रोटीन (हालांकि कभी-कभार समानांतर प्रयोगों को पूरा करना संभव नहीं है).

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व
अनुक्रम-विशिष्ट endonucleases जैसे i-SceI, फोकी, असीसि, और i-PpoI का उपयोग साइट-विशिष्ट DSBs (कड़ाई से सरल DSBs) को प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक कार्यनीति प्रदान करता है. कारक भर्ती या संशोधन साइट द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है-विशिष्ट या जीनोम चौड़ा चिप विश्लेषण६५,६६,६७,६८,६९। DSBs के अपेक्षाकृत तुल्यकालिक प्रेरण एक स्टेरॉयड हार्मोन रिसेप्टर और तेजी से परमाणु translocation और गिरावट के लिए एक गिरावट संकेत (degron) के साथ endonuclease टैगिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, क्रमशः६५,६६ , ६७ , ६८ , ६९. एक को ध्यान में रखना चाहिए, तथापि, कि endonuclease अभिव्यक्ति और लक्ष्य साइट पहुंच की दक्षता, और चल रहे मरंमत की स्थिति अलग कोशिकाओं में चर और विभिंन लक्ष्य साइटों पर किया जा सकता है । ये heterogeneities जनसंख्या आधारित चिप विश्लेषण में औसत होंगे, जिससे नतीजे टेढ़े हो सकते हैं. लेजर microirradiation, दूसरे हाथ पर, उच्चतम संभव लौकिक संकल्प (मिसे) के रूप में अच्छी तरह से क्षति प्रतिक्रिया गतिशीलता के स्थानिक संकल्प (submicrometer), जो एकल सेल स्तर पर विश्लेषण किया जा सकता प्रदान करता है । उच्च क्षति घनत्व, तथापि, परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । दोनों रणनीतियों एंटीबॉडी पहुंच और/या पेप्टाइड टैगिंग की वजह से कलाकृतियों के प्रति संवेदनशील हो सकता है । इसलिए, दोनों रणनीतियों, जो संभवतः एक दूसरे के पूरक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के पेशेवरों और विपक्ष को समझने के लिए महत्वपूर्ण है ।

भविष्य अनुप्रयोगों
प्रतिदीप्ति इमेजिंग और गतिशीलता तकनीक की तेजी से उन्नति के साथ, लेजर प्रणालियों के बहुमुखी प्रतिभा के लिए अलग मात्रा और विशिष्ट स्थानों पर डीएनए क्षति के प्रकार और सेल चक्र चरण प्रेरित करने के लिए एक मूल्यवान सेलुलर पूछताछ करने का अवसर प्रदान करता है और एक एकल कोशिका स्तर पर उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ डीएनए क्षति के लिए आणविक प्रतिक्रियाओं । यह संभव हो जाएगा, उदाहरण के लिए, बाहर नुकसान साइट चिढ़ाने के लिए-विशिष्ट और नाभिक-और मिलीसेकंड-संकल्प के साथ सेल-वाइड DDR संकेत transduction (उदा., आणविक बातचीत या संशोधनों कि नुकसान साइटों पर विशेष रूप से पाए जाते हैं, की जांच का पता लगाने वास्तविक समय में क्रोमेटिन संरचना के गतिशील परिवर्तन, या क्षति साइटों से पूरे नाभिक को संकेतन क्षति के प्रसार के वास्तविक समय का पालन करें । यह भी समय की एक लंबी अवधि में एक ही सेल का पालन करने के लिए सेल भाग्य पर डीएनए क्षति के प्रभाव की जांच संभव है । हम कल्पना है कि लेजर microirradiation तरीकों, अगर ठीक से इस्तेमाल किया, डीएनए की मरंमत क्षेत्र की उंनति के लिए महत्वपूर्ण योगदान जारी रहेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Tohoku विश्वविद्यालय, GFP-NTH1 अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के लिए जापान में डॉ अकीरा Yasui, और डॉ इरोज Lazzerini Denchi स्क्रिप्स अनुसंधान संस्थान, La Jolla, कैलिफोर्निया में TRF2-YFP और EGFP-53BP11220-1711 अभिव्यक्ति plasmids के लिए धंयवाद । यह काम वायु सेना कार्यालय के वैज्ञानिक अनुसंधान (FA9550-04-1-०१०१) और Beckman लेजर संस्थान इंक द्वारा समर्थित किया गया था । फाउंडेशन (एम. डब्ल्यू. बी.), नेशनल एकेडमी ऑफ साइंसेज (बी. ए. एस.) से फोर्ड फाउंडेशन फैलोशिप, और NSF म्क्ब-१६१५७०१ और CRCC सीआरआर-17-426665 (to K. Y.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

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आनुवंशिकी मुद्दा १३१ लेजर microirradiation चिकित्सा में पराबैंगनीकिरण डीएनए क्षति डीएनए क्षति प्रतिक्रिया डीएनए की मरंमत पाली (ADP-ribose) पोलीमरेज़ (प्प) जटिल क्षति किनारा टूट जाता है आधार क्षति
लेजर Microirradiation <em>Vivo में</em> अध्ययन करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं सरल और जटिल डीएनए क्षति
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