Summary
L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere come utilizzare laser microirradiation per indurre diversi tipi di danno del DNA, compreso le rotture del filo relativamente semplici e danno complesso, per studiare assieme di fattore DNA danni segnalazione e riparazione presso siti di danno in vivo .
Abstract
Danno al DNA induce risposte specifiche di segnalazione e riparazione nella cella, che è fondamentale per la protezione dell'integrità del genoma. Laser microirradiation è diventato un prezioso strumento sperimentale per studiare il DNA danni risposta (DDR) in vivo. Permette analisi unicellulare ad alta risoluzione in tempo reale delle dinamiche macromolecolari in risposta al danno indotto da laser relegato a una regione submicrometrici nel nucleo della cellula. Tuttavia, varie condizioni di laser sono state utilizzate senza apprezzamento delle differenze nei tipi di danno indotto. Di conseguenza, la natura del danno spesso non è ben caratterizzato o controllata, causando evidenti incoerenze nei profili di reclutamento o modifica. Abbiamo dimostrato che condizioni di irradiazione diversi (cioè, diverse lunghezze d'onda come pure diverse potenze di ingresso (irradiances) di un laser a femtosecondi (fs) vicino infrarosso (NIR)) ha indotto gli assembly distinti di proteina DDR e riparazione. Ciò riflette il tipo di danno del DNA prodotto. Questo protocollo descrive come titolazione input di potere del laser permette di induzione di diverse quantità e complessità del danno al DNA, che può essere facilmente monitorato tramite rilevazione di danni base e reticolazione, differenziale poly (ADP-ribosio) (PAR) di segnalazione, e riparazione di percorso specifico assembly fattore presso siti di danno. Una volta che le condizioni di danno sono determinate, è possibile studiare gli effetti di danno differenti complessità e segnalazione differenziali danni nonché deplezione di fattori a Monte su qualsiasi fattore di interesse.
Introduction
In Vivo Segnalazione di danni del DNA non è ben compreso
In vivo, il DNA è complessato con istoni ed altri fattori a fibre di cromatina forma. Regolamento della struttura della cromatina è di fondamentale importanza per il metabolismo del DNA. Ad esempio, la variante dell'istone H2AX viene fosforilata da atassia-teleangectasia mutato (ATM) e altre chinasi seguente doppio-filo si rompe ad induzione (DSB) ed è importante per amplificazione del segnale DSB danni, nonché a fornire un sito di aggancio per altro fattori. Diffusione della scelta di pathway di segnalazione e riparazione danni sembrano essere criticamente influenzati dalla struttura della cromatina locale a danni siti1. Una serie di fattori, istone chaperoni e modificando gli enzimi istone di rimodellamento della cromatina sono infatti reclutato per danneggiare siti e sono importante per la riparazione del DNA efficiente, evidenziando l'importanza della regolazione della cromatina nella DDR e riparazione2 , 3 , 4. Inoltre, sito danno clustering o il riposizionamento è stato osservato in lievito e drosofila5,6,7,8, ricordano la rilocalizzazione di loci genici nella subnucleare vano associato gene regolamento9,10. Recenti studi nel topo e cellule umane anche rivelato mobilitazione dei siti DSB, quali influenze ripristino fedeltà e via scelta11,12. Ciò solleva la possibilità che DDR/riparazione può anche essere intimamente legato al architettura nucleare, l'organizzazione di ordine superiore della cromatina e cromosoma dynamics nel nucleo della cellula. Quindi, è fondamentale per sviluppare metodi ad alta risoluzione per studiare DDR e processi nel contesto dell'ambiente endogeno nucleare in una cellula viva di riparazione al fine di comprendere le conseguenze a breve e a lungo termine di danno del DNA.
Ruolo critico di PAR polimerasi (PARP) nel valutare l'entità e il tipo di danno e regolamentare proteina Assemblea presso il sito di danni
PARP1 è un sensore di nick DNA rapidamente attivato da danno del DNA che svolge un ruolo critico nel DNA riparazione13. PARP1 è stato originariamente pensato per funzionare insieme con raggi x riparare Cross completando 1 (XRCC1) per facilitare la riparazione bassa di asportazione (BER), ma gli studi recenti rivelano il suo ruolo in altre vie di riparazione del DNA, compreso DSB riparazione14. Attivato PARP1 usi nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+) da un substrato ad ADP-ribosylate più proteine bersaglio, compreso se stesso. Questo enzima e altri membri della famiglia hanno attirato molta attenzione negli ultimi anni come inibitori PARP sono emersi come promettenti farmaci terapeutici per i tumori. Sebbene gli inibitori PARP inizialmente sono stati trovati per essere efficace nel gene del cancro al seno (BRCA)-mutato di cellule di cancro al seno, ora c'è una pletora di prova per i loro effetti nelle terapie di combinazione e mono - insieme offensivi agenti/irradiazione contro del DNA un ampio spettro di tumori con mutazioni non limitate a BRCA15,16,17,18,19,20.
A livello molecolare, l'attivazione di PARP è stata indicata per giocano un ruolo critico nell'organizzare la struttura locale della cromatina nei siti di danno. Assunzione di PAR-dipendente di enzimi di modificazione della cromatina facilita la riparazione DSB e dettami ripristino scelte di percorso, suggerendo il ruolo importante dell'armatura di PAR modifica presso siti di danno. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 , recentemente abbiamo dimostrato l'esclusione della p53-binding protein 1 (53BP1) da danni siti di PAR 32, fornendo una spiegazione alternativa per 53BP1-dipendente iperattivazione di endjoining non-omologo ( NHEJ) di PARP inibitore e mettendo in evidenza l'importanza di PARP in DSB riparazione via scelta33,34. PARP1 anche direttamente PARylates e colpisce l'attività del DNA più riparare fattori14.
Usando il Laser Microirradiation come strumento per studiare DDR/riparazione In Vivo
Microirradiation laser per produrre alterazioni di sub-micron sui singoli cromosomi era in primo luogo descritto nel 196935 ed esaminate dettagliatamente nel 198136. Alcuni decenni più tardi, laser microirradiation è stato indicato per indurre il danno del DNA in una regione definita submicrometrici nel nucleo della cellula ed è stato dimostrato di essere una tecnica importante per lo studio di reclutamento o modifiche dei vari fattori per DNA lesioni in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. questo metodo permette la rilevazione di quei fattori che non fanno i fuochi indotta per irradiazione distinti (Martina) a danni siti39,42. È anche possibile esaminare la dinamica spazio-temporale dei cambiamenti strutturali della cromatina sia a siti di danno che nel resto del nucleo. Abbiamo confrontato con attenzione il DDR indotto da sistemi laser diversi e poteri per valutare la relazione tra il tipo di danno del DNA e il microirradiation condizioni32,43,44, di input 45. I modelli di reclutamento aberrante di 53BP1 e telomerica ripetere fattore legante 2 (TRF2) sono stati osservati negli studi precedenti danni laser, che ha fornito la base per la ricorrente preoccupazione per la natura "non fisiologica" del danno indotto da laser46 ,47,48,49. Abbiamo trovato che queste apparenti discrepanze ora potrebbero essere spiegate da PARP differenziale che misura la quantità e la complessità del danno indotto32di segnalazione. Abbiamo confermato che: 1) laser-microirradiated cellule (anche dopo irradiazione di potenza di ingresso alta) vengono arrestate in interfase in un modo di controllo-dipendente di checkpoint danni e rimanere vitali (almeno fino a 48 h)32,50; e 2) riparazione fattore reclutamento/modifiche ricapitolare fedelmente quelle osservate con il trattamento con agenti offensivi del DNA convenzionali ed induzione di DSB da endonucleasi32,39,42, 44,50,51,52. Questi risultati sostengono fortemente la rilevanza fisiologica di studiare laser indotta da danno risposte cellulari.
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Protocol
1. preparazione delle cellule base
Nota: Questo passaggio è per il rilevamento di immunofluorescenza standard del reclutamento di proteina endogena o della modifica e per l'uso di una linea cellulare che esprimono una proteina ricombinante fluorescente contrassegnata. Ad esempio, Potorustridactylus (PtK2) le cellule epiteliali del rene marsupiali che esprimono stabilmente EGFP-53BP11220-1711 o TRF2-YFP sono stati usati nel nostro precedente studiano (Figura 1)32. Nel primo caso, la messa a fuoco che formano la regione di 53BP1 (aminoacido 1220-1711) che contiene il dominio di oligomerizzazione, il dominio Tudor e il motivo di reclutamento ubiquitylation-dipendente (UDR), è stato fuso a GFP avanzata (EGFP-53BP11220-1711). Questa proteina di fusione ricapitola il reclutamento del sito di danni del full-length 53BP153,54,55. In cellule HeLa, fluorescente contrassegnate subunità della coesina (ad es., hSMC1-GFP51, GFP-CP1 (Rad21)52e GFP-SA2 51) deve essere stabilmente espresso per garantire efficiente incorporazione nel complesso e per ricapitolare reclutamento di sito S/G2 ciclo cellulare fase-specifici danni della coesina endogeno51.
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Semi di qualsiasi tipo di cellula aderente su un piatto di coltura del tessuto di 35mm con un vetrino coprioggetto quadrettato per consentire per l'identificazione delle singole celle. Regolare il numero iniziale delle cellule per ottenere confluency di 60% in 36-48 h sulla base del tasso di proliferazione della linea cellulare particolare. Per esempio:
- Per PtK2 cellule epiteliali di marsupiali del rene (o wild-type o quelli che esprimono stabilmente EGFP-53BP11220-1711 o TRF2-YFP): piastra 2.0 x 104 cellule in 2 mL Advanced minimo essenziale medio (MEM) completati con 2 mM L-Glutammina, 4% fetale bovino siero (FBS) e gli antibiotici (100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina) e incubare a 37 ° C con 7% CO2.
- Per HeLa cellule con che esprimono stabilmente fluorescente contrassegnati proteine ricombinanti GFP-SA2: seme 1.0 x 105 celle in 2 mL Medium (DMEM per volta Eagle di Dulbecco) completati con 10% FBS, 2mm L-glutamina, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL streptomicina, e incubare a 37 ° C con 5% CO2. Altre cellule HeLa possono anche essere utilizzati inclusi cellule non modificate o cellule che esprimono hSMC1-GFP.
- Consentire alle cellule di aderire e proliferare per 36-48 h prima di induzione di danno del DNA alla confluenza di 30-60% (per permettere la visualizzazione del numero di griglia). Procedere alla sezione 4.
2. transitori di transfezione
Nota: A volte buoni anticorpi non sono disponibili per rilevare le proteine endogene. Se non sono disponibili linee cellulari che esprimono stabilmente le proteine marker, eseguire transfezioni transienti per monitorare proteine fluorescente contrassegnati per le analisi di cellule vive.
- Per le cellule HeLa, il giorno 1, 6-8 x 104 cellule in 0,5 mL di coltura in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti di semi e incubare in un 100% incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Vedere il punto 1.1 per le condizioni di coltura.
- Giorno 2, uso un plasmide di espressione mammifera codifica un DNA fluorescente contrassegnato riparare fattore (ad es., GFP-NTH1 o GFP-OGG1 per danno base32,44,56, GFP-Ku per dose elevata DSBs57, GFP-53BP1 32 per DSBs relativamente semplice, o altre proteine di interesse fusa al tag fluorescente) per eseguire liposoma-mediata di transfezione del DNA. Diluire 0,3 µ g plasmide DNA in 25 µ l di terreno di coltura privo di siero in una provetta da 1,5 mL.
- In un'altra provetta da 1,5 mL, diluire reagente di transfezione del DNA base di liposomi di µ l 1 in 25 µ l di terreno di coltura privo di siero e mescolare delicatamente.
- Mescolare delicatamente l'agente di DNA e transfezione diluito e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (TA) per formare complessi DNA-lipidico.
- Sciacquare una volta cellule con 0,5 mL di coltura, rimuovere il supporto e aggiungere 0,5 mL di coltura fresca per le cellule (come al punto 1.1).
- Aggiungere i complessi DNA-lipidica delle cellule. Mescolare delicatamente a dondolo la piastra un paio di volte. Rimettere le cellule in incubatrice come descritto al punto 2.1.
- Dopo 4-6 h, rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e aggiungere 300 µ l 0.05% tripsina-EDTA. Toglierlo, aggiungere 200 µ l tripsina-EDTA e incubare nell'incubatore 37 ° C per 3-4 min.
- Dopo aver confermato che le cellule sono staccate, aggiungere 800 µ l di coltura e risospendere le cellule pipettando delicatamente per spezzare i grumi di cellule. Trasferire la sospensione cellulare a una piastra di coltura di 35mm con un vetrino coprioggetto griglia e aggiungere mezzi di coltura ad un volume finale di 2 mL.
- Incubare le cellule nell'incubatrice come descritto al punto 2.1 per 48 h, quindi procedere alla sezione 4.
Nota: Se l'espressione della proteina ricombinante è tossico (cellule trasfettate mostrano morfologia rotonda o irregolare dopo incubazione nel passaggio 2.8), abbreviare il tempo di espressione ed eseguire laser microirradiation (sezione 4) a 16-20 h dopo trasfezione fintanto che il espressione della proteina può essere confermato (per la rilevazione della fluorescenza, vedi punto 4.3). In questo caso, eseguire transfezione direttamente nel piatto 35 mm. Seme 3.0 x 105 HeLa cells in un piatto di 35mm con un vetrino coprioggetto quadrettato per ottenere circa 50-70% confluenza dopo plasmidi di DNA Transfect h. 30 e cambiare supporto 2-6 ore dopo la trasfezione. Procedere con laser microirradiation 12-20 h successive se l'espressione della proteina è ragionevole e le cellule appaiono sane.
3. ciclo cellulare sincronizzazione
Nota: Per ricombinazione omologa (HR) proteine di riparazione, come Rad51 e coesina, il reclutamento è più prominente in fase S/G2 del ciclo cellulare, nella quale HR riparazione prende posto51. Così, per monitorare l'assunzione di queste proteine, sincronizzazione delle cellule in fase S/G2 è necessaria.
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Sincronizzazione di fase S/G2
- Utilizzare il protocollo di blocco doppio timidina per la sincronizzazione delle cellule S/G2 fase50,51. Dopo la semina le cellule in un piatto di griglia coprioggetto di 35 mm (Vedi punto 1.1), incubare le cellule con timidina (a una concentrazione finale di 2,5 mM) in mezzi di coltura (come al punto 1.1) per 17 ore a 37 ° C e 5% CO2.
- Lavare le cellule con terreni di coltura privo di timidina 1ml (come al punto 1.1) due volte e incubare le cellule in terreno di coltura privo di timidina 2 mL per 9 h come al punto 1.1.
- Aggiungere 200 µ l di soluzione madre di 27,5 mM timidina (disciolta in terreni di coltura) in terreni di coltura con le cellule ad una concentrazione finale di timidina 2,5 mM. Incubare le cellule come descritto al punto 3.1.1 per h. 15 un altro risciacquo e incubare le cellule in terreno di coltura privo di timidina per 4-6 h e indurre danni al DNA (sezione 4).
- Confermare l'efficienza di sincronizzazione utilizzando marcatori del ciclo cellulare (ciclina A2 e B1 per S/G2 e G2, rispettivamente), fattori di riparazione di danni del DNA di fase-specifici di S/G2 (ad es., Rad51 o coesina), o dall'IdU/EdU incorporazione (per le cellule di fase S)51.
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Sincronizzazione di fase G1
- Seme 6-8 x 104 le cellule HeLa in una piastra di coltura di 35 mm con griglia coprioggetti (punto 2.1).
- Dopo 2 giorni, identificare cellule in metafase, che sono leggermente sollevata ed a forma di rotonda, sotto un microscopio invertito con obiettivo 10x e 10 X oculare lenti. Acquisire immagini per registrare la posizione delle cellule di metafase il coprivetrino quadrettata.
- Dopo 3-4 h, confermare la divisione cellulare in due cellule figlie (nella fase G1) e indurre danni al DNA (sezione 4).
4. titolazione del Laser di potenza in ingresso
Nota: In questo protocollo, induciamo il danno del DNA usando un 780 nanometro ha pulsato sistema di laser NIR fs attaccato ad un microscopio confocale, o un 800 nanometro ha pulsato laser NIR fs accoppiato ad un microscopio invertito epi-fluorescenza. Anche se la potenza in ingresso (effettivo irraggiamento al punto focale laser nel campione) necessaria per indurre DDR paragonabile è diverso in questi sistemi, il principio base della titolazione di potenza in ingresso è applicabile a entrambi, o qualsiasi, NIR sistemi32,57 . L'energia in situ per irraggiamento di impulso e picco di laser al punto focale per i sistemi due laser erano nella gamma di 5,33 × 10-2-4 × 10-1 nJ e 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, rispettivamente32.
- Accendere il laser NIR e consentire al sistema laser di warm-up per 1 h prima dell'uso.
- Mettere un piatto di cellule su un palco riscaldata (37 ° C) in una camera che permette di CO2 (5%) e controllo dell'umidità (100%).
Nota: Se una camera di CO2 non è disponibile, utilizzare CO2-mezzi di coltura indipendente per fino a 5-6 h. Se una fase di riscaldamento non è disponibile, mantenere le cellule sotto il microscopio per < 20 min e rimettere immediatamente l'incubatrice di coltura del tessuto con temperatura adeguata, CO2e controllo dell'umidità. Queste condizioni di cultura possono variare a seconda del tipo di cella specifica utilizzato così come l'organismo di derivazione (ad es., mammiferi e anfibi). - Per l'analisi di cellule vive di proteine fluorescente, selezionare un filtro GFP (450-490 nm eccitazione, 515-586 nm emissione) o Cy3 (540-552 nm eccitazione, > 590 nm emissione) per GFP o fusi con mCherry proteina, rispettivamente, utilizzando un 100x o immersione in olio X 63 obiettivo.
- Ricerca per le cellule che hanno segnali di fluorescenza paragonabile, che riflette i livelli comparabili di espressione della proteina. Evitare le cellule che hanno troppo debole o troppo forte espressione al fine di ridurre la variabilità della cellula--cellula in misure di fluorescenza.
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Titolare la potenza di ingresso di laser.
- laser NIR 780 nm collegato ad un microscopio confocale
- Utilizzare la funzione di candeggina software per destinazione tracce lineari all'interno del nucleo delle cellule per l'esposizione alle scansioni laser singolo (risoluzione 512 x 512 pixel, zoom X1, sbiancato regione 50 x 4 pixel, tempo di permanenza di 12,8 µs pixel, iterazione x1) attraverso l'obiettivo di olio (100 X / 1.3 NA).
- Regolare la percentuale di trasmissione del laser (utilizzando il software/hardware integrato nel sistema di microscopio laser dal produttore) al 5% senza modificare le altre impostazioni.
- Inserire una cella al centro del campo. Fare clic sull'area di strumento di interesse (ROI) e disegnare una linea o la casella (circa 50 x 4 pixel) nel nucleo utilizzando il mouse e fare clic sul pulsante "Candeggina" per indurre il danno del DNA.
Nota: Nei passaggi successivi irradiazione, "sbianca" dovrebbe essere aumentato in incrementi del 5% al 40% o fino al 100% se necessario. - 800 nm del laser NIR attaccato al microscopio a epifluorescenza
- Controllare la potenza in ingresso attraverso un (63 X / 1,4 NA) contrasto di fase obiettivo di immersione olio di rotazione motorizzata di un filtro di polarizzazione introdotto nel percorso ottico e montato su una fase rotazione motorizzata comandata da calcolatore32,39 , 58.
- Regolare l'angolo di polarizzatore (°) e misurare la potenza in ingresso (mW) entrando il microscopio, usando un misuratore di potenza del laser. Determinare gli angoli di polarizzatore che forniscono inpue potenze che vanno da 20 mW-155 mW a incrementi di 5-10 mW.
- Impostare l'angolo di polarizzatore che corrisponde a 20 mW di potenza di ingresso.
Nota: Per il nostro sistema di laser, se l'angolo di polarizzatore è 40 °, la potenza assorbita è di 65 mW. Aumentare la potenza in ingresso con incrementi di 5-10 mW.
- laser NIR 780 nm collegato ad un microscopio confocale
- Per l'analisi di cellule vive, passare alla procedura 6.1 e 6.3. Per il rilevamento di immunofluorescenza della proteine endogene o modifiche, procedere alla sezione 5. Dopo l'analisi, andare al punto 4.7 per ulteriore titolazione della potenza del laser. Per analizzare il requisito di fattore a Monte, andare alla sezione 7.
Nota: Reclutamento di fattori di BER e NHEJ è veloce (entro pochi minuti) e transitori (< ~ 30 min - 1 h a seconda del fattore e < ~ 4 h post danneggiare induzione, rispettivamente). Al contrario, l'assunzione di fattori HR Rad51 e coesina è rilevabile a ~ 30 min - 1 h e tendono a persistere più di 8 h a unrepaired del DNA lesioni44,50,51. Pertanto, è necessario esaminare diversa volta punti post irradiazione per riparazione diversi fattori. - Aumentare la potenza di ingresso desiderati incrementi (cioè, 5% per 780 laser NIR e 5-10 mW per 800 NIR) come descritto al punto 4.4 e ripetere i passaggi 4.5-4.7 su una nuova serie di celle per determinare la soglia (50% di cellule danneggiate Vedi assunzione) e picco (100% di cellule Visualizza assunzione) per ogni proteina.
5. immunofluorescenza
Nota: per il rilevamento di modificazione covalente di proteine, come PAR (marker di danno complesso) e fosforilazione H2AX (γH2AX) (indicatore DSB), così come dimero di pirimidina del cyclobutane (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) e 8-oxoguanine (8-oxoG) (reticolazione e base di marcatori di danno, rispettivamente), le cellule devono essere corretti e macchiate con gli anticorpi specifici. Inoltre, si consiglia di confermare i risultati ottenuti con le proteine ricombinanti fluorescente contrassegnate tramite rilevazione di anticorpi delle proteine endogene, per distinguere gli artefatti indotti dalla sovraespressione di proteine di fusione ricombinante.
- Difficoltà cellule in diversi momenti dopo induzione di danno (punto 4.5) a seconda dei fattori sostituendo i terreni di coltura (Vedi punto 1.1) con 1,5 mL di 4% paraformaldeide/1 X PBS per 10 minuti a TA.
Attenzione: Paraformaldeide fumi sono tossici e tutto il lavoro dovrebbe essere fatto in una cappa ventilata. - Rimuovere la paraformaldeide 4% / PBS e aggiungere 1 mL di 0.5% detergente/PBS per 10 minuti a TA.
- Rimuovere le cellule di detersivo/PBS e risciacquo di 0,5% con 2 mL di PBS per 5 min due volte e incubare le cellule in 2 mL di soluzione bloccante (siero di vitello di 10%, 1% BSA/PBS) per 1 h a TA.
- Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere 2 mL di PBS alle celle e sostituire PBS con 250 µ l di soluzione di anticorpo primario del 3% BSA/PBS durante la notte a 4 ° C o 1 h a RT. uso un 1: 200-diluizione 1: 500 (concentrazione tipica circa 1 µ g/mL, determinato empiricamente) per gli anticorpi specifiche per diversi indicatori di danno del DNA (ad es., γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); RAD51/coesina (DSB, HR); CPD/6-4PP (reticolazione danni); 8-oxoG/DNA glycosylases (ad esempio, NTH1) (danno di base); PAR (danno complesso dose elevata)).
- Rimuovere la soluzione di anticorpo e risciacquare con 2 mL di PBS per 5 min due volte, Rimuovi PBS e incubare con 250 anticorpo secondario in 0,1% µ l in 3% BSA/PBS per 1 h al buio a TA.
- Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e aggiungere 2 mL di PBS per 5 min due volte e mantenere le cellule in 1.5-2 mL di PBS a 4 ° C per l'imaging ai punti 6.1 e 6.2.
6. analisi di fluorescenza quantitativa di Immunostained o cellule vive
- Catturare immagini di cellule macchiate o dal vivo (n > 10) utilizzando microscopio utilizzato per irradiazione. Per il sistema di epi-fluorescenza microscopio, utilizzare la risoluzione di 1.344 x 1.024 pixel e salvare le immagini come file TIFF 16 bit. Per un microscopio confocale, utilizzare l'ingrandimento di 1x; Laser di argon per GFP/FITC, laser HeNe 594 per Cy3/mCherry; 512 x 512 o 1.024 x 1.024 pixel per risoluzione dell'immagine; 5, numero di velocità di scansione: 1 per una scansione rapida o 2 + per una media di scansioni multiple per migliorare il rapporto segnale-rumore.
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Utilizzare un'analisi di immagine programmi progettati per misurare l'intensità di pixel.
- Utilizzare lo strumento rettangolo di Volume per disegnare un ROI intorno al sito di danni nell'immagine singola cella. Utilizzare la stessa dimensione ROI per misurare il segnale di fluorescenza di fondo nel nucleoplasma adiacente, ma non sovrapposte con i siti di danno. Questo è importante per la normalizzazione di photobleaching connesso con il sistema di microscopio confocale-non.
- Per misurare i segnali di fluorescenza usando il programma di analisi di immagine, fare clic su "Volume Analysis Report" trovato nella cassetta degli attrezzi. Apparirà una nuova finestra. Nella sezione "Dati a Display", selezionare solo le caselle "Nome" e "Densità". Quindi fare clic su "Fatto" per visualizzare le misurazioni.
- Esportare i valori in un foglio di calcolo facendo clic sull'icona tabella trovato nella parte inferiore della finestra di Report Volume e selezionare "schede (formato excel)" per separatori di campo e "File" per esportare destinazione.
- Per ottenere segnali relativi, è necessario utilizzare il programma di foglio di calcolo per dividere l'intensità di fluorescenza nel sito di danno (colonna 1) di che nel controllo sfondo regione (colonna 2) nel nucleoplasma e sottrarre da 1 per la normalizzazione.
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Analisi di tempo-corso di fluorescenza quantitativa in tempo reale utilizzando il microscopio confocale
- Identificare cellule proteina-positive fluorescente contrassegnate utilizzando il microscopio come descritto al punto 4.3.
- Eseguire l'imaging di fluorescenza time-lapse prima danno e in diversi momenti dopo induzione di danno nella sezione 4. Prima disegnare la candeggina ROI (per induzione di danno), quindi selezionare la "Acquire > Time Series" sottomenu, impostare il "Numero" come 20 e il "ritardo ciclo" come 30 s, scegli "candeggina una volta dopo la prima scansione" e quindi facendo clic su "start B". In questo caso, la prima immagine viene acquisita immediatamente prima di induzione di danno, seguita da 19 acquisizioni di immagine a un intervallo di 30 s. Intervalli ("ritardo del ciclo") possono essere modificati a seconda dello scopo dello studio.
- Una volta completata l'acquisizione di immagini, fare clic su "Significa" e disegnare il ROI alla regione di danni. Fare clic su «Show Table» per ottenere una tabella che elenca l'intensità all'interno il ROIs selezionato. Normalizzare i dati dividendo l'intensità della fluorescenza del sito danno a tempi diversi dall'intensità della stessa regione prima di danni e sottrarre 1.
7. piccolo RNA interferenti (siRNA) transfezione
Nota: Lo svuotamento della proteina dell'obiettivo è un modo efficace per delineare il requisito di fattore a Monte per l'assunzione di proteine osservati ai danni di siti (sezione 4). Inoltre, la strategia è il modo migliore per affrontare la specificità di un anticorpo utilizzato per il rilevamento di immunofluorescenza (Vedi sezione 5).
- Giorno 1: Preparare 2 pozzi delle cellule HeLa in una piastra a 24 pozzetti da semina 6-8 x 104 le cellule HeLa in 0,5 mL di coltura in ciascun pozzetto, uno per la transfezione di siRNA di controllo e uno per PARP1 siRNA (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3').
- Giorno 2: Confermare che le cellule sono circa 40-50% confluenti. Eseguire il primo giro di trasfezione con siRNA: diluire 5 pmol siRNA in 25 µ l di terreno di coltura privo di siero, aggiungere Reagente di transfezione in base 3 lipidi µ l nella provetta, agitare delicatamente e incubare per 5-10 minuti a TA.
- Sciacquare le cellule con 0,5 mL di coltura fresca una volta e mantenere le cellule in terreno di coltura fresco di 0,5 mL (Vedi punto 1.1).
- Aggiungere i complessi RNA-lipidi alle cellule e mescolare delicatamente inclinando il piatto di avanti e indietro. Rimettere le cellule in incubatrice come descritto al punto 2.1.
- Aspirare la miscela di transfezione e aggiungere 0,5 mL di coltura fresca (punto 1.1) dopo 6 h.
- Giorno 3: Eseguire il secondo round del siRNA transfezioni (Vedi punto 7.2). Allora, seed 60-100% delle cellule in un piatto di griglia coprioggetto 35 mm come descritto al punto 2.3.
- Giorno 5: Procedere con microirradiation laser utilizzando la condizione di potenza ottimale del laser per massima per l'assunzione del fattore di interesse, come determinato dalla sezione 4. In genere, svuotamento efficiente può essere osservato in circa il 60-90% delle cellule HeLa.
Nota: Come un'alternativa e complementare approccio, inibitori, se disponibile, può essere utilizzato per inibire la funzione del fattore di interesse32,44. Per analizzare l'effetto di inibire la segnalazione di DDR, aggiungere inibitore PARP 20 µM, 1 µM PAR glicoidrolasi (PARG) inibitore o 10 della chinasi di proteina DNA-dipendente µM con subunità catalitica (DNA-PKcs) inibitore e 10 µM ATM inibitore in dimetilsolfossido (DMSO) per la piatti 1 h prima di induzione di danni. Aggiungere DMSO solo alle cellule di controllo.
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Representative Results
Utilizzando PtK2 le cellule che esprimono EGFP-53BP11220-1711 o TRF2-YFP, titolazione di alimentazione in ingresso di laser è stato effettuato per determinare la condizione ottima per la loro assunzione (Figura 1)32.
Siti di danno del laser di alta potenza di ingresso, il clustering significativo della CPD (reticolazione danno tipicamente generato da danno ultravioletto (UV)) così come GFP-NTH1 DNA glicosilasi che riconosce specificamente danno base sono stati osservati. Inoltre, i segnali di XRCC1 e CtIP elevata sono stati osservati, che riflette l'aumento del numero di rotture del filo e dimostrando che danno complesso DNA è indotto in questa condizione (Figura 2A). Altri glycosylases di DNA fuso a proteine fluorescenti (ad es., GFP-nia endonucleasi VIII-simile 2 (NEIL2) e glicosilasi GFP-8-Oxoguanine (OGG1)) così come di condensin I può essere utilizzato anche come danno base marcatori44,59. Coerentemente con questo, abbiamo trovato che la risposta PAR è indotto significativamente di laser ad alta potenza di ingresso (cioè, energia e irraggiamento nel punto focale nell'esemplare), ma solo debolmente di potere basso del laser nel punto focale (Figura 2B, in alto a sinistra). PER segnali, ma non PARP1 la localizzazione della proteina, in siti di danni era sensibili all'inibitore PARP (dati non mostrati). Inoltre, siRNA specifici per PARP1 diminuito sia PAR e PARP1 presso siti di danno (Figura 2B, in alto a destra)32. Nella circostanza di alta potenza in ingresso, γH2AX appare inizialmente presso i siti di danno e si diffonde rapidamente per l'intero nucleo in maniera ATM/DNA-PK-dipendente (Figura 2B, in basso). ATM/DNA-PK-dipendente diffusione simile di γH2AX è stato segnalato per γ-irradiazione60. Con entrambi 800 e 780 nm NIR laser sistemi32sono stati ottenuti risultati coerenti. Presi insieme, i risultati rivelano che è possibile a titolare laser potenza in ingresso (e di conseguenza, dell'energia e dell'irraggiamento nel punto focale nella cella) di trovare le condizioni che inducono i diversi gradi di risposta PARP che correla con il numero di DSBs e il complessità del danno del DNA.
I risultati sopra indicati inizialmente ha suggerito che la presenza di danno del DNA complesso potrebbe aver causato il reclutamento differenziale di 53BP1 e TRF2. È interessante notare, tuttavia, l'assunzione di1220-1711 53BP1 a un sito di bassa potenza danno efficacemente è stata inibita dalla presenza del secondo sito di danno indotto da alta-ingresso-alimentazione nel nucleo della cellula stessa (Figura 3A in contrasto con Figura 3B ). I risultati indicano che danno alta-ingresso-alimentazione laser sopprime 53BP1 reclutamento in trans. Inibizione di PAR da inibitore PARP come pure inibizione di tutto il nucleare γH2AX diffusione da ripristino inibitori ATM/DNA-PK questa assunzione anche per il sito di danni di alta potenza in ingresso (Figura 3A). Ciò è distinta dall'assunzione del mediatore di DNA danni Checkpoint 1 (MDC1) ai siti di danno, che principalmente è stata inibita da dispersione di γH2AX e di conseguenza, è stato restaurato dagli inibitori di ATM/DNA-PK, non inibitore PARP (Figura 3A, in basso). D'importanza, iperattivazione di PAR tramite inibizione di PARG (senza modificare lo stato di γH2AX) efficacemente soppressa 53BP1 iniziale reclutamento anche presso i siti di bassa potenza di ingresso danni che normalmente reclutare 53BP1 efficientemente (Figura 3B)32. Presi insieme, questi risultati indicano che PAR la segnalazione e non il tipo di danno di per sé, interferisce con l'assunzione di 53BP132. Questo è un esempio della versatilità del laser microirradiation, che ci permette di esaminare come più danni siti influenzano e interagiscono tra loro.
Figura 1 : Titolazione del laser di potenza in ingresso. Per determinare la potenza del laser da utilizzare per futuri esperimenti, PtK2 le cellule che esprimono EGFP-53BP1 e TRF2-YFP sono stati sottoposti a laser microirradiation con ingresso potenze comprese tra i 20 mW e 155 mW usando il 800 nm NIR laser/invertito epi-fluorescenza sistema di microscopio. Reclutamento di EGFP-53BP1 è stato monitorato per 15 min post irradiazione (p.i.), mentre le cellule TRF2-YFP sono state seguite per 6 min p.i. I numeri direttamente sopra le barre rappresentano il numero di cellule che hanno mostrato di reclutamento positivo di EGFP-53BP1 o TRF2-YFP per i siti di danno rispetto al numero totale di cellule testate. Questa figura è stata modificata da Saquilabon Cruz32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Induzione di danno complesso e robusto DDR segnalazione di laser ad alta potenza di ingresso. (A) alta-ingresso-alimentazione laser microirradiation induce danno complesso compreso le rotture del filo (DSBs sia SSB), reticolazione e danno base. CPD, XRCC1 (SSB e DSB di riparazione), NTH1 DNA glicosilasi (BER) e CtIP (alternative NHEJ e HR) sono mostrati (solo GFP-NTH1 è un'immagine di cellule vive e il resto sono osservati dopo colorazione di immunofluorescenza). Misure di intensità di fluorescenza quantitativa del reclutamento sito danni sono stati fatti come indicato nel protocollo sezione 7 e sono mostrate nel BoxPlot. Il numero totale di cellule (n) testato può essere visto sotto ogni proteina quantificato. p-valore < 0.05. (B) Top (a sinistra): PAR robusto ed PARP1 segnali a siti di danno elevato di potenza di ingresso. Parte superiore (a destra): lo svuotamento di siRNA PARP1 è sufficiente per abolire il PAR segnale32,44. In basso: Analisi in corso tempo di γH2AX in cellule con basso (in alto) e alto (in basso) ingresso danno potenza come indicato. Barre di scala = 10 µm. Questa figura è stata modificata da Saquilabon Cruz32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Attivazione differenziale di segnalazione DDR colpisce 53BP1 reclutamento per danneggiare siti. Parte superiore (A): le cellule di PtK2 che esprimono EGFP-53BP11220-1711 furono microirradiated con sia bassa (15%) e alta (25%) potenza in ingresso (bianco e giallo punte di freccia, rispettivamente) nel nucleo stesso utilizzando il sistema di microscopio confocale/NIR di 780 nm. Questo è stato effettuato in presenza di DMSO, PARP inibitore (Pi), o la combinazione di ATM, DNA-PK e inibitori PARP (Ai + Di + Pi) come indicato. Formazione immagine di cellule vive di EGFP-53BP11220-1711 venne catturata a 30 min dopo induzione di DSB. Le cellule erano quindi fissi e macchiate con un anticorpo specifiche per γH2AX come un marcatore DSB. Cambiamenti dell'intensità di fluorescenza di EGFP-53BP11220-1711 presso siti di danno sono mostrati sulla destra con p-valori (significa che i valori sono: DMSO, ± 0.03 0.02; PI, 0,34 ± 0.19; Ai + Di + Pi, 0,98 ± 0,23). Fondo: L'effetto del trattamento Pi e Ai + Di localizzazione MDC1 con alta potenza di ingresso danno come indicato. Barra della scala è di 10 µm. A destra: Cambiamenti dei segnali di fluorescenza di MDC1 presso ingresso alto-potere di danneggiano siti in presenza di DMSO, Pi o Ai + Di con p-valori (significa che i valori sono: DMSO, 0,07 ± 0,10; PI, ± 0,05 0,07; Ai + Di, 0.86 ± 0,26). Barra della scala = 10 µm. N = 10 per ogni misura di intensità. (B) l'effetto di potenziamento di PAR segnali di PARGi trattamento l'assunzione di 53BP1 endogeni ai siti di bassa potenza di ingresso danni. A destra: BoxPlot che rappresenta l'analisi quantitativa di reclutamento 53BP1 endogeno (rilevata dalla colorazione di immunofluorescenza) con laser a bassa potenza di ingresso (60 mW nel 800 nm NIR laser/invertito epi-fluorescenza Microscopio sistema) a 15 min post irradiazione in presenza di DMSO o PARGi come indicato. A sinistra: Immunofluorescenza PAR e 53BP1 foto di cellule danneggiate nelle stesse condizioni con DMSO o PARGi trattamento di colorazione. Per il trattamento di DMSO, 100% delle cellule esaminate (N = 25) ha esibito 53BP1 robusto reclutamento (a destra). Al contrario, 20/25 ha mostrato nessun reclutamento 53BP1 in presenza di PARGi (in basso a destra) e 5 cellule hanno mostrato debole reclutamento. Barra della scala = 10 µm. Questa figura è stata modificata da Saquilabon Cruz32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I vantaggi dell'utilizzo di laser microirradiation per la ricerca DDR sono:
1. è fattibile per indurre diversi tipi e quantità di DNA danni da rotture del filo semplice complesso danno del DNA, e per rilevare riparazione diversi fattori al DNA danno siti regolando i parametri di irradiazione del laser. È anche possibile di infliggere danni più volte nel nucleo della cellula stessa al fine di valutare gli effetti di trans (come in Figura 3).
2. è importante osservare eventi che si tengono a siti di danno e gli eventi secondari che si verificano altrove nel nucleo possono facilmente essere distinto.
3. è possibile effettuare misurazioni ad alta risoluzione in tempo reale delle dinamiche di proteina fluorescente contrassegnati in risposta a danni a livello di singola cellula, compreso, ma non limitato a: Förster Resonance Energy Transfer (FRET), (fluorescenza Lifetime Imaging FLIM), funzione di correlazione di coppia (pCF), ecc., per catturare DDR in cellule vive.
4. La combinazione con il trattamento di RNA interferenza o inibitore, è relativamente semplice per testare il requisito di fattore a Monte in un piccolo numero di cellule.
5. dovrebbe anche essere notato che NIR (o verde) radiazione laser non richiede pre-sensibilizzazione del DNA con gli analoghi del nucleotide o coloranti intercalanti del DNA, evitando indesiderati effetti collaterali sull'imballaggio della cromatina. Questo è in contrasto con il sistema laser UV che richiede sensibilizzazione alla dose bassa e causa aberrante DDR a dose elevata39,49,61.
Fasi critiche all'interno del protocollo/modifiche e risoluzione dei problemi
È importante che le cellule sono in buone condizioni di salute quando DDR analisi vengono eseguite al fine di minimizzare l'artefatto e variazioni sperimentali. Cellule trasfettate con DNA o siRNA di solito sono più sensibili o facilmente staccata quando cresce il coprivetrino quadrettata. Aiuta a mantenere le cellule per tempi più brevi nel reagente di transfezione, fintanto che la transfezione funziona e più cellule trasfettate sul piatto da portata gridded coprioggetto confrontato alle cellule untransfected di seme. Questo è necessario per conseguire confluences cella comparabili per gli esperimenti.
È stato segnalato che il blocco di timidina conduce ai livelli aumentati di γH2AX in cellule sincronizzate62, che possono interessare la DDR e falsare i risultati. Inoltre, il segnale di γH2AX della linea di base è stato indicato per essere superiore in fase S e G2/M anche senza qualsiasi danno esogeno63,64. Abbiamo, tuttavia, non osservare qualsiasi segnale significativo γH2AX nel nucleoplasma che influenzano o interferire con la risposta di γH2AX specifici siti di danno indotto da laser nelle cellule sincronizzate in fase S/G2 da un blocco di timidina doppia51.
Al fine di ottenere risultati coerenti, è necessario controllare periodicamente i parametri di output di sistema laser (ogni 2-4 settimane) e l'allineamento ottico (ogni 2 mesi). Nel corso del tempo, componenti del sistema laser devono essere riorganizzate, dell'obiettivo possono essere danneggiati e devono essere sostituite e la stabilità della potenza totale in ingresso potrebbe cambiare. La chiave è quello di valutare la presenza di danni (reticolazione (CPD e/o 6-4PP) e danno di base (8-oxoG)), proteine marker (ad es., DNA glycosylases, Rad51, coesina e Ku) e la modifica di PAR descritti nel presente protocollo per determinare il dosaggio e complessità del danno del DNA indotto dal sistema di microscopio laser utilizzato.
Limiti della tecnica
Microirradiation laser ha dei limiti. Danno del DNA indotto dal fascio laser altamente è un cluster in un'unica area nel nucleo rispetto ai naturali danno che può essere diffusa in tutto il nucleo. Questo potrebbe cambiare come segnalazione danni viene propagata nella cromatina vicina o nel nucleo. Dal momento che un numero relativamente basso di cellule possa essere irradiato in una sola volta, saggi biochimici basati sulla popolazione (ad es., Western blot, purificazione di complessi della proteina, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)) non possono essere eseguite facilmente. Affidamento sulle proteine fluorescente contrassegnati (con iperespressione delle proteine ricombinanti esogene o anche con quelli espressi in modo endogeno mediante inserimento di tag CRISPR-mediata) per formazione immagine dinamica rende vulnerabili alla proteina indotta da fusione degli studi artefatti. La natura unica del danno indotto da laser e potenziali effetti artifactual di tagged proteine, pertanto, devono essere valutati dal confronto con i risultati usando il DNA convenzionale danneggiare metodi (IR, prodotto chimico agenti dannosi) e con l'endogeno proteine senza tag (anche se a volte non è possibile effettuare esperimenti paralleli completi).
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti
L'uso di endonucleasi sequenza-specifici quali-SceI, FokI, AsiSI e PpoI fornisce una strategia alternativa per indurre DSBs site-specific (rigorosamente semplice DSBs). Reclutamento di fattore o modifiche possono essere analizzate da site-specific o genoma ChIP analisi65,66,67,68,69. Relativamente sincrono induzione di DSBs ottenibile mediante codifica l'endonucleasi con un recettore ormone steroide e un segnale di degradazione (degron) per la rapida traslocazione nucleare e degradazione, rispettivamente65,66 , 67 , 68 , 69. si deve prendere in considerazione, tuttavia, che l'efficienza di espressione dell'endonucleasi e accessibilità del sito di destinazione, e lo stato della riparazione in corso può essere variabile in celle diverse e nei siti di destinazione diversi. Queste eterogeneità saranno mediati in analisi ChIP basati sulla popolazione, che può falsare i risultati. Laser microirradiation, d'altra parte, offre la massima risoluzione possibile temporale (millisecondi) come pure di risoluzione spaziale (submicrometrici) delle dinamiche di risposta di danno, che può essere analizzata a livello di singola cellula. Densità di danno elevato, tuttavia, possono influenzare il risultato. Entrambe le strategie possono essere sensibili agli artefatti causati da accessibilità dell'anticorpo e/o peptide tagging. Pertanto, è importante capire i pro ei contro di entrambe le strategie, che potenzialmente possono essere utilizzate per completarsi a vicenda.
Applicazioni future
Con avanzamento rapido della fluorescenza e tecniche dinamiche, versatilità di sistemi laser per indurre diverse quantità e tipi di danno del DNA in fase di ciclo cellulare di posizioni specifiche e fornisce una preziosa opportunità per interrogare il cellulare e risposte molecolari di DNA danno con alta risoluzione spazio-temporale a livello di singola cellula. Sarà possibile, ad esempio, prendere in giro fuori danni site-specific e nucleo cellulare a livello e DDR segnali di trasduzione con risoluzione di millisecondo (ad esempio, rilevare interazioni molecolari o modifiche che si verificano esclusivamente a siti danno, esaminare cambiamenti dinamici della struttura della cromatina in tempo reale, o osservare la diffusione in tempo reale di danno segnalazione da siti di danno per l'intero nucleo). È anche possibile seguire la stessa cella per un lungo periodo di tempo per esaminare gli effetti di danno del DNA sul destino delle cellule. Prevediamo che i metodi di microirradiation laser, se usato correttamente, continuerà a contribuire significativamente al progresso del campo di riparazione del DNA.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Si ringraziano il Dr. Akira Yasui Università di Tohoku, Giappone per il plasmide di espressione di GFP-NTH1 e Dr. Eros Lazzerini Denchi al Scripps Research Institute, La Jolla, in California, per la TRF2-YFP e plasmidi di espressione di EGFP-53BP11220-1711 . Questo lavoro è stato supportato da Air Force Office of Scientific Research (FA9550-04-1-0101) e la Fondazione di Beckman Laser Institute Inc (a M.W.B), la Ford Foundation Fellowship presso l'Accademia nazionale delle scienze (a B.A.S) e NSF MCB-1615701 e CRCC CRR-17-426665 (per K. Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 | Coherent Inc. | Mira 900 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | |
| 63X/1.4 NA objective | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
| Compact Rotation Stage | Newport Corp | PR50PP | |
| Temperature Controller | Warner | TC-344B | |
| Heating System | Ibidi | 10918 | |
| Gas Incubation System | Ibidi | 11920 | |
| Laser Power and Energy Meter (RoHS) | Coherent | FieldMaxII-TOP | |
| ORCA-R2 Digital CCD Camera | Hamamatsu | C10600 | |
| LSM 510 META Laser Scanning Microscopes | Carl Zeiss | ||
| 100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
| 35mm Gridded Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
| PtK2 kidney epithelial cells | ATCC | CCL 56 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| DMEM | Life Technologies | 11885-092 | |
| CO2-Independent Medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| Advanced MEM | Life Technologies | 12492-013 | supplemented with L-Glutamine, 4% FBS |
| penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | 15140122 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Thymidine | SIGMA | T9250 | |
| serum free media (Opti-MEM I Reduced Serum Media) | Fisher Scientific | 11058021 | |
| Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) | Kamiya Biomedical Company | MC-062 | |
| Anti-XRCC1 (mouse ) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
| Anti-53BP1 (rabbit) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
| Anti-CtIP (rabbit) | Abcam | ab70163 | |
| Anti-PAR polymers (mouse) | Enzo Life Sciences | BML-SA216-0100 | |
| Anti-PAR (rabbit) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
| Anti-TRF2 (mouse) | Novus Biological | NB100-56506 | |
| Anti 6-4PP (mouse) | Kamiya Biomedical | ||
| Anti-Rad21 (Rabbit) (for cohesin detection) | generated in Yokomori (KY) lab | ||
| Anti-Rad51 (Rabbit) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8349 | |
| Anti-Ku70 (mouse) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
| 8-oxiguanine | Trevigen, Inc. | ||
| Anti-PARP1 (Rabbit) | generated in KY lab | ref 43 | |
| Anti-hCAPG (Rabbit) (for condensin detection) | generated in KY lab | ref 42 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
| Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
| HiPerFect siRNA Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| GFP-SMC1 stable cell line | generated in KY lab | ref 49 | |
| GFP-NEIL2 stable cell line | generated in KY lab | ref 54 | |
| GFP-NTH1 stable cell line | generated in KY lab | ref 32 | |
| GFP-SMC1 plasmid | generated in KY lab | ||
| GFP-Ku plasmid | generated in KY lab | ||
| Anti-MDC1 (rabbit) | Novus Biologicals | NB100–395 | |
| Anti-gH2AX (rabbit) | Millipore | 07–164 | |
| EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| TRF2-YFP PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
| PARG inhibitor | Trevigen | 4680-096-03 | |
| DNA–PKcs inhibitor NU7026 | Sigma | N1537 | |
| ATM inhibitor KU55933 | Calbiochem | 118500 | |
| Olaparib | Apexbio Technology | A4154 | |
| Paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
| Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | image analysis program |
| Excel | microsoft | spreadsheet program | |
| Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium | Fisher Scientific | 14200166 | dilute to 1X |
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