Summary
このプロトコルの目標はレーザー microirradiation を使用してさまざまな種類の比較的単純な鎖切断と被害サイト体内に DNA 損傷シグナル伝達と修復因子アセンブリを勉強する、複雑な損傷を含む DNA の損傷を誘発する方法を記述することです。.
Abstract
DNA 損傷は、ゲノムの整合性の保護のために重大である細胞のシグナル伝達と修理の特定の応答を誘発します。レーザー microirradiation DNA 損傷応答 (DDR) は、生体内で調査する貴重な実験ツールとなりました。細胞核内のサブミクロン領域に閉じ込められたレーザ誘起損傷に応答高分子ダイナミクスの実時間高分解能単一細胞解析をことができます。ただし、損傷の種類の違いの感謝せず様々 なレーザーの条件が使用されています。その結果、損傷の性質は頻繁にはよく特徴付けられるまたは制御、採用または変更プロファイルに明白な矛盾を引き起こしています。別々 の DDR と修理蛋白質アセンブリを異なる照射条件 (すなわち波長と同様、さまざまな入力力 (域) (fs) 近赤外線 (NIR) レーザー) に誘導を行った。これは、DNA 損傷の種類を反映します。このプロトコルはどのようにレーザー入力電力の滴定により異なる量の誘導と、ベースと架橋損害、シグナル伝達、差動ポリ (adp-リボース) (PAR) の検出が簡単に監視できる DNA 損傷の複雑さについて説明しますと被害サイトで経路特定修復因子アセンブリ。被害の条件が決まったら、さまざまな損傷が複雑さと差分の損傷のシグナル伝達の効果だけでなく、関心の任意の因子に上流因子の枯渇を調査することが可能です。
Introduction
生体内でよくわかりませんが DNA 損傷のシグナル伝達
生体内でDNA はヒストンとフォーム クロマチン繊維と他の要因との複合体です。クロマチン構造の規制は、DNA 代謝に非常に重要です。たとえば、ヒストン異型 H2AX は - 毛細血管拡張性運動失調変異 (ATM) と次の二重鎖改 (DSB) 誘導と DSB 被害増幅だけでなく、他のドッキング サイトを提供することが重要です他のキナーゼによりリン酸化されます。要因。損傷シグナリングと修復経路の選択肢の広がり被害サイト1ローカル クロマチン構造に影響される批判的に表示されます。クロマチン因子、ヒストン シャペロンとヒストンの修正の酵素を再構築の数サイト被害を募集して実際に DDR でクロマチン制御の意義を強調、効率的な DNA 修理のため重要し、修復2,3,4しますさらに、クラスタ リングまたは再配置の被害サイトが観察された酵母、ショウジョウバエ5,6,7、8、内在する遺伝子座の染色体を連想させる、。遺伝子調節9,10に関連付けられている核コンパートメントです。マウスとヒトの細胞での最近の研究はまた、DSB サイト、影響を与える修復再現性と経路選択11,12の動員を明らかにしました。これは、DDR/修理も密接につながるかもしれない核内構造、高次クロマチンと染色体細胞核ダイナミクス可能性を発生させます。したがって、DDR の研究および DNA 損傷の短期および長期結果を理解するために生細胞の内因性核環境のコンテキストでプロセスを修復する高分解能手法の開発が重要です。
パー ポリメラーゼ (PARP) 測定範囲と被害の種類と被害サイトで蛋白質の集合を調節する重要な役割
化における PARP1 は急速に重要な役割を果たしている DNA 修理13DNA 損傷によって活性化 DNA ニック センサーです。化における PARP1 は x 線修理クロスを補完する 1 (XRCC1) 塩基除去修復 (BER) を容易にするとともに機能と考えられていたが、最近の研究は、DSB 修復14を含む、他の DNA 修復経路におけるその役割を明らかにします。ADP ribosylate を基質としてそれ自身を含む複数のターゲット蛋白質の化における PARP1 使用してニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD+) を活性化。PARP 阻害剤はがん治療薬として有望な浮上するいると、この酵素と他の家族のメンバーでは、近年、注目をされています。PARP 阻害剤は、乳癌の遺伝子 (BRCA) で効果を発揮する発見された当初が-乳房のがん細胞を変異と DNA 損傷に対してエージェント/照射とモノとの組み合わせ治療の効果のための証拠の茄多は今突然変異で BRCA15,16,17,18,,1920に限らず癌の広いスペクトル。
分子レベルで損傷のサイトでローカルのクロマチン構造を整理するのに重要な役割を果たす PARP 活性化を示した。クロマチン修飾酵素のパー依存型募集を容易に DSB の修復とおもむくまま修復経路の選択肢、損傷のサイトで PAR 変更の重要な足場の役割を示唆しています。13、21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30パー 32、非相同 endjoining (53BP1 依存陰嚢の代替説明を提供することによってサイトを我々 は最近、損傷から p53 結合蛋白質 1 (53BP1) の除外を示した,31NHEJ) PARP 阻害剤と DSB の PARP の意義を強調修復経路選択33,34。化における PARP1 も複数の DNA の活動を修復 PARylates、影響を与える直接の要因14。
生体内での DDR/修理勉強するツールとしてレーザー Microirradiation を使用してください。
個々 の染色体におけるサブミクロン変化を生成するレーザー microirradiation 最初 1969年35で説明され 1981年36で詳細に検討します。数十年後、レーザー microirradiation 細胞核内の定義されたサブミクロン領域での DNA 損傷を誘導することが示され、募集や DNA 病変で生体内にさまざまな要因の変更を研究する貴重な方法であることが証明されました13,37,38,39,40,41。 このメソッドの被害サイト39,42異なる照射誘起巣 (IRIF) を形成しないそれらの要因の検出が可能。また、被害現場と核の残りの部分の両方のクロマチン構造変化の時空間ダイナミクスを検討することが可能です。我々 は慎重に異なるレーザー システムによる Ddr を比較し、DNA 損傷の種類と microirradiation 条件32,43,44との関係を評価する力を入力 45。53BP1 とテロメア異常募集パターンを繰り返す結合因子 2 (TRF2) が定期的なレーザ誘起損傷46 の「生理学」の自然へ関心基盤を提供以前のレーザー損傷研究で観察された ,47,48,49。ゲージ量と損傷32の複雑さをシグナリング今差分 PARP で説明できるは、そのこれらの明白な不一致であることがわかった。確認した: 1) (高入力電力照射) 後もレーザー microirradiated 細胞が損傷チェックポイント制御依存的に中間期に逮捕され、実行可能に残る (少なくともまで 48 h)32,50;・ 2) 修復因子募集/修正を忠実に要約エンドヌクレアーゼ32,39,42、従来の DNA 有害な代理店との処置と DSB 誘導, 44,50,51,52。これらの結果は、レーザー損傷による細胞応答を勉強の生理学的な関連性を強くサポートします。
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Protocol
1. 基本的なセル準備
注: この手順は、内因性のタンパク質の募集または変更、標準的な蛍光検出のため、蛍光タグ組換えタンパク質を安定に発現する細胞株を使用するためです。たとえば、私たちの前に使用された EGFP 53BP11220-1711または TRF2 YFP を安定に発現するPotorustridactylus (PtK2) 有袋類の腎臓上皮細胞研究 (図 1)32です。前者の場合、53BP1 の領域を形成するフォーカス (1220-1711 アミノ酸) を含む、ドメイン、Tudor ドメイン、およびユビキチン化依存募集 (UDR) モチーフは強化された GFP (EGFP 53BP11220-1711) に融解。この融合タンパク質は、フルレングス 53BP153,,5455の被害サイト募集を繰り返します。HeLa 細胞における蛍光タグ サブユニット (例えば、hSMC1 GFP51、GFP Scc1 (Rad21)52、および GFP SA2 51) のコヒーシンの表す必要があります安定複合体に効率的な定款を確保し、要約するには内因性コヒーシン51S/G2 細胞周期段階固有の損傷サイト募集。
-
個々 の細胞の識別を許可するグリッド coverslip で 35 mm 培養ディッシュ上に任意の付着性のセル型をシードします。特定の細胞の増殖率に基づく 36 48 h で 60% の confluency を達成するために初期細胞数を調整します。例えば：
- PtK2 有袋類の腎臓上皮性細胞 (野生型または EGFP 53BP11220-1711または TRF2 YFP を安定に発現するもの): 2 mL のプレート 2.0 × 104セル 2 mM 4% 胎児牛 L-グルタミンを添加した高度な最小必須培地 (MEM)血清 (FBS) と抗生物質 (100 U/mL ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシン) と 7% の CO2と 37 ° C で孵化させなさい。
- Hela 細胞の細胞を安定に発現する蛍光タグ組換えタンパク質 GFP SA2: 種子 1.0 x 105細胞 2 mL ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10 %fbs、2 ミリメートル L グルタミン、100 U/mL ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシンと5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。変更されていないセルまたは hSMC1 GFP を発現する細胞を含む他の HeLa 細胞を使用も可能性があります。
- 細胞が接着し、30-60% (グリッド数の可視化を許可する) に合流で DNA 損傷誘導前に 36 48 h の増殖を許可します。セクション 4 に進みます。
2. トランスフェクション
注: 時々 良い抗体は内因性のタンパク質の検出にご利用いただけません。マーカー蛋白質を表現する安定したセルラインを使用できない場合は、生細胞分析のための蛍光に分類された蛋白質を監視する一時的な transfections を行います。
- HeLa 細胞は、1 日目にシード 24 ウェル プレートのウェル 1 個で 0.5 mL の培地に 10 の4セル × 6-8 および 5% CO2と 37 ° C で 100% の加湿インキュベーターで孵化させなさい。手順 1.1 培地条件を参照してください。
- 日 2、蛍光付けられた DNA をエンコーディング哺乳類発現プラスミドを修復使用要因 (例えば、GFP NTH1 または基本ダメージ32,44,56, 高線量 Dsb57、GFP 53BP1 GFP 区 GFP OGG132比較的簡単の偏向や蛍光タグに融合した興味の他の蛋白質) リポソームを介した DNA トランスフェクションを実行します。0.3 μ g のプラスミド DNA 1.5 mL チューブに無血清培地の 25 μ L に希釈します。
- 別 1.5 mL チューブに無血清培地の 25 μ L に 1 μ L とリポソーム DNA トランスフェクション試薬を希釈、軽く混ぜます。
- 優しく、希薄化後の DNA、トランスフェクションのエージェントをミックスし、フォーム DNA 脂質複合体に室温 (RT) で 10 分間インキュベートします。
- 1 回 0.5 mL の培地で細胞を洗浄、メディアを取り出して、0.5 mL 新鮮な培地を (ステップ 1.1) のようにセルに追加します。
- セルに DNA 脂質複合体を追加します。ロッキング プレートを数回軽く混ぜます。ステップ 2.1 のようにインキュベーターにセルを置きます。
- 4-6 時間後細胞から培養メディアを削除し、追加 300 μ L 0.05% トリプシン-EDTA。それを削除したり、200 μ L を追加トリプシン-EDTA と 3 〜 4 分の 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。
- セルが切り離されるうえ、800 μ L の培地を加えて細胞塊を破るに軽くピペッティングにより細胞を再懸濁します。グリッド coverslip で 35 mm ディッシュに細胞懸濁液を転送し、培地を 2 mL の最終巻に追加します。
- 48 h のステップ 2.1 のようにインキュベーター内のセルをインキュベートし、セクション 4 に進みます。
注: 組換え蛋白質の表現は有毒である場合 (ステップ 2.8 で培養後ラウンドまたは不規則な形態を示す transfected セル)、式の時間を短縮し、レーザー microirradiation (セクション 4) 16-20 h は、限り、トランスフェクション後、蛋白質の表現を確認することができます (蛍光検出手順 4.3 を参照してください)。この場合、35 mm ディッシュに直接トランスフェクションを実行します。30 h. Transfect DNA プラスミド後約 50-70% の合流点を達成し、メディア 2 6 h を変更するグリッド coverslip で 35 mm ディッシュのシード 3.0 x 105 HeLa 細胞トランスフェクション後。レーザー microirradiation 12-20 h を続行後蛋白質の表現は合理的で、細胞が健康に見える場合。
3. 細胞周期同調
注: 相同組換え修復 (HR) 蛋白質、Rad51 などコヒーシン、募集がどの HR の修理かかる場所51、細胞周期の S/G2 段階で目立つ。したがって、これらの蛋白質の募集を監視する S/G2 段階にセル同期が必要です。
-
S/G2 位相同期
- S/G2 段階50,51セル同期の二重チミジン ブロック プロトコルを使用します。35 mm グリッド coverslip 皿に細胞を播種後 (手順 1.1 を参照)、37 ° C で 17 h (ステップ 1.1) のように文化メディアで (最終濃度 2.5 mM) にチミジンと 5% CO2セルを孵化させなさい。
- (ステップ 1.1) のように 1 mL 無料のチミジン培地で細胞を 2 回、リンスし、ステップ 1.1 のように 9 h 2 mL チミジン無料文化メディアでセルを孵化させなさい。
- 2.5 mM チミジンの最終濃度に細胞培養媒体にチミジン 27.5 ミリメートル (培地で解散) 原液 200 μ L を追加します。別 15 h リンスのステップ 3.1.1 のように細胞をインキュベートし、チミジン無料文化メディア 4 〜 6 時間で細胞を孵化させなさい (セクション 4) DNA 損傷を誘発します。
- 細胞周期のマーカーを使用して同期効率を確認 (サイクリン A2 と B1 S/G2 および G2 のそれぞれ)、S/G2 フェーズに固有 DNA 損傷修復要因 (例えば、Rad51 またはコヒーシン)、IdU/エドゥ (S 期細胞) の定款51。
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G1 位相同期
- シード 6 8 104 HeLa 細胞グリッド coverslip (ステップ 2.1) と 35 mm ディッシュ x。
- 2 日後、少し持ち上げたと円形、倒立顕微鏡対物レンズ 10 倍と 10 倍の眼レンズを使用しての下で中期細胞を識別します。中期のセル、グリッド上の位置を記録する画像を取得します。
- 3-4 時間後 (G1 期) の 2 つの娘細胞に細胞分裂を確認し、DNA 損傷 (セクション 4) を誘発します。
4. レーザーの滴定入力電力
注: このプロトコルでは、我々 は誘導、780 を用いた DNA 損傷 nm パルス共焦点顕微鏡や、800 に接続された fs 近赤外レーザー システム nm パルス反転エピ蛍光顕微鏡と結合した fs 近赤外レーザー。入力電力測定の基本原理は両方、または、NIR システム32,57 に該当する入力電力 (試料にレーザーの焦点で実際照度) 匹敵する DDR を誘発するために必要なこれらのシステムで異なるが、.2 つのレーザー システムの焦点ポイントにレーザー パルスとピーク照度あたりその場でエネルギー 5.33 × 10-2-4 × 10-1の範囲内であったニュージャージー州と10-5.24 × 10 × 10 711 W/cm2、それぞれ32。
- 近赤外レーザーをオンにし、レーザー システムを使用する前に 1 時間のウォーム アップ。
- 温水 (37 ° C) ステージ上により、CO2 (5%) と湿度 (100%) 制御チャンバーに細胞の皿を配置します。
注: CO2室が利用できない場合使用して CO2-5-6 h までの独立した文化メディア。加熱ステージを使用できない場合 < 20 分顕微鏡下で細胞を維持し、適切な温度、CO2、湿度制御と組織文化のインキュベーターに交換するすぐに。これらの培養条件を導出 (例えば、両生類と哺乳類) の生物だけでなく、使用する特定のセル型によって異なります。 - 生細胞蛍光付けられた蛋白質の分析のため GFP フィルター (450-490 nm 励起、515-586 nm 発光) またはフィルターを選択 Cy3 (540-552 nm 励起、> 590 nm 発光) GFP または mCherry 融合タンパク質、それぞれ、100 X または 63 X オイルの液浸を使用して目的。
- 蛋白質の表現の対等なレベルを反映して、匹敵する蛍光信号を持つセルを検索します。蛍光測定の細胞間の可変性を減らすためには弱すぎるか強すぎる式を持つセルを避けてください。
-
レーザー入力電力を滴定しなさい。
- 780 nm 近赤外レーザー共焦点顕微鏡に接続されています。
- 石油目的を介して単一レーザー スキャン (解像度 512 × 512 ピクセル、ズーム X1、漂白地域 50 x 4 ピクセル、12.8 μ s 画素の滞留時間、反復 x1) への露出の細胞核内の線形トラックをターゲットにソフトウェア漂白剤関数を使用 (100 X 1.3/NA)。
- その他の設定を変更することがなく (製造元によってレーザー顕微鏡システムに組み込まれているソフトウェア/ハードウェアを使用して) レーザー伝送割合を 5% に調整しています。
- フィールドの中央にセルを配置します。Roi ツールの領域をクリックしてマウスを使用して核に線やボックス (約 50 × 4 ピクセル) を描くし、DNA 損傷を誘発する「ブリーチ」ボタンをクリックして。
注: その後照射の手順で「漂白」増やすべきである 40% に 5% ずつ増加または必要な場合 100% にアップ。 - エピ蛍光顕微鏡に接続されている 800 nm の近赤外レーザー
- を介して入力電力を制御、(63 × 1.4/NA) 位相コントラスト油浸対物レンズ偏光フィルターのモーターの回転によってビーム光路に導入され、コンピューター制御の電動回転ステージ32,39にマウントされています。,58。
- 偏光板の角度 (°) を調整し、顕微鏡、レーザー パワー メーターを入力入力電力 (mW) を測定します。入力力 5-10 mW 刻みで 20 mW 155 mW の範囲を提供する偏光板の角度を決定します。
- 20 mW の入力電源に対応する偏光板の角度を設定します。
注: レーザー システム、偏光板の角度が 40 ° の場合入力電力は 65 mW。5-10 mW 単位で入力の力を高めます。
- 780 nm 近赤外レーザー共焦点顕微鏡に接続されています。
- 生細胞解析、6.1 と 6.3 の手順に進みます。内因性のタンパク質または変更の蛍光検出のためセクション 5 に進みます。分析の後に、さらにレーザー パワーの滴定の 4.7 手順に進みます。上流因子要件を分析し、セクション 7 に移動します。
注: ビット誤り率および NHEJ 要因の募集です (数分以内) ラピッドと一時的な (< ~ 30 分-1 h 因子と < ~ 4 h のポストによって損傷誘導、それぞれ)。対照的に、人事要因 Rad51 とコヒーシンの募集は 30 分程度、1 h で検出と修復されていない DNA 病変44,50,518 h 以上を保持する傾向があります。したがって、ポイントは異なる修理要因のための照射、後別の時間を調べる必要があります。 - 4.4、ステップのように必要な単位 (すなわち、780 の近赤外レーザーの 5% と 800 NIR の 5-10 mW) 入力電力の増加し、細胞のしきい値 (損傷した細胞を募集の 50%) とピークのセルに表示する (100% 決定への新しいセットで 4.5 4.7 手順を繰り返します募集) 各蛋白質のため。
5. 蛍光抗体染色
注: パー (複雑な損傷マーカー) と H2AX リン酸化 (γH2AX) など、共有結合タンパク質修飾の検出のため (DSB マーカー)、シクロブタン ピリミジン二量体だけでなく、(CPD)/(6-4) 光生成物 (6-4 pp) と 8-オキソグアニン (oxoG-8) (架橋と基本ダメージ マーカー、それぞれ)、細胞を固定、特異抗体で染色する必要があります。さらに、組換えの融合蛋白質の過剰発現によって誘導される成果物を区別するために、内因性のタンパク質の抗体の検出によって蛍光タグ組換えタンパク質により得られた結果を確認することをお勧めします。
- 要因によって損傷誘導 (ステップ 4.5) 後室温 10 分 4% パラホルムアルデヒド/1 × PBS の 1.5 ml (手順 1.1 参照) 文化メディアを置き換えることによって異なる時点でセルを修正します。
注意: パラホルムアルデヒド煙は有毒と換気ヒューム フードのすべての作業を行う必要があります。 - 4% パラホルムアルデヒド/PBS を削除し、室温 0.5% 洗剤/PBS で 10 分間の 1 つの mL を追加
- 2 回、5 分の 2 mL の PBS と 0.5% 洗剤/PBS とリンス細胞を除去し、2 mL の解決を妨げるに細胞を孵化させなさい (10% 血清、1 %bsa/PBS) 室温 1 時間
- ブロッキング液を削除、セルに 2 mL の PBS を追加し、3% の 250 μ L 一次抗体溶液で PBS を置き換える BSA/PBS 一晩 4 ° C またはルート使用で 1 時間で、1: 200-1: 500 希釈 (典型的な濃度約 1 μ G/ml、経験的に決め) 抗体特定の異なる DNA 損傷マーカー (例えばγH2AX/53BP1 (DSB);区 (DSB、NHEJ);Rad51/コヒーシン (DSB、HR);CPD 6-4 pp (架橋損傷);8-oxoG/DNA glycosylases (例えばNTH1) (基本ダメージ)。パー (複雑な損傷、高用量))。
- 抗体溶液を削除、2 回削除 PBS の 5 分の 2 mL の PBS ですすいでくださいし、3% の 250 μ L 0.1% 二次抗体とインキュベート BSA/PBS 室温暗闇の中で 1 時間
- 二次抗体溶液を削除そして 5 分の 2 mL の PBS を 2 回追加し、手順 6.1 と 6.2 の投射のための 4 ° C で 1.5-2 mL PBS で細胞を保ちます。
6 Immunostained または生きているセルの定量的蛍光分析
- ステンド グラスまたは生きているセルの画像をキャプチャ (n > 10) 照射用顕微鏡を使用しています。エピ蛍光顕微鏡システム 1,344 x 1,024 ピクセルの解像度を使用し、TIFF 16 ビット ファイルとして画像を保存します。共焦点の顕微鏡を使用して 1 倍の倍率。GFP/FITC、Cy3/mCherry; 594 HeNe レーザーのアルゴン レーザー512 x 512 または 1,024 x 1,024 ピクセル画像解像度;スキャン速度 5、数: クイック スキャンまたは 2 + 信号対雑音比を改善するために複数のスキャンの平均のための 1。
-
プログラム設計ピクセル強度を測定する画像解析を使用します。
- ボリューム四角形ツールを使用して、個々 のセルのイメージの損傷部位の周りの投資収益率を描きます。同じサイズで、隣接の核質が被害サイトと重複していないバック グラウンド蛍光信号を測定する投資収益率を使用します。これは、退色非共焦点顕微鏡システムに関連付けられている正規化の重要です。
- 画像解析プログラムを用いた蛍光信号を測定するには、ツール ボックスで見つかった「ボリューム分析レポート」をクリックします。新しいウィンドウが表示されます。「データを表示」] セクションで、[「名前」と「密度」のボックスのみをチェックします。計測を可視化する「完了」をクリックします。
- エクスポート先のフィールド区切り文字と"File"のボリューム レポート ウィンドウと選択」タブ (excel 形式)」の下部にある表のアイコンをクリックして値をスプレッドシート プログラムにエクスポートします。
- 相対的な信号を得るためには、スプレッド シート プログラムによる被害サイト (列 1) に蛍光強度を分割するコントロールの核質内 (2 列) の領域をバック グラウンドし、正規化に 1 減算を使用します。
-
共焦点顕微鏡を用いたリアルタイム定量的蛍光経時的検討
- 4.3 ステップのように顕微鏡を用いた蛍光タグ蛋白の陽性細胞を識別します。
- セクション 4 でタイムラプス蛍光イメージング損傷前に、と異なる時点で損傷誘導後を実行します。まず (損傷誘導) の漂白剤の投資収益率を描画し、選択、"取得 > 時系列"サブメニューは 30 として 20 と「サイクル遅延」「数」を設定 s、「最初のスキャン後に一度漂白剤」を選択し、「B を開始」をクリック。この場合、30 秒間隔で 19 のイメージ買収に続いて、損傷誘導の直前に最初の画像を取得します。間隔 (「サイクル遅延」) は、研究の目的に応じて変更できます。
- 画像の取得が完了したら、「意味」をクリックし、被害地域で投資収益率を描きます。選択した Roi 内強度の一覧を取得する「テーブルの表示」をクリックします。損傷の前に同じ領域の強度によって異なる時点で被害サイトの蛍光強度を割ることによって、データを正規化し、1 を引きます。
7. 小さなによる干渉 RNA (siRNA) トランスフェクション
注: ターゲット蛋白質の減少は観察蛋白質採用サイト (セクション 4) 被害に上流因子要件を記述する効果的な方法です。さらに、戦略は蛍光検出用抗体の特異性に対処する最善の方法 (セクション 5 を参照)。
- 1 日目: 6-8 x の各ウェル、コントロール siRNA トランスフェクションおよび化における PARP1 siRNA に 0.5 mL の培地に 104 HeLa 細胞を播くことによって 24 ウェル プレートで HeLa 細胞の 2 の井戸を準備 (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3')。
- 2 日目: セル約 40-50% の合流にあることを確認します。SiRNA トランスフェクションの最初のラウンドを実行する: 無血清培の 25 μ L に希釈 5 pmol siRNA チューブに 3 μ L 脂質ベースのトランスフェクション試薬を追加、優しく、ミックス、右で 5-10 分間インキュベート
- 0.5 mL 新鮮な培地で細胞を一度洗い、(手順 1.1 参照) 0.5 mL 新鮮な培地で細胞を維持します。
- 細胞に RNA リン脂質複合体を追加、前後の皿を傾けることによって軽く混ぜます。ステップ 2.1 のようにインキュベーターにセルを置きます。
- トランスフェクション ミックスを吸引し、6 時間後 0.5 mL の新鮮な文化メディア (手順 1.1) を追加します。
- 3 日目: は、siRNA transfections (手順 7.2 参照) の 2 番目のラウンドを実行します。35 mm グリッド coverslip 皿に 60-100% の細胞が、シード 2.3 の手順で説明するよう。
- 5 日目: は、セクション 4 で定める、関心の要因の最大募集最適なレーザーの電源の状態を使用してレーザー microirradiation を続行します。通常、効率的な枯渇は、HeLa 細胞の約 60-90% で観察できます。
注: 代替と補完的なアプローチ、阻害剤、可能であれば使用できます興味32,44の要因の機能を阻害します。DDR がシグナル伝達を阻害する効果を分析するために 20 μ M の PARP 阻害剤、1 μ M パー glycohydrolase (PARG) 阻害剤または触媒サブユニット (DNA-PKcs) の阻害剤とジメチルスルホキシド (DMSO) で 10 μ M ATM 阻害剤の 10 μ M DNA 依存性プロテインキナーゼを追加、1 時間前損傷誘導からを料理します。コントロールのセルだけに DMSO を追加します。
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Representative Results
EGFP 53BP11220-1711または TRF2 YFP を安定に発現する PtK2 セルを使用して、レーザー入力電力滴定を行った彼らの募集 (図 1)32の最適条件を決定します。
高入力出力レーザー被害サイトで基本ダメージを特異的に認識する GFP NTH1 DNA グリコシラーゼ、CPD (通常紫外線 (UV) 損傷で生成される架橋損傷) の重要なクラスタ リングが観察されました。さらに、鎖切断数の増加を反映しており、この状況で (図 2 a) 複雑な DNA 損傷を誘発する、XRCC1 および CtIP の高信号が観察されました。蛍光タンパク質を融合した他の DNA の glycosylases (例えば、GFP ネイ エンドヌクレアーゼ VIII のような 2 (NEIL2) と GFP-8-オキソグアニン グリコシラーゼ (OGG1)) コンデンシンだけでなく、私も使えます基本ダメージ マーカー44,59として。これに一貫した、我々 が見つかりましたパー応答が高の入力出力レーザー (すなわちエネルギーと供試体の焦点の照度) によって大幅に誘導される弱だけが低いレーザー力によって焦点 (図 2 b、左上)。パーの信号がない化における PARP1 蛋白質局在化被害地点 PARP 阻害剤 (データは示されていない) に敏感だった。また、特定化における PARP1 の siRNA 減少パーと (図 2 b, 右上) 被害現場化における PARP132。入力電力が高い条件下で γH2AX 被害サイトで最初に表示され、(図 2 b下) ATM/DNA PK 依存方法で全体の核に急速に 。Γ 線照射60の報告された γH2AX の同じような ATM/DNA PK 依存広がり。800 と 780 nm 近赤外レーザー システム32と一貫性のある結果が得られました。一緒に取られて、結果を明らかにするレーザー入力電力を滴定することが可能だ (、したがって、エネルギーとセルの焦点スポットの照度) PARP 応答 Dsb の数との相関の程度が異なるを誘発する条件を見つけるため、DNA 損傷の複雑さ。
上記の示唆は当初複雑な DNA 損傷の存在が 53BP1 と TRF2 の差動募集を発生可能性があります。興味深いことに、しかし、53BP11220-1711募集低消費電力被害サイトに効果的に抑制された同じ細胞核 (図 3 a 図 3 b とは対照的に高入力電力による 2 番目の被害サイトの存在によって).53BP1 募集トランスで高入力出力レーザー損傷を抑制することが示唆されました。PARP 阻害剤として (図 3 a) 入力電力が高い被害サイトにもこの募集 ATM/PK DNA 阻害剤復元によって広がる核全体 γH2AX の阻害によるパーの抑制。これは γH2AX の分散によって抑制された主に、したがって、ATM/DNA-PK 阻害剤、(図 3 a下) ない PARP 阻害剤によって復元された損傷のサイトに調停者の DNA 損傷チェックポイント 1 (MDC1) の募集から異なります。重要なは、(γH2AX ステータスを与えずに) PARG 阻害でパーの陰嚢通常 53BP1 を効率的に募集低入力電源の損傷のサイトでも初期 53BP1 募集を効果的に抑制 (図 3 b)32。一緒に取られて、これらの結果はそのパーのシグナル伝達と損傷自体の型ではなくを示す、53BP132の募集と干渉します。これは、複数損傷のサイトに影響を与えるし、互いに相互作用を確認することができますレーザー microirradiation の多様性の例です。
図 1: レーザーの滴定入力電力。今後の実験に使用するレーザーの出力を決定する EGFP 53BP1 と TRF2 YFP を安定に発現する PtK2 細胞 20 まで入力の力を持つ microirradiation をレーザー受けた mW と 155 mW 800 nm 近赤外レーザー/反転エピ - 蛍光顕微鏡システムです。TRF2 YFP セル後 6 分探偵の中に 15 分ポスト照射 (探偵)、監視された EGFP 53BP1 募集バーの上に直接番号のセルの合計数にわたって被害サイトに EGFP 53BP1 や TRF2 YFP の肯定的な募集を示した細胞の数を表しています。この図は、Saquilabon クルス32から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 複雑な損傷と堅牢な DDR は、高入力出力レーザーでのシグナルの誘導します。(A) 高入力出力レーザー microirradiation (SSBs と Dsb) 鎖の切断、架橋、基本ダメージなど複雑な損傷を誘発します。CPD、XRCC1 (SSB と DSB の修復)、NTH1 DNA グリコシラーゼ (BER) と CtIP (代替 NHEJ と HR) が表示されます (唯一の GFP NTH1 は生きているセルのイメージと残りの部分が次の免疫蛍光染色観察される)。被害サイト募集の定量的蛍光強度測定プロトコルのセクション 7 に記載されているように行われ、ひげに表示されます。セル (n) テストの合計数は、定量化された蛋白質ごとの下で見ることができます。p-値 < 0.05。(B) 上部 (左): 高入力電源の損傷のサイトで堅牢なパーと化における PARP1 信号。(右) 上: 化における PARP1 siRNA 枯渇はパー信号32,44を廃止するだけで十分です。下: 示されているように、低 (上) と (下) 高細胞における γH2AX の時間コース解析入力電源の損傷です。スケール バー = 10 μ m。この図は、Saquilabon クルス32から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: DDR のシグナリングの活性に影響を与える 53BP1 募集サイト被害に。(A) 上部: 安定低 (15%)、高 (25%) の両方で microirradiated をされた EGFP 53BP11220-1711に発現する PtK2 セル入力電力 (白し、黄色の矢印、それぞれ) 780 nm 近赤外/共焦点顕微鏡システムを使用して同じ核。これを DMSO、PARP の存在下で行った阻害薬 (Pi)、または ATM の組み合わせ DNA PK と PARP 阻害剤 (Ai + ディ + Pi) 示される。EGFP 53BP11220-1711の住セルイメージ投射は、DSB 誘導後 30 分で捕獲されました。セルが固定し、DSB マーカーとしての γH2AX の特定抗体で染色します。EGFP 53BP11220-1711被害サイトでの蛍光強度の変化は、 pの右に表示されます-値 (値の意味: DMSO、0.03 ± 0.02。Pi、0.34 ± 0.19;Ai + ディ + Pi、0.98 ± 0.23)。下: として示された高入力電源の損傷と MDC1 ローカリゼーションに対する Pi と Ai + Di の治療の効果。スケール バーは、10 μ m です。右: pと DMSO、Pi、または Ai + Di の存在下でサイト被害をハイパワー入力時 MDC1 の蛍光信号の変化-値 (値の意味: DMSO、0.07 ± 0.10;Pi、0.05 ± 0.07;Ai + Di、0.86 ± 0.26)。スケール バー = 10 μ m. N = 強度測定ごとに 10。(B) パーの強化の効果は、低入力電源の損傷のサイトに内因性 53BP1 募集 PARGi 処理による信号します。右: 低入力出力レーザーと内因性 53BP1 募集 (蛍光抗体法によって検出される) の定量分析を表すひげ (60 mW 800 nm 近赤外レーザー/反転エピ蛍光顕微鏡システムの) 照射の記事 15 分でDMSO または PARGi 示される。左: パー、53BP1 蛍光染色 DMSO や PARGi で同じ条件の下で破損している細胞の写真。細胞の 100 %dmso 処理の検討 (N = 25) 堅牢な 53BP1 募集 (右) を展示します。対照的に、20/25 PARGi (右下) の存在下でない 53BP1 募集と弱い募集を示した 5 細胞を示した。スケール バー = 10 μ m。この図は、Saquilabon クルス32から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
DDR 研究レーザー microirradiation を使用する利点は次のとおりです。
1 種類を誘導することは不可能で、複雑な DNA の損傷に単純な鎖から量の DNA の損傷を検出する DNA リペア要因はレーザー照射パラメーターを調整することによってサイトを損傷します。また、(図 3) のようにトランス効果を評価するために同じ細胞核内で複数回のダメージを与えることが可能です。
2. 重要なことは、事象被害サイトと核の場所で発生する二次イベントは簡単に区別できます。
3. 蛍光タグ付きタンパク質の動態を含む、単一細胞レベルで損傷に応答の高解像度のリアルタイム計測を行うことに限定されない: 蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)、蛍光寿命イメージング (FLIM) ペア相関関数 (pCF)など、生きた細胞で DDR をキャプチャします。
4。RNA 干渉または阻害剤治療と組み合わせることで、比較的少数の細胞で上流因子要件をテストする簡単です。
5. それする必要がありますその NIR (または緑) を指摘した DNA のヌクレオチド類似体前感作を必要としないレーザー放射または DNA 間をインターカ レート染料、避けるため望ましくない副作用 chromatin のパッキングに。これは、低用量で感作を必要とし、高線量39,49,61で異常な DDR を引き起こす紫外線レーザー システムとは対照的です。
プロトコル/変更内の重要な手順とトラブルシューティング
DDR 解析を成果物と実験的変動を最小限にするために実行するとセルが健康な状態になっていることが重要です。DNA や siRNA トランスフェクション細胞通常より敏感なまたは簡単にデタッチされたグリッド coverslip の成長します。それは、トランスフェクションが動作する限り、トランスフェクション試薬の時間短縮のため細胞を維持し、シードより transfected セル融合細胞と比較してグリッド coverslip 料理に役立ちます。これは、実験のための匹敵するセル合流を達成するために必要です。
それは、チミジン ブロックが DDR に影響可能性があります結果を歪曲する同期セル62γH2AX の増加されたレベルをもたらすことが報告されています。さらに、ベース ライン γH2AX 信号はなくても、外因性損傷63,64S と G2/M の段階で高いことが示されました。、我々 はしかし、に影響を与えるまたはセルのレーザ誘起損傷のサイトで特定の γH2AX 応答を妨げる核質の任意の重要な γH2AX 信号同期 S/G2 段階で二重チミジン ブロック51従わない。
一貫性のある結果を得るためにレーザー システム出力パラメーター (2 〜 4 週間毎) と光配向 (2 ヶ月) を定期的にチェックする必要が。時間をかけてレーザー システム コンポーネントを再配置する必要がありますし、対物レンズが壊れているし、交換する必要があり、合計入力電力の安定性を変更することがあります。キーは損傷 (架橋 (CPD や 6-4 pp) と基本ダメージ (8 oxoG))、マーカー蛋白質 (例えば、DNA glycosylases、Rad51、コヒーシン、および区)、および投与量を決定するこのプロトコルで記述されている額面変更の存在を評価して使用しているレーザ顕微鏡システムによる DNA 損傷の複雑さ。
技術の限界
レーザーの microirradiation には、制限があります。レーザー光による DNA 損傷は自然発生すると比較して核の 1 つの領域でクラスター化されている核全体に広がる可能性があります損傷。これは損傷のシグナル伝達は近隣のクロマチン、核に伝達されますを変更できます。細胞の比較的低い数字を一度に照射できるので、人口に基づく生化学的アッセイ (例えば、西部のしみ、蛋白質の複雑な浄化、クロマチン免疫沈降 (チップ)) を簡単に実行できません。蛍光付けられた蛋白質への依存 (式の外因性の組換えタンパク質またはそれらでさえも上表現内生 CRISPR 媒介のタグの挿入を使用して) 動的イメージング研究を融合誘起タンパク質に対して脆弱になりますの成果物。レーザ誘起損傷のユニークな性質との潜在的な人工効果付けられた蛋白質、したがって、従来の DNA がダメージを与える方法 (IR 剤を有害な化学物質) を使用する結果との比較と、内因性に評価される必要があります。タグなしタンパク質 (しかし時々 じゃない完全な並列実験を行うことが可能)。
既存のメソッドの意義
から、アッシジ、FokI - SceI などシーケンス固有の酵素の使用は、サイト固有の Dsb (厳密に単純な Dsb) を誘導するための代替戦略を提供します。係数採用または変更は、サイト固有またはゲノム チップ解析65,66,67,68,69で分析できます。Dsb の比較的同期誘導可能であるステロイド ホルモン受容体との急速な核転座と劣化、それぞれ65,66劣化信号 (degron) エンドヌクレアーゼをタグ付け,67,68,69。 1 つ考慮に入れなければならない、ただし、するエンドヌクレアーゼ式と、ターゲット サイトのアクセシビリティの効率と継続的な修理状態が異なるセルに異なるターゲット ・ サイトでの変数をすることができます。これらの不均一平均が人口ベース チップ解析結果が偏る可能性があるになります。レーザー microirradiation は、他の一方で、空間分解能 (サブミクロン) 損傷応答ダイナミクスは、単一細胞レベルで分析することができますだけでなく、最高の可能な一時的な決断 (ミリ秒) をご利用いただけます。ただし、高ダメージを与える密度結果に影響可能性があります。両方の戦略は、アクセシビリティ抗体やペプチドのタグ付けによって引き起こされる人工物に敏感にすることができます。したがって、相互に補完される可能性があります可能性があります両方の戦略の賛否両論を理解することが重要です。
将来のアプリケーション
蛍光イメージングとダイナミクス技術の急速な進歩とともにさまざまな量と種類の特定の場所や細胞周期の段階で DNA 損傷を誘発するレーザー システムの汎用性は細胞を調査する貴重な機会を提供していて、dna 分子応答の単一セルのレベルの高時空間解像度の被害します。できるようになる、例えば、サイト固有のダメージを引き出すし、核と細胞全体の DDR 信号ミリ秒解像度を持つ伝達 (例えば、分子間相互作用や損傷のサイトで排他的に発生する変更を調べる検出クロマチン構造の動的変更リアルタイム被害全体の核被害サイトからシグナル伝達のリアルタイム広がりを観察または)。また、細胞の運命に DNA 損傷の影響を検討する時間の長い期間同じセルに従うことです。我々 は、レーザー microirradiation メソッドは、適切に使用される場合は、DNA 修復分野の発展に大きく寄与する継続を思い描いています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
NTH1 GFP 発現プラスミドの東北大学、日本で博士明安井と TRF2 YFP と EGFP 53BP11220-1711発現プラスミドのラホーヤ、カリフォルニア州スクリップス研究所で博士エロス サヴィ電池に感謝しますこの作品は、空軍科学研究局 (FA9550-04-1-0101) と (M.W.B) にベックマン レーザー研究所株式会社財団、フォード財団フェローシップ CRCC と NSF MCB 1615701 (B.A.S) に科学の国民アカデミーから支えられ(K. Y.) に 426665 CRR 17
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 | Coherent Inc. | Mira 900 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | |
| 63X/1.4 NA objective | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
| Compact Rotation Stage | Newport Corp | PR50PP | |
| Temperature Controller | Warner | TC-344B | |
| Heating System | Ibidi | 10918 | |
| Gas Incubation System | Ibidi | 11920 | |
| Laser Power and Energy Meter (RoHS) | Coherent | FieldMaxII-TOP | |
| ORCA-R2 Digital CCD Camera | Hamamatsu | C10600 | |
| LSM 510 META Laser Scanning Microscopes | Carl Zeiss | ||
| 100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
| 35mm Gridded Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
| PtK2 kidney epithelial cells | ATCC | CCL 56 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| DMEM | Life Technologies | 11885-092 | |
| CO2-Independent Medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| Advanced MEM | Life Technologies | 12492-013 | supplemented with L-Glutamine, 4% FBS |
| penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | 15140122 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Thymidine | SIGMA | T9250 | |
| serum free media (Opti-MEM I Reduced Serum Media) | Fisher Scientific | 11058021 | |
| Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) | Kamiya Biomedical Company | MC-062 | |
| Anti-XRCC1 (mouse ) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
| Anti-53BP1 (rabbit) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
| Anti-CtIP (rabbit) | Abcam | ab70163 | |
| Anti-PAR polymers (mouse) | Enzo Life Sciences | BML-SA216-0100 | |
| Anti-PAR (rabbit) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
| Anti-TRF2 (mouse) | Novus Biological | NB100-56506 | |
| Anti 6-4PP (mouse) | Kamiya Biomedical | ||
| Anti-Rad21 (Rabbit) (for cohesin detection) | generated in Yokomori (KY) lab | ||
| Anti-Rad51 (Rabbit) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8349 | |
| Anti-Ku70 (mouse) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
| 8-oxiguanine | Trevigen, Inc. | ||
| Anti-PARP1 (Rabbit) | generated in KY lab | ref 43 | |
| Anti-hCAPG (Rabbit) (for condensin detection) | generated in KY lab | ref 42 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
| Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
| HiPerFect siRNA Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| GFP-SMC1 stable cell line | generated in KY lab | ref 49 | |
| GFP-NEIL2 stable cell line | generated in KY lab | ref 54 | |
| GFP-NTH1 stable cell line | generated in KY lab | ref 32 | |
| GFP-SMC1 plasmid | generated in KY lab | ||
| GFP-Ku plasmid | generated in KY lab | ||
| Anti-MDC1 (rabbit) | Novus Biologicals | NB100–395 | |
| Anti-gH2AX (rabbit) | Millipore | 07–164 | |
| EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| TRF2-YFP PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
| PARG inhibitor | Trevigen | 4680-096-03 | |
| DNA–PKcs inhibitor NU7026 | Sigma | N1537 | |
| ATM inhibitor KU55933 | Calbiochem | 118500 | |
| Olaparib | Apexbio Technology | A4154 | |
| Paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
| Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | image analysis program |
| Excel | microsoft | spreadsheet program | |
| Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium | Fisher Scientific | 14200166 | dilute to 1X |
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