Summary
이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .
Abstract
DNA 손상 유도 게놈 무결성의 보호에 대 한 중요 한 셀에 특정 신호 및 복구 응답 합니다. 레이저 microirradiation 귀중 한 실험 도구는 DNA 손상 응답 (DDR) vivo에서조사 되었다. 레이저 유도 손상 세포 핵에 있는 submicrometer 지역에 대 한 응답에서 고분자 역학의 실시간 고해상도 단일 세포 분석을 수 있습니다. 그러나, 다양 한 레이저 조건 유도 된 손상의 종류에 있는 다름의 감사 없이 사용 되었습니다. 그 결과, 피해의 특성은 종종 잘 특징 또는 제어, 채용 또는 수정 프로필에 명백한 불일치를 일으키는. 우리는 다른 방사선 조건 (즉, 다른 파장으로 펨 (fs) 근처-적외선 (NIR) 레이저의 다른 입력된 파워 (irradiances)) 고유 DDR 및 복구 단백질 어셈블리 유도 시연 했다. 이 생산 하는 DNA 손상의 종류를 반영 한다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 레이저 입력된 전력의 적정 수 다른 금액의 유도 및 자료 및 가교 손해, 신호 처리, 차동 폴 리 (ADP-ribose) (파)의 탐지에 의해 쉽게 모니터링할 수 있습니다, DNA 손상의 복잡 하 고 피해 사이트에서 경로 특정 복구 요소 어셈블리입니다. 손상을 조건 결정, 일단 관심의 어떤 요소에 업스트림 factor(s)의 고갈 뿐만 아니라 다른 손상 복잡성과 차동 손상 신호 전달의 효과 조사 가능 하다.
Introduction
Vivo에서 DNA 손상 신호는 잘 이해 되지
Vivo에서, DNA는 히스톤과 양식 chromatin 섬유에 다른 요인 complexed. Chromatin 구조의 규정은 DNA 물질 대사에 대 한 파라마운트의 중요성입니다. 예를 들어 히스톤 변형 H2AX 증-오점이 돌연변이 (ATM)와 다음 이중 가닥 (DSB) 유도, 휴식과 DSB 손상 신호 증폭으로 다른 도킹 사이트를 제공 하는 것이 중요 하다 다른 kinases phosphorylated은 요인입니다. 손상 신호 및 복구 통로 선택의 확산 비판적으로 피해 사이트1에서 로컬 chromatin 구조에 의해 영향을 받을 것으로 보인다. 다양 한 요인, 히스톤 보호자 및 히스톤 수정 효소를 개장 하는 chromatin 실제로 사이트 손상 모집 DDR에서 chromatin 규제의 중요성을 강조 하는 효율적인 DNA 수리를 위해 중요 한 및 복구2 , 3 , 4. 또한, 피해 사이트 클러스터링 또는 재배치 효 모와 초파리5,6,7,8, relocalization에 유전자 loci의 연상에서 관찰 되었다는 subnuclear 구획 연관 유전자 규칙9,10. 마우스와 인간 세포에 있는 최근 연구는 또한 DSB 사이트, 어느 영향 복구 충실도 및 통로 선택11,12의 동원을 공개 했다. 이 DDR/수리도 연결 될 수 있습니다 속속들이 핵 건축, 더 높은 순서 chromatin 조직과 염색체를 세포 핵에 역학 가능성 제기. 따라서, DDR을 연구 하 고 DNA 손상의 단기 및 장기 결과 이해 하기 위해서는 살아있는 세포에서 핵 생 환경에 프로세스를 복구 고해상도 방법을 개발 하기 위해 중요 하다.
파 중 합 효소 (PARP) 손상의 유형과 정도 측정 하 고 규제 피해 사이트에 단백질 조립에의 중요 한 역할
PARP1는 DNA 수리13에서 중요 한 역할을 담당 하는 DNA 손상에 의해 빠르게 활성화 DNA 닉 센서입니다. PARP1 원래 x 선 수리 크로스 보완 1 (XRCC1) 기본 절단 수 선 (BER)를 촉진 하기 위하여 함께 작동 생각 하지만 최근 연구 결과 공개 DSB 수리14를 포함 하 여 다른 DNA 복구 경로에서 역할. 자신을 포함 한 여러 대상 단백질, ADP ribosylate는 기판으로 PARP1 사용 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+)을 활성화. 이 효소와 다른 가족 구성원 있다 관심을 끌었다 많은 최근 몇 년 동안에서 PARP 억제제는 암에 대 한 유망 치료 약물 등장 했습니다. PARP 억제제 처음 유 방 암 유전자 (BRCA)에 효과가 있어야 발견 했다 비록-유 방 암 세포를 돌연변이 지금 에이전트/조사에 대 한 손상 DNA와 함께 모노-및 조합 치료에 그들의 효과 대 한 증거의 과다 한입니다 BRCA15,,1617,18,19,20을 돌연변이와 암의 광범위 한 스펙트럼.
분자 수준에서 PARP 활성화 조직 손상 사이트에서 로컬 chromatin 구조에 중요 한 역할을 표시 했다. Chromatin 변경 효소의 파 종속 모집 DSB 수리를 용이 하 게 하 고 지시 복구 경로 선택, 파 수정 피해 사이트에서의 중요 한 발판 역할을 제안 합니다. 13,21,22,23,,2425,26,27,28,29, 30,31 우리는 최근 손상에서 p53 바인딩 단백질 1 (53BP1)의 배제를 시연 파 32, 비 동종 endjoining (53BP1-종속 hyperactivation에 대 한 대체 설명을 제공 하 여 사이트 NHEJ) 의해 PARP 억제제 및 DSB에 PARP의 중요성을 강조 복구 통로 선택33,34. PARP1 또한 PARylates 및 활동의 여러 DNA 복구 직접 요인14.
DDR/수리에서 Vivo에서 공부 하는 도구로 서 레이저 Microirradiation를 사용 하 여
개별 염색체에 서브 미크론 변경 생산 레이저 microirradiation 196935 에 설명 된 처음 이었고 198136에 자세히 검토. 몇 십년 후, 레이저 microirradiation 세포 핵에 정의 된 submicrometer 지역에서 DNA 손상 유도 표시 했다 고 모집 또는 수정 다양 한 요인의 DNA 병 변 비보 를 연구 하는 귀중 한 기술 입증 되었다 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41.이 메서드는 손상 사이트39,42에서 뚜렷한 방사선-유도 포커스 (IRIF)를 형성 하지 않습니다 그 요인의 탐지를 수 있습니다. 그것은 또한 손상 사이트에서 고 핵의 나머지에서 chromatin 구조 변화 spatiotemporal 역학 검사 가능. 우리는 신중 하 게 다른 레이저 시스템에 의해 유도 된 Ddr에 비해 DNA 손상의 유형 및 microirradiation 조건32,,4344, 사이의 관계를 평가 하는 능력을 입력 하 고 45. 53BP1 및 telomeric 탈 채용 패턴 반복 바인딩 요소 2 (TRF2) 레이저 유도 손상46의 "비 생리" 자연에 대 한 되풀이 우려에 대 한 기초를 제공 하는 이전 레이저 손상 연구에서 관찰 되었다 ,47,,4849. 우리는 양과 복잡성 유발된 손상32의 계기 신호 이러한 명백한 불일치 이제 차동 PARP에 의해 설명 될 수 있는 발견. 우리 확인: 1) (높은 입력 전력 조사) 후에 레이저 microirradiated 세포 손상 검사점 제어 종속 방식에서 interphase에 체포와 유지 가능한 (적어도 48 h까지)32,50; 그리고 2) 수리 계수 모집/수정 충실 하 게 그 endonucleases32,,3942에 의해 기존의 DNA 파괴적인 대리인을 가진 처리와 DSB 유도 관찰 정리 44,50,,5152. 이러한 결과 강하게 레이저 손상 유발 세포 응답의 생리 적인 관련성을 지원 합니다.
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Protocol
1. 기본 셀 준비
참고:이 단계는 생 단백질 모집 또는 수정, 표준 면역 형광 감지 하 고 안정적으로 붙일 태그가 재조합 단백질을 표현 하는 셀 라인의 사용에 대 한. 예를 들어 Potorustridactylus (PtK2) 주머니 신장 상피 세포 이전에 사용 되었다 안정적 EGFP 53BP11220-1711 또는 TRF2 YFP 표현 연구 (그림 1)32. 전자의 경우, 53BP1의 지역 형성 하는 초점 (아미노산 1220-1711)를 포함 하는 oligomerization 도메인, 튜더 도메인 및 ubiquitylation 종속 모집 (UDR) 주제, 향상 된 GFP (EGFP 53BP11220-1711)를 융합 했다. 이 융해 단백질이 전체 길이 53BP153,,5455의 피해 사이트 모집. HeLa 세포에서 cohesin (예를 들어, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52, 그리고 GFP SA2 51)의 붙일 태그가 subunits 표현 해야 합니다 안정적으로 복잡 한에 효율적인 통합을 보장 하 고 정리 S/g 2 세포 주기 단계 관련 피해 사이트의 채용 생 cohesin51.
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개별 셀 식별을 위해 허용을 gridded coverslip로 35mm 조직 문화 접시에 모든 부착 셀 형식을 씨앗합니다 36-48 h에 대 한 특정 셀 라인의 확산 속도에 60 %confluency 달성 하기 위해 초기 셀 수를 조정 합니다. 예를 들어:
- PtK2 유대류 신장 상피 세포 (야생 타입 또는 그 EGFP 53BP11220-1711 또는 TRF2 YFP 안정적으로 표현)에 대 한: 2 m L-글루타민, 4% 태아 소 접시 2.0 x 104 셀 2 mL에 고급 최소 필수 매체 (MEM) 보완 혈 청 (FBS), 그리고 항생제 (100 U/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스), 및 7% CO2와 37 ° C에서 품 어.
- 헬러에 놓여있는지 표현 안정적으로 세포 재조합 단백질 GFP SA2 태그: 씨앗 1.0 x 105 2 mL에 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)과 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충 그리고 5% CO2와 37 ° C에서 품 어. 다른 HeLa 세포도 수정 되지 않은 셀 또는 hSMC1 GFP를 표현 하는 셀을 포함 하 여 사용할 수 있습니다.
- 준수 하 고 30-60% 합류 (허용 하는 격자 수의 시각화)에서 DNA 손상 유도 전에 36-48 h에 대 한 증식 하는 세포를 허용 한다. 섹션 4로 이동 합니다.
2. 과도 Transfection
참고: 때로는 좋은 항 체 생 단백질을 감지할 수 있습니다. 셀 라인 마커 단백질을 표현 안정적으로 사용할 수 없는 경우, 과도 transfections 붙일 레이블된 단백질 살아있는 세포 분석을 위한 모니터링을 실시 합니다.
- 헬러 세포, 하루에 1, 6-8 x 104 셀에 24-잘 접시의 한 잘 0.5 mL 문화 미디어에 씨앗 및 5% CO2와 37 ° C에서 100% 습도 인큐베이터에서 품 어. 1.1 배양 조건에 대 한 단계를 참조 하십시오.
- 주 2, 포유류 식 플라스 미드 인코딩 붙일 태그가 DNA 복구를 사용 하 여 요소 (예를 들어, GFP-NTH1 또는 기본 피해32,44,56, 높은 복용량 DSBs57, GFP-53BP1 GFP 구 GFP-OGG1 32 비교적 간단한 DSBs 또는 형광 태그를 융합 하는 관심사의 다른 단백질에 대 한) DNA transfection liposome 중재 수행 하. 0.3 µ g 플라스 미드 DNA 1.5 mL 튜브에 혈 청 자유로운 문화 매체의 25 µ L로 희석.
- 또 다른 1.5 mL 튜브에 혈 청 자유로운 문화 매체의 25 µ L로 1 µ L liposome 기반 DNA transfection 시 약을 희석 하 고 부드럽게 혼합 합니다.
- 부드럽게, 희석된 DNA와 transfection 에이전트를 혼합 하 고 양식 DNA 지질 단지를 실 온 (RT)에서 10 분 동안 품 어.
- 0.5 mL 문화 미디어와 린스 세포는 한 번, 미디어, 제거 하 고 0.5 mL 신선한 문화 미디어 (단계 1.1)에서 세포를 추가.
- 세포 DNA 지질 단지를 추가 합니다. 락 접시 몇 번으로 부드럽게 혼합. 2.1 단계와 마찬가지로 인큐베이터에서 다시 세포를 넣어.
- 후 4-6 h는 세포에서 문화 미디어를 제거 하 고 추가 300 µ L 0.05% 트립 신-EDTA. 그것을 제거, 추가 200 µ L 트립 신-EDTA, 그리고 3-4 분 동안 37 ° C 배양 기에서 품 어.
- 확인 후 세포를 분리, 800 µ L 문화 미디어를 추가 하 고 부드럽게 헤어 셀 덩어리를 pipetting으로 셀을 resuspend. Gridded coverslip로 35mm 문화 접시에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 2 mL의 최종 볼륨을 문화 미디어를 추가 합니다.
- 48 h, 단계 2.1에서 인큐베이터에서 셀을 품 어 다음 섹션 4로 진행 합니다.
참고: 재조합 단백질의 표현식이 독성 (transfected 세포 단계 2.8에서에서 부 화 후 원형 또는 불규칙 한 형태를 표시), 식 시간을 단축 하 고 transfection 만큼 후 레이저 microirradiation (제 4) 16-20 h에 수행은 단백질 표정 확인 될 수 있다 (형광 탐지 단계 4.3 참조). 이 경우에, 35 mm 접시에 직접 transfection를 수행 합니다. 30 헤 Transfect DNA 플라스 미드, 후 약 50-70% 합류를 달성 하 여 미디어 2-6 h 변경할 gridded coverslip로 35 mm 접시에 시드 3.0 x 105 HeLa 세포 transfection 후. 레이저 microirradiation 12-20 h 진행 나중 단백질 표정 합리적 이며 셀 건강 표시 하는 경우.
3. 세포 주기 동기화
참고: 동종 재결합에 대 한 수리 (HR) 단백질, Rad51 등 cohesin, 채용은 세포 주기, 어떤 시간에 수리 소요 장소51의 S/g 2 단계에서 더 유명. 따라서, 이러한 단백질의 신규 모집, 모니터링 S/g 2 단계 셀 동기화 필요 하다.
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S/g 2 단계 동기화
- S/g 2 단계50,51셀 동기화에 대 한 이중 티 미 딘 블록 프로토콜을 사용 합니다. 35 mm gridded coverslip 접시에 셀 시드 후 (단계 1.1 참조), 셀 문화 미디어 (단계 1.1)에서 37 ° C에서 17 h (2.5 m m의 최종 농도)에 티 미 딘 그리고 5% CO2를 품 어.
- 1 mL 티 미 딘 무료 문화 미디어 (1.1 단계)로 셀을 두 번, 헹 구 고 셀 2 mL 티 미 딘 무료 문화 미디어 단계 1.1에서 9 h에에서 품 어.
- 티 미 딘 2.5 m m의 최종 농도에 세포와 배양에 27.5 m m 티 미 딘 재고 솔루션 (문화 미디어에 녹아 있는)의 200 µ L를 추가 합니다. 3.1.1 다른 15 h. 린스에 대 한 단계에서 셀을 품 어 하 고 셀 티 미 딘 무료 4-6 h 문화 미디어에 품 어 DNA 손상 (제 4) 유도.
- 세포 주기 마커를 사용 하 여 동기화 효율성을 확인 ( A2와 B1 S/g 2와 g 2는, 각각), S/g 2 단계-특정 DNA 손상 복구 요인 (예, Rad51 또는 cohesin), 또는 IdU/듀 (S 단계 세포)에 대 한 설립51.
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G 1 단계 동기화
- Gridded coverslip (2.1 단계)와 35mm 문화 접시에 104 HeLa 세포 x 씨 6-8.
- 2 일 후 약간 해제 하 고 10 X 목표와 10 X 눈 렌즈를 사용 하 여 거꾸로 현미경 라운드 모양의 분열 세포를 식별 합니다. Gridded coverslip 분열 셀의 위치를 기록 하는 이미지를 취득 합니다.
- 후 3-4 h (g 1 단계에서), 2 개의 딸 세포로 세포 분열을 확인 하 고 DNA 손상 (제 4) 유도.
4. 레이저의 적정 입력 전원
참고:이 프로토콜에서 우리 유도 780을 사용 하 여 DNA 손상 nm 펄스 fs NIR 레이저 시스템 confocal 현미경, 나는 800 nm 펄스 fs NIR 레이저는 거꾸로 피-형광 현미경을 결합. 입력된 전원 (실제 방사는 시료에 레이저 초점에서) 유사한 DDR을 유도 하는 데 필요한이 시스템에서 다른, 적정 입력된 전원의 기본 원리 이지만 둘 다, 또는, NIR 시스템32,57에 적용 . 두 개의 레이저 시스템에 대 한 초점에서 레이저 펄스와 피크 방사 당 현장에서 에너지 5.33 × 10-2-4 × 10-1 의 범위에서 했다 뉴저지, 7 × 1010-5.24 × 1011 W/c m2를 각각32.
- 적외선 레이저를 켜고 사용 하기 전에 1 시간 워밍업을 레이저 시스템.
- 있도록 CO2 (5%)와 습도 (100%) 제어 챔버에 온수 (37 ° C) 무대에서 셀의 접시를 놓습니다.
참고: CO2 챔버를 사용할 수 없는 경우 사용 하 여 CO2-5-6 h에 대 한 독립적인 문화 미디어. 난방 단계를 사용할 수 없는 경우 < 20 분에 대 한 현미경 세포를 유지 하 고 즉시 적절 한 온도, CO2, 및 습도 제어 조직 문화 인큐베이터로 대체. 이러한 문화 조건 파생 (예를 들어, 양서류와 포유류)의 유기 체 뿐만 아니라 사용 하는 특정 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다. - 붙일 태그가 단백질의 살아있는 세포 분석을 위해 선택 GFP 필터 (450-490 nm 여기, 515-586 nm 방출) 또는 Cy3 필터 (540-552 nm 여기, > 590 nm 방출) GFP 또는 mCherry 융합 단백질, 각각, 100 X 또는 63 X 기름 침수를 사용 하 여 목적입니다.
- 유사한 형광 신호, 단백질 식의 유사한 수준을 반영 하는 셀에 대 한 검색. 형광 측정에 셀 가변성을 감소 시키기 위하여 너무 약하거나 너무 강한 표현 된 셀을 하지 마십시오.
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레이저 입력된 전원 적정
- 780 nm 적외선 레이저 confocal 현미경에 부착 된
- 소프트웨어 표 백제 함수를 사용 하 여 오일 목표 통해 단일 레이저 스캔 (해상도 512 x 512 픽셀, 확대/축소 X1, 표백 지역 50 x 4 픽셀, 12.8 µs 픽셀 유지 시간, 반복 x1)에 대 한 노출 셀 핵 안쪽에 선형 궤도 대상 (100 X / 1.3 없음).
- 다른 설정을 변경 하지 않고 5% (제조 업체에 의해 레이저 현미경 시스템에 내장 된 소프트웨어/하드웨어를 사용 하 여) 레이저 전송 비율을 조정 합니다.
- 셀 분야의 중심에 배치 합니다. 관심 (ROI) 도구의 지역 고 마우스를 사용 하 여 핵에서 선이나 상자 (약 50 x 4 픽셀)을 그릴 고 DNA 손상을 유도 하 "표 백제" 버튼을 클릭 합니다.
참고: 이후 조사 단계에서 "표백" 증가 되어야 한다 40%를 5% 단위로 또는 100% 필요한 경우. - 800 nm 적외선 레이저 피 형광 현미경에 부착 된
- 통해 입력된 전력 제어는 (63 X 1.4 / 없음) 단계 대비 기름 침수 편광 필터의 동력된 회전 하 여 빔 경로에 도입 목적과 컴퓨터 제어 전동된 회전 무대32,39 에 장착 , 58.
- 편광 각도 (°)를 조정 하 고 측정 현미경, 레이저 파워 미터를 사용 하 여 입력 입력된 전력 (mW). 입력된 파워에 5-10 mW 단위로 20 mW-155 mW에서 제공 하는 편광판 각도 결정 합니다.
- 20 mW 입력된 전원에 해당 하는 편광판 각도 설정 합니다.
참고: 우리의 레이저 시스템에 대 한 편광 각도 40 °, 입력된 전원 이면 65 mW. 5-10 mW 단위로 입력된 파워를 증가.
- 780 nm 적외선 레이저 confocal 현미경에 부착 된
- 살아있는 세포 분석을 위한 단계 6.1 및 6.3로 이동 합니다. 면역 형광 검출 생 단백질 또는 수정에 대 한 섹션 5로 진행 합니다. 분석, 후 단계 4.7 레이저 전력의 적정 추가로 이동 합니다. 상위 요소 요구 사항 분석, 섹션 7로 이동 합니다.
참고: BER 및 NHEJ 요인의 채용은 (몇 분) 이내 급속 및 과도 (< ~ 30 분-1 시간 요소와 < ~ 4 h 게시물에 따라 손상 유도, 각각). 대조적으로, HR 요소 Rad51 및 cohesin의 채용 ~ 30 분-1 시간에 감지 이며 그들은 배달 DNA 병 변44,,5051이상 8 h을 유지 하는 경향이 있다. 따라서, 그것은 다른 시간 포인트 게시물 다른 수리 요인에 대 한 조사를 검토 하는 데 필요한입니다. - 단위로 원하는 (즉, 780 NIR 레이저에 대 한 5% 및 800 NIR에 대 한 5-10 mW) 단계 4.4 에서처럼 입력된 파워를 증가 하 고 피크 (100% 셀 표시의 임계값 (손상 된 세포 쇼 채용의 50%)를 결정 하는 세포의 새로운 세트에 4.5 4.7 단계 반복 모집) 각 단백질에 대 한.
5. 면역 형광 염색
참고: 공유 단백질 수정, 파 (복잡 한 손상 마커) H2AX 인 산화 (γH2AX) 등의 검색을 위한 (DSB 표식), cyclobutane pyrimidine 이합체 뿐만 아니라 (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) 및 8-oxoguanine (8-oxoG) (가교 및 베이스 손상 마커, 각각), 셀 고정 되어야 하며 특정 항 체와 스테인드. 또한, 그것은 최고의 태그 붙일 재조합 단백질 재조합 융합 단백질의 overexpression에 의해 유도 된 아티팩트를 구별 하는 생 단백질의 항 체 검출에 의해 얻은 결과 확인 하.
- 4 %paraformaldehyde / 1 X PBS 실시간에 10 분의 1.5 mL (단계 1.1 참조) 문화 미디어 대체 하 여 다른 시간 지점에서 세포 손상 유도 (4.5 단계) 요인에 따라 후 수정
주의: Paraformaldehyde 연기 독성이 고 통풍이 증기 두건에서 모든 작업을 할 수 있습니다. - 4 %paraformaldehyde / PBS를 제거 하 고 실시간에 0.5% 세제/PBS 10 분의 1 mL을 추가
- 두 번, 5 분에 대 한 PBS의 2 mL와 0.5% 세제/PBS와 린스 세포를 제거 하 고 차단 솔루션의 2 mL에 셀을 품 어 (10% 송아지 혈 청, 1 %BSA / PBS) 실시간에서 1 h
- 차단 솔루션을 제거 하 고 셀, PBS의 2 개 mL를 추가 3%의 250 µ L 1 차적인 항 체 솔루션으로 PBS를 대체 BSA/PBS 하룻밤에 4 ° C 또는 실시간 사용에서 1 h는 1: 200-1: 500 희석 (일반 농도 약 1 µ g/mL, 경험적으로 결정) 항 체에 대 한 다른 DNA 손상 마커 (예를 들어, γH2AX/53BP1 (DSB);에 대 한 특정 구 (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); 일일/6-4PP (가교 손상); 8-oxoG/DNA glycosylases (예를 들어, NTH1) (베이스 손상); 파 (높은 복용량 복잡 한 손상)).
- 항 체 솔루션을 제거 하 고 린스 2 mL PBS의 5 분 동안 두 번, 제거 PBS, 250 µ L 0.1 %2 차 항 체로 3%에서 품 어 실시간에 어둠 속에서 1 시간을 위한 BSA/PBS
- 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 두 번 5 분에 대 한 PBS의 2 개 mL를 추가 이미징 6.1 및 6.2 단계에서 4 ° C에서 1.5-2 mL PBS에에서 셀을 계속.
6. 양적 형광 분석 Immunostained 또는 라이브 셀의
- 스테인드 또는 라이브 셀의 이미지를 캡처 (n > 10) 방사선 조사에 사용 하는 현미경을 사용 하 여. 피-형광 현미경 시스템 1,344 x 1024 픽셀의 해상도 사용 하 여 고 TIFF 16 비트 파일로 이미지를 저장 합니다. Confocal 현미경 사용 1 X 확대; 아르곤 레이저 GFP/FITC, 594 HeNe 레이저 Cy3/mCherry; 512 x 512 또는 1024 x 1024 픽셀 해상도; 스캔 속도 5, 번호: 빠른 스캔 또는 신호 대 잡음 비를 개선 하기 위해 여러 검사를 통해 평균을 위한 2 + 1.
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픽셀 강도 측정 하도록 설계 되어 프로그램 이미지 분석을 사용 합니다.
- 볼륨 사각형 도구를 사용 하 여 개별 셀 이미지에 손상 사이트는 ROI를 그릴. 같은 크기 ROI를 사용 하 여 nucleoplasm 옆에, 하지만 피해 사이트와 겹치는 하지에 배경 형광 신호를 측정. 이것은 비 confocal 현미경 시스템와 관련 된 photobleaching의 정규화에 대 한 중요입니다.
- 이미지 분석 프로그램을 사용 하 여 형광 신호를 측정, "볼륨 분석 보고서" 도구 상자에서를 클릭 합니다. 새 창이 나타납니다. "디스플레이를 데이터" 섹션에서 "이름"와 "밀도" 상자만을 선택 합니다. "완료" 측정 시각화를 클릭 합니다.
- 수출 대상에 대 한 필드 구분 기호 및 "파일"에 대 한 볼륨 보고서 창 및 선택 "탭 (엑셀 서식)"의 하단에서 찾을 테이블 아이콘을 클릭 하 여 스프레드시트 프로그램에 값을 내보냅니다.
- 상대 신호를 컨트롤에 배경 지역 (2 열)는 nucleoplasm에서 정규화 1 빼기 형광 강도 의해 피해 사이트 (열 1)에 분할을 스프레드시트 프로그램, 사용 합니다.
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Confocal 현미경을 사용 하 여 실시간 양적 형광 시간 과정 분석
- 붙일 태그가 단백질-긍정적인 세포 단계 4.3에서 현미경을 사용 하 여 식별 합니다.
- 섹션 4에서 손상 유도 후 시간 경과 형광 이미징 손상 전과 다른 시간 지점에서 수행 합니다. 먼저 그릴 (손상 유도)에 대 한 투자 수익 표 백제 다음 선택은 "취득 > 시계열" 하위 메뉴, 30 20, 및 "주기 지연" "숫자"를 설정 s, "첫 번째 스캔 후 한 번 표 백제"를 선택 하 고 "B 시작"을 클릭. 이 경우에, 첫 번째 이미지는 손상 유도, 19 이미지 인수 뒤에 30 s 간격에 직전 획득 됩니다. 간격 ("주기 지연") 연구의 목적에 따라 변경할 수 있습니다.
- 이미지 수집 완료 되 면 "의미"를 클릭 하 고 피해 지역에 투자 수익을 그립니다. "테이블 표시" 선택한 ROIs 내 강도 나열 하는 테이블을 클릭 합니다. 손상, 전에 동일한 영역의 강도 의해 다른 시간 지점에서 피해 사이트의 형광 강도 나누어 데이터를 표준화 하 고 1을 뺍니다.
7. 작은 Interfering RNA (siRNA) Transfection
참고: 대상 단백질의 고갈 관찰된 단백질 채용 사이트 (제 4) 손상에 대 한 업스트림 요소 요구의 윤곽을 그리 다 수 있는 효과적인 방법입니다. 또한, 전략은 면역 형광 검출에 사용 되는 항 체의 특이성을 해결 하는 가장 좋은 방법은 (섹션 5 참조).
- 주 1: 6-8 x 104 HeLa 세포에 각 잘, 제어 siRNA transfection과 PARP1 siRNA 한 0.5 mL 문화 미디어에 시드 2 웰 스 24 잘 플레이트에 HeLa 세포의 준비 (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3').
- 주 2: 세포는 약 40-50% 합칠 확인 합니다. SiRNA transfection의 첫 라운드를 수행: 혈 청 무료 문화 미디어, 25 µ L로 희석 5 pmol siRNA 3 µ L 지질 튜브에 transfection 시 약을 기반으로 추가 하 고 부드럽게, 혼합 하 고, 실시간에 5-10 분 동안 품 어
- 0.5 mL 신선한 문화 미디어와 셀을 한 번 헹 구 고 0.5 mL 신선한 문화 미디어 (단계 1.1 참조)에 셀을 계속.
- 셀, RNA 지질 단지를 추가 하 고 요리를 앞뒤로 기울이기로 부드럽게 혼합. 2.1 단계와 마찬가지로 인큐베이터에서 다시 세포를 넣어.
- Transfection 믹스를 발음 하 고 6 h 후 0.5 mL 신선한 문화 미디어 (단계 1.1)를 추가 합니다.
- 제 3 일: siRNA transfections (단계 7.2 참조)의 두 번째 라운드를 수행 합니다. 2.3 단계에서 설명한 대로 다음, 35mm gridded coverslip 그릇에 60-100% 씨.
- 제 5 일: 레이저 microirradiation 섹션 4에 의해 결정으로 관심의 요인의 최대 모집에 대 한 최적의 레이저 전원 상태를 사용 하 여 계속 합니다. 일반적으로, 효율적인 고갈 HeLa 세포의 약 60-90%에서 관찰할 수 있습니다.
참고: 대체 및 보완 접근, 억제제, 사용 가능한 경우 사용할 수 있습니다 관심32,44의 요인의 기능을 억제 하기 위해. DDR 신호 억제의 효과 분석 하기 위한 추가 20 µ M PARP 억제제, 1 µ M 파 glycohydrolase (PARG) 억제제, 또는 10 µ M DNA 의존 단백질 키 니 아 제 촉매 소 단위 (DNA-PKcs) 억제제와 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 10 µ M ATM 억제제에는 손상 유도 전에 1 시간을 요리. DMSO만 셀을 추가할 컨트롤.
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Representative Results
안정적으로 표현 EGFP 53BP11220-1711 또는 TRF2 YFP PtK2 셀을 사용 하 여, 레이저 입력된 전원 적정 실시 되었다 그들의 모집 (그림 1)32에 대 한 최적의 상태를 확인 하려면.
높은 입력 파워 레이저 피해 사이트에서 구체적으로 인식 하는 베이스 손상 GFP NTH1 DNA glycosylase 뿐만 아니라 일일 (가교 손상 자외선 (UV) 손상에 의해 일반적으로 생성 된)의 중요 한 클러스터링 관찰 되었다. 또한, 높은 XRCC1 및 CtIP 신호 스트랜드 나누기의 증가 수를 반영 하 고이 조건 (그림 2A) 복잡 한 DNA 손상 유도 된다 시연, 관찰 되었다. 다른 DNA glycosylases 형광 단백질을 융합 (예를 들어, GFP nei endonuclease 8 세 모양의 2 (NEIL2) 및 GFP-8-Oxoguanine glycosylase (OGG1)) condensin 뿐만 아니라 나도로 사용할 수 있습니다 베이스 손상 마커44,59. 이 일치, 우리 발견 파 응답 (즉, 에너지와 표본에 초점에서 방사), 높은 입력 파워 레이저에 의해 크게 유발 됩니다만 약하게 하지만 낮은 레이저 파워에 의해 초점 (그림 2B, 왼쪽 상단). 파 신호, 하지만 하지 PARP1 단백질 지 방화, 손상 사이트에서 PARP 억제제 (데이터 표시 되지 않음)에 민감 했다. SiRNA PARP1에 대 한 특정 파와 피해 사이트 (그림 2B, 오른쪽 상단)에서 PARP1를 점감 하는 또한,32. 높은 입력된 파워 상태 하에서 γH2AX 처음 피해 사이트에 표시 되 고 빠르게 (그림 2B, 하단) ATM/DNA-PK-종속 방식에서 전체 핵 확산. ΓH2AX의 비슷한 ATM/DNA-PK-종속 확산 γ 방사선60에 대 한 보도 했다. 일관 된 결과 800와 780 nm 적외선 레이저 시스템32얻은 했다. 함께 찍은 결과 공개 적정 레이저 입력된 전원 가능 하다는 것 (그리고 그러므로, 에너지와 셀에 초점에서 방사) PARP 응답 DSBs 수과의 다른 정도 유발 하는 조건을 찾을 수와 DNA 손상의 복잡성입니다.
위의 결과 처음에 복잡 한 DNA 손상의 존재 53BP1와 TRF2의 차동 모집을 발생 수 있습니다 제안 했다. 그러나 흥미롭게도,, 낮은 전력 피해 사이트에 53BP11220-1711 채용은 효과적으로 저해 동일한 세포 핵 그림 3B 달리 (그림 3A 에 높은 입력 파워에 의해 유도 된 두 번째 피해 사이트의 존재에 의해 ). 결과 높은 입력 전력 레이저 손상 53BP1 모집에서 트랜스에표시 되지 않습니다 나타냅니다. PARP 억제제 ATM/DNA-PK 억제제 복원에 의해 (그림 3A) 높은 입력된 전력 피해 사이트에도이 채용이 확산 핵 전체 γH2AX의 억제에 의해 파의 억제. 이 주로 γH2AX 분산에 의해 저해 되었다 따라서, ATM/DNA-PK 억제제, 하지 PARP 억제제 (그림 3A, 아래쪽)에 의해 복구 되었다 피해 사이트 중재자의 DNA 손상 검사점 1 (MDC1)의 채용에서 구분 됩니다. (ΓH2AX 상태에 영향을 미치는) 없이 PARG 억제 하 여 파의 중요 한 것은, hyperactivation 일반적으로 53BP1를 효율적으로 모집 하는 낮은 입력 파워 피해 사이트 에서도 초기 53BP1 모집을 효과적으로 억제 (그림 3B)32. 함께 찍은, 이러한 결과 파 신호, 및 손상 당하기의 형식이 아니라, 53BP132의 채용을 방해. 이 여러 피해 사이트 좌우 하 고 서로 상호 작용을 검사할 수 있는 레이저 microirradiation의 다양성의 예입니다.
그림 1 : 레이저의 적정 입력 전원. 미래 실험에 사용할 레이저 파워를 확인 하려면 PtK2 셀 안정적 EGFP-53BP1 및 TRF2 YFP 표현 20 사이 배열 하는 입력된 파워와 microirradiation 레이저를 복종 되었다 mW 및 155 mW 800 nm 적외선 레이저/거꾸로 피-형광을 사용 하 여 현미경 시스템입니다. TRF2-YFP 셀 6 분 탐정에 대 한 다음 동안 EGFP 53BP1 모집 15 분 게시물 조사 (탐정)에 대 한 모니터링은 바 바로 위에 숫자를 셀 테스트의 총 수에 긍정적인 채용 EGFP-53BP1 또는 TRF2 YFP 피해 사이트는 셀의 수를 나타냅니다. 이 그림은 Saquilabon 크루즈32에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 복잡 한 손상 및 강력한 DDR 신호 높은 입력 파워 레이저에 의해 유도. (A) 높은 입력 전력 레이저 microirradiation 스트랜드 나누기 (SSBs 및 DSBs), 가교, 베이스 손상 등 복잡 한 손상을 유도 한다. 일일, XRCC1 (SSB, DSB 복구), NTH1 DNA glycosylase (BER), 및 CtIP (대체 NHEJ와 HR) 표시 (단 GFP NTH1 라이브 셀 이미지 이며 나머지 면역 형광 염색 법에 따라 관찰 된다). 피해 사이트 모집의 양적 형광 강도 측정 프로토콜 섹션 7에에서 명시 된 대로 끝났다 고는 boxplots에 표시 됩니다. 각 정량된 단백질에서 세포 (n) 테스트의 총 수를 볼 수 있습니다. p-값 < 0.05. (B) 탑 (왼쪽): 높은 입력 전력 피해 사이트에 강력한 파 및 PARP1 신호. (오른쪽) 상단: PARP1 siRNA 고갈 파 신호32,44를 폐지 하 고 충분 하다. 아래: 낮은 (위)와 높은 (아래) 셀에 γH2AX의 시간 과정 분석 입력 전원 손상 표시. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림은 Saquilabon 크루즈32에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : DDR 신호 차동 활성화에 영향을 미치는 53BP1 채용 사이트가 손상. (A) 가기: PtK2 셀 안정적으로 표현 EGFP 53BP11220-1711 microirradiated 낮은 (15%)와 높은 (25%)를 했다 입력 파워 (흰색 및 노란색 화살촉, 각각) 780 nm의 NIR/confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 동일한 핵에서. DMSO, PARP의 수행이 억제제 (Pi)를 또는 ATM, 조합 DNA-PK, 및 PARP 억제제 (Ai + 디 + Pi) 표시. 라이브 셀 이미징 EGFP 53BP11220-1711 의 DSB 유도 후 30 분에 체포 됐다. 셀 고정 그리고 DSB 표식으로 γH2AX에 대 한 특정 항 체로 얼룩진 했다. EGFP 53BP11220-1711 피해 사이트에서의 형광 강도의 변화 p오른쪽에 표시 됩니다-값 (값 의미: DMSO, 0.03 ± 0.02; Pi, 0.34 ± 0.19; 인공 지능 + 디 + 사립 탐정, 0.98 ± 0.23). 하단: 표시 된 높은 입력 전력 손상 MDC1 지역화에 Pi와 Ai + 디 치료의 효과. 눈금 막대는 10 µ m. 오른쪽: 높은 입력 전력에서 MDC1의 형광 신호 변화 손상 사이트 DMSO, Pi, 또는 인공 지능 + 디 있을 때 p-값 (값 의미: DMSO, 0.07 ± 0.10; Pi, 0.05 ± 0.07; 인공 지능 + 디, 0.86 ± 0.26). 눈금 막대 = 10 µ m. N = 각 강도 측정을 위한 10. (B) 파의 향상의 효과 PARGi 치료 낮은 입력 파워 피해 사이트에 내 인 성 53BP1 채용에 의해 신호. 오른쪽: 낮은 입력 파워 레이저 생 53BP1 모집 (면역 형광 염색 법에 의해 감지)의 정량 분석을 나타내는 Boxplots (60 mW 800 nm 적외선 레이저/거꾸로 피 형광 현미경 시스템) 15 분에 방사선 조사를 게시 DMSO 또는 PARGi 같이 있을 때 왼쪽: 파 및 53BP1 면역 형광 사진 DMSO PARGi 처리와 동일한 조건 하에서 손상 된 세포의 얼룩. DMSO 치료를 위해 세포의 100% 검사 (N = 25) 전시 강력한 53BP1 모집 (오른쪽). 반면, 20/25 아니 53BP1 모집 PARGi (오른쪽 아래), 존재 그리고 약한 모집을 보여준 5 셀 보여주었다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림은 Saquilabon 크루즈32에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
레이저 microirradiation DDR 연구에 대 한 사용의 장점은 다음과 같습니다.
1. 그것은 가능한 다양 한 종류를 유도 하 고 양의 DNA가 복잡 한 DNA 손상, 간단한 가닥 나누기에서 손상 감지 다른 수리 DNA에서 파손 사이트 레이저 조사 매개 변수를 조정 하 여. ( 그림 3)에서 트랜스 효과 평가 하기 위해 여러 번 같은 셀 핵에에서 피해를 입힐 수 이기도 합니다.
2. 중요 한 것은, 피해 사이트와 다른 핵에서 발생 하는 2 차 이벤트에 이벤트 쉽게 구분할 수 있습니다.
3. 그것은 포함 하 여, 단일 세포 수준에서 손상에 대 한 응답에 붙일 태그가 단백질 역동성의 고해상도 실시간 측정 수행 가능 하지만에 국한 되지 않음: 포스터 공명 에너지 전송 (무서 워), 형광 일생 화상 진 찰 ( FLIM), 쌍 상관 함수 (pCF), 등, 라이브 셀에 DDR을 잡으려고.
4입니다. RNA 간섭 또는 억제제 치료와 결합, 그것은 세포의 작은 수에서 업스트림 요소 요구 사항을 테스트 하려면 상대적으로 간단 합니다.
5. 그것은 또한 있어야 그 NIR (또는 녹색)를 언급 나 DNA intercalating 염료, 따라서 피하는 chromatin 포장에 부작용을 원치 않는 레이저 방사선 DNA의 뉴클레오티드 유사 체와 사전 민감성을 요구 하지 않는다. 이것은 달리 낮은 복용량에 민감 화를 요구 하 고 높은 복용량39,,4961에서 벗어난 DDR을 하면 자외선 레이저 시스템입니다.
프로토콜/수정 안에 중요 한 단계 및 문제 해결
DDR 분석 유물 및 실험적인 변화를 최소화 하기 위해 수행 될 때 셀 건강 조건에는 중요 하다.입니다. DNA 또는 siRNA transfected 세포 일반적으로 더 중요 한 또는 쉽게 분리 gridded coverslip에 성장 하는 때입니다. Transfection는 작동으로 transfection 시에 짧은 시간에 세포를 유지 하 고 더 transfected 세포 untransfected 세포에 비해 gridded coverslip 접시에 씨앗 도움이 됩니다. 이 실험에 대 한 비교 셀 confluences를 달성 하기 위하여.
그것은 알려졌다 티 미 딘 블록 DDR에 영향을 미칠 수 있으며 결과62동기화 셀 γH2AX의 증가 수준에 이르게. 또한, 베이스 라인 γH2AX 신호도 없이 어떤 외 인 손상63,64S와 G2/M 단계에서 높은 것으로 보였다. 그러나 우리,, 어떤 중요 한 γH2AX 신호에 영향을 미칠 것 이다 또는 셀에 레이저 유도 피해 사이트에 특정 γH2AX 응답을 방해 하는 nucleoplasm에 S/g 2 단계 이중 티 미 딘 블록51에 의해 동기화을 관찰 하지 않습니다.
일관 된 결과 얻으려면, 그것은 레이저 시스템 출력 매개 변수 (2 ~ 4 주) 및 광학 정렬 (2 개월 마다)에 정기적으로 확인 하는 데 필요한. 시간이 지남에, 레이저 시스템 구성 요소는 다시 정렬 해야 할 수도 있습니다, 렌즈 손상 될 수 있습니다 대체 될 필요가 그리고 총 입력된 파워의 안정성 변경 될 수 있습니다. 열쇠는 손상 (가교 (일일 비용 또는 6 4PP) 및 베이스 손상 (8-oxoG)), 마커 단백질 (예를 들면, DNA glycosylases, Rad51, cohesin, 및 구), 그리고 파 수정 복용량을 결정 하기 위해이 프로토콜에서 설명의 존재를 평가 하 고 레이저 현미경 시스템 사용에 의해 유도 된 DNA 손상의 복잡성.
기술의 한계
레이저 microirradiation는 제한이 있습니다. 레이저 빔에 의해 유도 된 DNA 손상 매우 자연스럽 게 발생에 비해 핵에서 하나의 영역에서 클러스터 된 손상 핵에 걸쳐 확산 될 수 있습니다. 이 손상 신호는 전파 방법 또는 핵 이웃 chromatin에서 변경할 수 있습니다. 셀의 상대적으로 낮은 수는 한 번에 반구 수, 이후 인구 기반 생 화 확 적인 분석 실험 (예를 들면, 서쪽 오 점, 단백질 복잡 한 정화, chromatin immunoprecipitation (칩))는 쉽게 수행할 수 없습니다. 붙일 태그가 단백질에 대 한 의존도 (식 exogenous 재조합 단백질의 또는 심지어 그 이상의 표현 endogenously CRISPR 중재 태그 삽입을 사용 하 여) 대 한 동적 이미징 연구에 취약해 퓨전 유도 단백질 유물입니다. 레이저-손상의 독특한 자연과의 잠재적인 artifactual 효과 단백질, 그러므로, 방법 (IR, 화학 에이전트 손상) 손상 하는 기존의 DNA를 사용 하 여 결과 비교해보면와 내 인 성 평가 될 필요가 태그가 없는 단백질 (비록 때로는 아니에요 완전 한 병렬 실험을 수행할 수).
기존의 방법에 관하여 의미
SceI, FokI, AsiSI,-PpoI 등 시퀀스 관련 endonucleases 사용 하 여 사이트별 DSBs (엄격 하 게 간단한 DSBs)를 유도 하는 대체 전략을 제공 합니다. 팩터 모집 또는 수정 사이트 또는 게놈 넓은 칩 분석65,66,,6768,69에 의해 분석할 수 있습니다. 상대적으로 동기 유도 DSBs의 스테로이드 호르몬 수용 체와 저하 신호 (degron) 급속 한 핵 전 좌 및 저하, 각각65,66 endonuclease 태그 얻을 수 있다 , 67 , 68 , 그러나 69. 하나 고려해 야,, 그 endonuclease 식 및 대상 사이트 접근성, 효율성 및 지속적인 수리 상태 다른 대상 사이트에서 서로 다른 셀에 변수 될 수 있습니다. 이러한 heterogeneities 결과 왜곡 수 있습니다 인구 기반 칩 분석에서 평균 것입니다. 레이저 microirradiation, 다른 한편으로, 단일 세포 수준에서 분석 될 수 있다 손상 응답 역학의 공간 해상도 (submicrometer) 뿐만 아니라 가장 높은 가능한 시간적 해상도 (밀리초)을 제공 합니다. 그러나 높은 피해 밀도,, 결과 좌우할 지도 모른다. 두 전략 접근성 항 체 또는 펩 티 드 태그에 의해 발생 하는 아티팩트에 과민할 수 있다. 그것은, 그러므로, 잠재적으로 서로 보완 하는 데 사용할 수 있습니다 두 전략의 찬 부 양론을 이해 하는 것이 중요.
미래의 응용 프로그램
형광 이미징 및 역학 기술의 급속 한 발전과 함께 다른 총계 및 유형의 특정 위치 및 세포 주기 단계에 DNA 손상 유도 레이저 시스템의 세포가 귀중 한 기회를 제공 하 고 DNA 분자 응답 단일 세포 수준에서 고해상도 spatiotemporal 손상. 그것은 가능할 것 이다, 예를 들어 손상 사이트별 애타게 하 고 핵 및 셀 전체 DDR 신호 밀리초 분해능 변환 (예를 들면, 분자 상호 작용 또는 피해 사이트에 독점적으로 발생 하는 수정 검사 검색 염색 질 구조에서의 동적 변화 실시간, 실시간 피해 사이트에서 전체 핵에 신호 손상의 확산을 관찰 또는). 그것은 또한 세포 운명에 DNA 손상의 효과 검사 하는 시간의 오랜 기간 동안 동일한 셀을 따라 수 있습니다. 우리는 레이저 microirradiation 방법을 제대로 사용 하는 경우 계속 DNA 수리 분야의 발전에 크게 기여 하는 구상.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 GFP NTH1 식 플라스 미드에 대 한 토 호 쿠 대학, 일본에서 야 스도 아키라 박사 및 박사 에로스 Lazzerini Denchi 스 크립 스 연구소, 라 Jolla, 캘리포니아 TRF2 YFP EGFP 53BP11220-1711 식 플라스 미드에 대 한 감사합니다. 이 작품은 공군 사무실의 과학적 연구 (FA9550-04-1-0101)와 베크만 레이저 연구소 Inc. 재단 (M.W.B), 과학 (B.A.S), 하 고 NSF MCB 1615701 CRCC 국립 아카데미에서 포드 기초 장학금에 의해 지원 되었다 음악원-17-426665 (K. Y.)에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 | Coherent Inc. | Mira 900 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | |
| 63X/1.4 NA objective | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
| Compact Rotation Stage | Newport Corp | PR50PP | |
| Temperature Controller | Warner | TC-344B | |
| Heating System | Ibidi | 10918 | |
| Gas Incubation System | Ibidi | 11920 | |
| Laser Power and Energy Meter (RoHS) | Coherent | FieldMaxII-TOP | |
| ORCA-R2 Digital CCD Camera | Hamamatsu | C10600 | |
| LSM 510 META Laser Scanning Microscopes | Carl Zeiss | ||
| 100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
| 35mm Gridded Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
| PtK2 kidney epithelial cells | ATCC | CCL 56 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| DMEM | Life Technologies | 11885-092 | |
| CO2-Independent Medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| Advanced MEM | Life Technologies | 12492-013 | supplemented with L-Glutamine, 4% FBS |
| penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | 15140122 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Thymidine | SIGMA | T9250 | |
| serum free media (Opti-MEM I Reduced Serum Media) | Fisher Scientific | 11058021 | |
| Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) | Kamiya Biomedical Company | MC-062 | |
| Anti-XRCC1 (mouse ) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
| Anti-53BP1 (rabbit) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
| Anti-CtIP (rabbit) | Abcam | ab70163 | |
| Anti-PAR polymers (mouse) | Enzo Life Sciences | BML-SA216-0100 | |
| Anti-PAR (rabbit) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
| Anti-TRF2 (mouse) | Novus Biological | NB100-56506 | |
| Anti 6-4PP (mouse) | Kamiya Biomedical | ||
| Anti-Rad21 (Rabbit) (for cohesin detection) | generated in Yokomori (KY) lab | ||
| Anti-Rad51 (Rabbit) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8349 | |
| Anti-Ku70 (mouse) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
| 8-oxiguanine | Trevigen, Inc. | ||
| Anti-PARP1 (Rabbit) | generated in KY lab | ref 43 | |
| Anti-hCAPG (Rabbit) (for condensin detection) | generated in KY lab | ref 42 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
| Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
| HiPerFect siRNA Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| GFP-SMC1 stable cell line | generated in KY lab | ref 49 | |
| GFP-NEIL2 stable cell line | generated in KY lab | ref 54 | |
| GFP-NTH1 stable cell line | generated in KY lab | ref 32 | |
| GFP-SMC1 plasmid | generated in KY lab | ||
| GFP-Ku plasmid | generated in KY lab | ||
| Anti-MDC1 (rabbit) | Novus Biologicals | NB100–395 | |
| Anti-gH2AX (rabbit) | Millipore | 07–164 | |
| EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| TRF2-YFP PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
| PARG inhibitor | Trevigen | 4680-096-03 | |
| DNA–PKcs inhibitor NU7026 | Sigma | N1537 | |
| ATM inhibitor KU55933 | Calbiochem | 118500 | |
| Olaparib | Apexbio Technology | A4154 | |
| Paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
| Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | image analysis program |
| Excel | microsoft | spreadsheet program | |
| Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium | Fisher Scientific | 14200166 | dilute to 1X |
References
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