Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Laser Microirradiation å studere i Vivo mobilnettet Svar å enkle og komplekse DNA skade

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56213
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2,3,4, 1
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokollen er å beskrive hvordan du bruker laser microirradiation å indusere typer DNA-skader, inkludert relativt enkel strand bryter og komplekse skade, å studere DNA skade signalnettverk og reparasjon faktor montering på skade nettsteder i vivo .

Abstract

DNA skade induserer bestemte signaliserer og reparasjon svar i cellen, som er avgjørende for beskyttelse av genomet integritet. Laser microirradiation ble et verdifullt eksperimentelle verktøy å undersøke de DNA skade response (DDR) i vivo. Den innrømmer sanntid høyoppløselig encellede analyse av macromolecular dynamics svar på laser-indusert skade begrenset til et submicrometer område i cellekjernen. Men har ulike laser forhold vært brukt uten styrking av forskjeller i typer skader forårsaket. Som et resultat, natur skaden er ofte ikke godt preget eller kontrollert, forårsaker inkonsekvens i rekruttering eller endre profiler. Vi har vist at ulike bestråling forhold (dvs., ulike bølgelengder samt forskjellige input krefter (irradiances) av en femtosecond (AS) nær infrarød (NIR) laser) indusert distinkte DDR og reparasjon protein samlinger. Dette gjenspeiler DNA skade produsert. Denne protokollen beskriver hvor titrering av laser input makt innrømmer induksjon av forskjellige beløp og kompleksiteten i DNA skade, som kan lett overvåkes av gjenkjenning av base og crosslinking, differensial poly (ADP-ribose) (PAR) signalnettverk, og Pathway-spesifikke reparasjon faktor samlinger på skade nettsteder. Når skade forholdene er fastsatt, er det mulig å undersøke effekten av ulike skade kompleksitet og differensial skade signalnettverk og uttømming av oppstrøms factor(s) på noen faktor av interesse.

Introduction

I Vivo DNA skade signalnettverk er ikke godt forstått
I vivo, DNA er kompleksbundet med histones og andre faktorer som skjemaet chromatin fiber. Regulering av chromatin struktur er av avgjørende betydning for DNA stoffskiftet. For eksempel er varianten histone H2AX fosforylert ataksi-telangiectasia mutert (ATM) og andre kinaser følgende dobbel-strand bryter (DSB) induksjon, og er viktig for DSB skade signalforsterkning, samt gi et docking-område for andre faktorer. Spredning av skade signalnettverk og reparasjon veien valg synes å være kritisk påvirket av lokale chromatin struktur skade områder1. En rekke chromatin remodeling faktorer, histone chaperones og histone endre enzymer er faktisk rekruttert skader områder og er viktige for effektiv DNA-reparasjon, fremhever betydningen av chromatin i DDR og reparere2 , 3 , 4. videre skade nettstedet klynger eller omplassering ble observert i gjær og drosophila5,6,7,8, minner om relocalization av genet loci i den subnuclear rommet forbundet med gene regulering9,10. Studier i mus og menneskelige celler avslørte også mobilisering av DSB nettsteder, som påvirker reparere gjengivelse og sti valg11,12. Dette øker muligheten for at DDR/reparasjon kan også være nært knyttet til kjernefysiske arkitektur, høyere orden chromatin organisasjon og kromosom dynamikk i cellekjernen. Derfor er det avgjørende å utvikle høy oppløsning metoder å studere DDR og reparasjon prosesser i forbindelse med endogene kjernefysiske miljøet i en levende celle for å forstå kort - og langsiktige konsekvensene av DNA skade.

Kritiske rolle PAR Polymerase (PARP) i måle omfanget og Type skader og regulere Protein montering på webområdet skade
PARP1 er en DNA nick sensor raskt aktiveres av DNA skade som spiller en avgjørende rolle i DNA reparasjon13. PARP1 var opprinnelig tenkt å fungere sammen med X-Ray reparere Cross utfyller 1 (XRCC1) å forenkle base excision reparasjon (BER), men nyere studier avsløre dens rolle i andre DNA reparasjon veier, inkludert DSB reparasjon14. Aktivert PARP1 bruker nikotinamid adenine dinucleotide (NAD+) som et medium til ADP-ribosylate flere mål proteiner, inkludert seg selv. Dette enzymet og andre familiemedlemmer har tiltrukket seg mye oppmerksomhet de siste årene som PARP hemmere har dukket opp som lovende terapeutiske narkotika for kreft. Selv om PARP hemmere ble opprinnelig funnet for å være effektiv i bryst kreft genet (BRCA)-mutert brystkreft celler, er det nå en mengde bevis for deres virkninger i mono- og kombinasjon terapi med DNA skade agenter/bestråling mot et bredt spekter av kreft mutasjoner ikke begrenset til BRCA15,16,17,18,19,20.

På molekylært nivå, ble PARP aktivisering vist å spille viktige roller i å organisere lokale chromatin strukturen på skade nettsteder. PAR-avhengige rekrutteringen av chromatin endring enzymer forenkler DSB reparasjon og dikterer reparere veien valg, tyder viktig stillas rollen PAR modifikasjon på skade nettsteder. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 vi nylig demonstrert av p53-binding protein 1 (53BP1) fra skade områder av PAR 32, gir en alternativ forklaring på 53BP1-avhengige hyperactivation av ikke-homologe endjoining ( NHEJ) av PARP hemmer og fremhever betydningen av PARP i DSB reparasjon veien valg33,34. PARP1 også faktorer direkte PARylates og påvirker aktiviteten til flere DNA reparasjon14.

Bruke Laser Microirradiation som et verktøy til å studere DDR/reparasjon i Vivo
Laser microirradiation å produsere sub-mikron endringer på individuelle kromosomene ble først beskrevet i 196935 og omtalt i detalj i 198136. Flere tiår senere, laser microirradiation ble vist å indusere DNA skade på en definert submicrometer region i cellekjernen og ble påvist for å være en nyttig teknikk for å studere rekruttering eller modifikasjoner av ulike faktorer DNA lesjoner i vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. denne metoden tillater påvisning av de faktorene som ikke utgjør tydelig bestråling-indusert foci (IRIF) på skade områder39,42. Det er også mulig å undersøke spatiotemporal dynamikken i chromatin strukturelle endringer både på skade områder og resten av kjernen. Vi nøye sammenlignet DDRs indusert av ulike laser systemer og krefter til å evaluere forholdet mellom av DNA skade og den microirradiation forhold32,43,44, 45. Avvikende rekruttering mønstre av 53BP1 og telomeric gjenta bindende faktor 2 (TRF2) ble observert i forrige laser skade studiene, som basisen for den regelmessige bekymringen for "ikke-fysiologiske" natur laser-indusert skade46 ,47,48,49. Vi fant at disse tilsynelatende avvik kan nå forklares med differensial PARP signalering som måler mengden og kompleksiteten i indusert skade32. Vi bekreftet at: 1) laser-microirradiated celler (selv etter høy input-power bestråling) er arrestert i interphase på en måte som skader checkpoint kontroll-avhengige og være levedyktig (minst opptil 48 h)32,50. og 2) reparasjon faktor rekruttering/modifikasjoner trofast recapitulate dem observert med behandling med konvensjonelle DNA skade agenter og DSB induksjon av endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. Disse resultatene støtter fysiologiske relevansen av studere laser skade-indusert mobilnettet svar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. grunnleggende celle forberedelse

Merk: Dette trinnet er standard immunofluorescence oppdagelsen av endogene protein rekruttering eller modifisering og bruk av en celle linje stabilt uttrykke en fluorescently merket rekombinante proteiner. For eksempel, studere Potorustridactylus (PtK2) pungdyr nyre epitelceller stabilt uttrykke EGFP-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP ble brukt i våre tidligere (figur 1)32. I tilfelle fokus danner regionen 53BP1 (aminosyre 1220-1711) som inneholder oligomerization domenet Tudor domenet og ubiquitylation-avhengige rekruttering (UDR) motivet, var smeltet til forbedret GFP (EGFP-53BP11220-1711). Dette fusion protein viser skade nettstedet rekruttering av full lengde 53BP153,54,55. HeLa celler, må fluorescently merket underenheter av cohesin (f.eks, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52og GFP-SA2 51) være stabilt uttrykt å sikre effektiv inkorporering komplekset og recapitulate S/G2 celle syklus fase-spesifikk skade nettstedet rekruttering av endogene cohesin51.

  1. Frø en tilhenger celle type på en 35 mm vev kultur parabol med en gridded dekkglassvæske å tillate enkeltcelle identifikasjon. Juster hvor første celle for å oppnå 60% confluency i 36-48 h basert på spredningen rate av bestemt celle linjen. For eksempel:
    1. For PtK2 pungdyr nyre epitelceller (wild type eller de stabilt uttrykke EGFP-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP): plate 2.0 x 104 celler i 2 mL avansert Minimum viktig Medium (MEM) supplert med 2 mM L-glutamin, 4% fosterets storfe serum (FBS) og antibiotika (100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin), og Inkuber på 37 ° C med 7% CO2.
    2. For HeLa celler med stabilt uttrykke fluorescently merket rekombinante proteiner GFP-SA2: frø 1.0 x 105 celler i 2 mL Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin, og ruge på 37 ° C med 5% CO2. Andre HeLa celler kan også brukes inkludert uforandret celler eller celler som uttrykker hSMC1-GFP.
  2. Tillate at celler følge og sprer 36-48 h før DNA skade induksjon på 30-60% samløpet (for å tillate visualisering antall rutenett). Gå til seksjon 4.

2. forbigående Transfection

Merk: Noen ganger gode antistoffer finnes ikke oppdage endogene proteiner. Hvis cellelinjer stabilt uttrykke markør proteiner ikke er tilgjengelig, utføre forbigående transfections å overvåke fluorescently merket proteiner for levende celle analyser.

  1. HeLa celler, på dag 1, frø 6-8 x 104 celler i 0,5 mL kultur medier i en brønn av en 24-vel plate og ruge i en 100% fuktet inkubator på 37 ° C og med 5% CO2. Se trinn 1.1 for kultur medier forhold.
  2. Dag 2, bruk en pattedyr uttrykk plasmider koding en fluorescently merket DNA reparasjon faktor (f.eksGFP-NTH1 eller GFP-OGG1 base skade32,44,56, GFP-Ku for høy dose DSBs57, GFP-53BP1 32 for relativt enkle DSBs eller andre proteiner rundt smeltet fluorescerende merke) til å utføre liposome-mediert DNA transfection. Fortynne 0,3 µg plasmider DNA i 25 µL serum-fri kultur medium i en 1,5 mL tube.
  3. I en annen 1,5 mL tube, fortynne 1 µL liposome-baserte DNA transfection reagens i 25 µL av serum-fri kultur medier og bland forsiktig.
  4. Bland utvannet DNA og transfection agent forsiktig og ruge i 10 min ved romtemperatur (RT) til skjemaet DNA-lipid komplekser.
  5. Skyll celler med 0,5 mL kultur medier når, fjerne media og legge til 0,5 mL frisk kultur medier cellene (som trinn 1.1).
  6. Legge til DNA-lipid komplekser cellene. Bland forsiktig av rocking platen et par ganger. Sett cellene tilbake i inkubator som i trinn 2.1.
  7. Etter 4-6 h, fjerner kultur media cellene og legger 300 µL 0,05% Trypsin-EDTA. Fjerne den, legge til 200 µL Trypsin-EDTA, og Inkuber i 37 ° C inkubator i 3-4 min.
  8. Etter bekrefter at cellene er frittstående, legge til 800 µL kultur medier og resuspend celler av forsiktig pipettering å bryte opp cellen klumper. Overføre celle suspensjon til en 35 mm kultur parabol med en gridded dekkglassvæske, og Legg kultur medier til et siste volum 2 ml.
  9. Inkuber celler i inkubator som i trinn 2.1 48 h, og deretter gå videre til del 4.
    Merk: Hvis uttrykket av rekombinant protein er giftig (transfekterte celler viser runde eller uregelmessig morfologi etter inkubasjon i trinn 2.8), forkorte tiden uttrykk og utføre laser microirradiation (del 4) på 16-20 h etter hva så lenge den protein uttrykk kan bekreftes (for fluorescens deteksjon, se trinn 4.3). I dette tilfellet utføre transfection direkte i 35 mm parabolen. Frø 3.0 x 105 HeLa celler i en 35 mm parabol med en gridded dekkglassvæske å oppnå ca 50-70% samløpet etter 30 h. Transfect DNA plasmider og endre media 2-6 h etter hva. Fortsette med laser microirradiation 12-20 h senere hvis protein uttrykk er rimelig og celler vises sunn.

3. celle syklus synkronisering

Merk: For homologe rekombinasjon reparasjon (HR) proteiner, som Rad51 og cohesin, rekruttering er mer fremtredende i S/G2 fase av cellen syklus, som HR reparasjon tar sted51. Derfor, for å overvåke rekruttering av disse proteinene, celle synkronisering til S/G2 fase er nødvendig.

  1. S/G2 fase synkronisering
    1. Bruke dobbel thymidine blokk protokollen for cellen synkronisering til S/G2 fase50,51. Etter seeding cellene i en 35 mm gridded dekkglassvæske rett (se trinn 1.1), ruge cellene med thymidine (til en siste konsentrasjon av 2,5) på kultur medier (som trinn 1.1) for 17 h på 37 ° C og 5% CO2.
    2. Skyll cellene med 1 mL thymidine-fri kultur medier (som trinn 1.1) to ganger, og ruge cellene i 2 mL thymidine-fri kultur media 9 h som i trinn 1.1.
    3. Legge til 200 µL 27.5 mM thymidine lager løsning (oppløst i kultur medier) inn i kulturen-mediene med celler i en siste konsentrasjon av 2,5 thymidine. Inkuber cellene som steg 3.1.1 for en annen 15 h. skyll og ruge cellene i thymidine-fri kultur medier for 4-6 h og indusere DNA skade (del 4).
    4. Bekrefte synkronisering effektivitet ved å bruke celle syklus markører (Cyclin A2 og B1 for S/G2 og G2, henholdsvis), S/G2 fase-spesifikke DNA skade reparasjon faktorer (f.eks, Rad51 eller cohesin) eller sprøytebruk/EdU selskap (S fase celler)51.
  2. G1 fase synkronisering
    1. Ætt 6-8 x 104 HeLa celler i en 35 mm kultur parabol med gridded dekkglassvæske (trinn 2.1).
    2. Etter 2 dager, identifisere metaphase celler, som er litt løftet og rund-formet, under en invertert mikroskop med 10 X mål og 10 X okulær linser. Hente bilder for å registrere plasseringen av metaphase celler i gridded dekkglassvæske.
    3. Etter 3-4 h, bekrefte celledeling i to datter celler (i G1 fase) og indusere DNA skade (del 4).

4. titrering laser Input makt

Merk: I denne protokollen, vi induserer DNA skade bruker en 780 nm pulserende fs NIR Lasersystemet AC confocal mikroskop, eller en 800 nm pulserende fs NIR laser koplet til en invertert epi-fluorescens mikroskop. Selv om inngangseffekt (faktiske Irradians på laser fokus i prøven) for å indusere sammenlignbare DDR er forskjellige i disse systemene, gjelder for inngangseffekt titrering begge, eller noen, NIR systemer32,57 . I situ energi per laser puls og topp Irradians på brennpunktet for to Laseren systemer var i området 5.33 × 10-2-4 × 10-1 nJ og 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, henholdsvis32.

  1. Slå på NIR laser og la Lasersystemet oppvarmingstid 1t før bruk.
  2. Plass en rett av celler på en oppvarmet (37 ° C) scene i et kammer som lar CO2 (5%) og fuktighetskontroll (100%).
    Merk: Hvis en CO2 kammer ikke er tilgjengelig, kan du bruke CO2-uavhengige kultur medier for opptil 5-6 h. Hvis en oppvarming scenen ikke er tilgjengelig, holde cellene under mikroskop for < 20 min og umiddelbart sett i vev kultur inkubator med riktig temperatur, CO2og fuktighetskontroll. Disse oppdrettsforholdene variere avhengig bestemt celle samt organismen av avledning (f.eks, pattedyr versus amfibier).
  3. For levende celle analyse av fluorescently merket proteiner, Velg GFP filter (450-490 nm eksitasjon, 515-586 nm utslipp) eller Cy3 filter (540-552 nm eksitasjon, > 590 nm utslipp) for GFP eller mCherry-smeltet protein, henholdsvis bruker en 100 X eller 63 X oljeneddyp mål.
  4. Søke etter celler som har sammenlignbare fluorescens signaler, reflekterer sammenlignbare nivåer av protein uttrykk. Unngå celler som har svak eller for sterk for å redusere celle til celle variasjon i fluorescens målinger.
  5. Sjarmere laser inngangseffekt.
    1. 780 nm NIR laser knyttet til AC confocal mikroskop
      1. Bruk funksjonen programvare blekemiddel for å målrette lineær spor innenfor cellekjernen for eksponering for enkelt laser skanner (oppløsningen 512 x 512 bildepunkter, zoom X1, bleket regionen 50 x 4 piksler, 12,8 µs pixel holdetiden, gjentakelse x1) gjennom olje målet (100 X / 1.3 NA).
      2. Juster laser overføring prosentandelen (ved hjelp av software/hardware bygget inn i laser mikroskop systemet av produsenten) 5% uten å endre andre innstillinger.
      3. Plass en celle i midten av feltet. Klikk området av interesse (ROI) verktøyet, tegne en linje eller boksen (ca 50 x 4 piksler) i kjernen ved hjelp av musen og klikk "Blekemiddel" for å indusere DNA skade.
        Merk: I påfølgende bestråling trinn, "bleking" bør økes i 5% trinn til 40% eller opp til 100% om nødvendig.
      4. 800 nm NIR laser knyttet til epi-fluorescens mikroskopet
      5. Kontrollere input makt gjennom en (63 X / 1.4 NA) fase kontrast nedsenking oljeobjektiv ved motorisert rotasjon av filtere polarisering introdusert i banen bjelke og montert på en datastyrt motorisert rotasjon scenen32,39 , 58.
      6. Justere polarisator vinkelen (°) og måle inngangseffekt (mW) inn mikroskopet, bruker en laser power meter. Bestem polarisator vinklene som gir input krefter som spenner fra 20 mW-155 mW på 5-10 mW intervaller.
      7. Angi polarisator vinkelen som svarer til 20 mW inngangseffekt.
        Note For våre laser system, hvis polarisator er 40 °, inngangseffekt er 65 mW. Øke inngangseffekt med 5-10 mW trinn.
  6. Levende celle analyse, gå til trinn 6.1 og 6.3. Immunofluorescence deteksjon av endogene proteiner eller endringer gå til seksjon 5. Etter analyse, gå til trinn 4.7 for ytterligere titrering laser makt. Analysere oppstrøms faktor kravet, gå til punkt 7.
    Merk: Rekruttering av BER og NHEJ faktorer er rask (innen få minutter) og midlertidig (< ~ 30 min - 1 t avhengig av faktor og < ~ 4 h innlegget skade induksjon, henholdsvis). I kontrast, rekruttering av HR faktorene Rad51 og cohesin er synlig på ~ 30 min - 1 t og de pleier å vedvare mer enn 8 h på ikke er reparert DNA lesjoner44,50,51. Derfor er det nødvendig å undersøke annen poeng legge bestråling for ulike reparasjon faktorer.
  7. Øke input makt i ønskede intervaller (dvs.5% for 780 NIR laser og 5-10 mW for 800 NIR) som i trinn 4.4, og gjenta trinn 4.5-4.7 på et nytt sett av celler å bestemme terskelen (50% av skadede celler Vis rekruttering) og peak (100% av celler rekruttering) for hver protein.

5. immunofluorescence flekker

Merk: For påvisning av kovalente protein endring, for eksempel linje (komplekse skade markør) og H2AX fosforylering (γH2AX) (DSB markør), samt cyclobutane pyrimidine dimer (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) og 8-oxoguanine (8-oxoG) (crosslinking og Base skade markører, henholdsvis), cellene må være fast og farget med spesifikke antistoffer. I tillegg er det best å bekrefte resultatene med fluorescently merket rekombinante proteiner av antistoff påvisning av endogene proteiner, å skille gjenstander av overuttrykte rekombinant fusion proteiner.

  1. Fastsette cellene på ulike tidspunkt etter skade induksjon (trinn 4.5) avhengig av faktorene ved å erstatte kultur media (se trinn 1.1) med 1,5 mL av 4% paraformaldehyde/1 X PBS for 10 min på RT.
    Forsiktig: Paraformaldehyde gasser er giftige og alt arbeidet bør gjøres i ventilert avtrekksvifte.
  2. Fjerne 4% paraformaldehyde/PBS og legge til 1 mL av 0,5% vaskemiddel/PBS i 10 min RT.
  3. Fjerne 0,5% vaskemiddel/PBS og skyll celler med 2 mL PBS i 5 minutter to ganger og ruge celler i 2 mL blokkerer løsning (10% kalv serum, 1% BSA/PBS) 1t på RT.
  4. Fjerne blokkering løsningen legger til 2 mL PBS celler og erstatte PBS med 250 µL primære antistoff løsning på 3% BSA/PBS overnatting på 4 ° C eller 1 h på RT. Bruk en 1:200-1:500 fortynning (typisk konsentrasjon ca 1 µg/mL, empirisk bestemt) for antistoffer spesifikke for ulike DNA skade markører (f.eksγH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); CPD/6-4PP (crosslinking skader); 8-oxoG/DNA glycosylases (f.eksNTH1) (base skade); PAR (høy dose komplekse skader)).
  5. Fjerne antistoff løsningen og skyll med 2 mL PBS i 5 minutter to ganger, Fjern PBS og ruge med 250 µL 0,1% sekundære antistoff i 3% BSA/PBS 1t i mørket på RT.
  6. Fjern sekundær antistoff løsningen og legge 2 mL PBS i 5 minutter to ganger og holde celler i 1,5-2 mL PBS på 4 ° C for bildebehandling i trinn 6.1 og 6.2.

6. kvantitativ fluorescens analyse av Immunostained eller lever celler

  1. Ta bilder av farget eller levende celler (n > 10) ved hjelp av mikroskop brukes for bestråling. For epi-fluorescens mikroskop system, bruk oppløsning på 1,344 x 1024 piksler og lagre bilder som TIFF 16-biters filer. AC confocal mikroskop, bruke 1 X forstørrelse; Argon laser for GFP/FITC, HeNe 594 laser for Cy3/mCherry; 512 x 512 eller 1024 x 1024 piksler for bildeoppløsning; skanne hastighet 5, nummer: 1 for rask skanning eller 2 + for gjennomsnitt over flere skanninger å forbedre signal til støyforhold.
  2. Bruk en bildeanalyser programmer laget for å måle pixel intensitet.
    1. Bruk volum Rectangle Tool til å tegne en avkastning rundt skade området i enkeltcelle bildet. Bruk samme størrelse avkastning som måler bakgrunn fluorescens signalet i nucleoplasm ved siden av, men ikke overlapper med webområdene skade. Dette er viktig for normalisering av photobleaching knyttet til ikke-AC confocal mikroskop-systemet.
    2. For å måle fluorescens signaler ved hjelp av image analyseprogrammet, klikker du "Volum analyserapport" i verktøykassa. Et nytt vindu vises. I delen "Data å utfoldelse" Merk bare "Navn" og "Tetthet". Klikk "Ferdig" for å visualisere målinger.
    3. Eksportere verdiene til et regnearkprogram ved å klikke på tabellikonet funnet nederst på volum-vinduet og velg "Tabs (excel format)" for feltskilletegn og "Fil" eksportere mål for.
    4. For å få relative signaler, bruke regnearkprogrammet dele fluorescens intensiteten på skade området (kolonne 1) av det i kontrollen bakgrunn regionen (kolonne 2) i nucleoplasm og trekk fra 1 for normalisering.
  3. Sanntid kvantitative fluorescens tid-retters analyse av AC confocal mikroskopet
    1. Identifisere fluorescently merket protein-positive celler ved hjelp av mikroskop som i trinn 4.3.
    2. Utføre time-lapse fluorescens avbildning før skade og på ulike tidspunkt etter skade induksjon i punkt 4. Første trekke blekemiddel Avkastningen (for skade induksjon), og deretter velger den "Hent > tidsserier" undermenyen sett "Number" som 20 og "syklus forsinkelsen" som 30 s, velger "bleach en gang etter første avsøke" og deretter "start B". I dette tilfellet, er det første bildet kjøpt umiddelbart før skade induksjon, etterfulgt av 19 bilde oppkjøp med 30 s intervaller. Intervaller ("syklus forsinkelse") kan endres avhengig av formålet av studien.
    3. Når bildeopptak er fullført, klikk "Betyr", og trekke Avkastningen på regionen skade. Klikk "Vis tabell" for å få en tabell over intensiteten i de valgte ROIs. Normaliserer dataene ved å dele fluorescens intensiteten av skade området på ulike tidspunkt av intensiteten av det samme området før skade og trekke fra 1.

7. liten påvirkes RNA (siRNA) hva

Merk: Utarming av målet protein er en effektiv måte å avgrense oppstrøms faktor kravet for observert protein rekruttering skade områder (del 4). Videre strategien er den beste måten å ta spesifisiteten av et antistoff brukt for immunofluorescence påvisning (se seksjon 5).

  1. Dag 1: Forberede 2 brønner HeLa celler i en 24-vel plate av seeding 6-8 x 104 HeLa celler i 0,5 mL kultur medier i hver brønn, en for kontroll siRNA transfection og én for PARP1 siRNA (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3).
  2. Dag 2: Bekreft at cellene er ca 40-50% confluent. Utføre den første runden av siRNA hva: fortynne 5 pmol siRNA i 25 µL av serum-fri kultur medier, legge 3 µL lipider basert transfection reagensen inn i røret, bland forsiktig og ruge for 5-10 minutter til RT.
  3. Skyll cellene med 0,5 mL frisk kultur medier gang og holde cellene i 0,5 mL frisk kultur medier (se trinn 1.1).
  4. Legg RNA-lipid komplekser til cellene, og bland forsiktig ved å vippe rett frem og tilbake. Sett cellene tilbake i inkubator som i trinn 2.1.
  5. Sug opp transfection mix, og Legg til 0,5 mL frisk kultur medier (trinn 1.1) etter 6 h.
  6. Dag 3: Utføre andre runde i siRNA transfections (se trinn 7.2). Deretter frø 60-100% av cellene i en 35 mm gridded dekkglassvæske parabol som beskrevet i trinn 2.3.
  7. Dag 5: Fortsett med laser microirradiation med optimal laser makt betingelsen for maksimal rekruttering av faktor av interesse, som fastsatt i punkt 4. Vanligvis kan effektiv uttømming observeres i ca 60-90% av HeLa celler.
    Merk: Som et alternativ og komplementær tilnærming, hemmere, hvis tilgjengelig, kan brukes å hemme funksjonen av faktor interesse32,44. For å analysere effekten av hemme DDR signalering, legge til 20 µM PARP inhibitor, 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) hemmer eller 10 µM DNA-avhengige protein kinase inhibitor katalytisk delenhet (DNA-PKcs) og 10 µM ATM hemmer i dimethyl sulfoxide (DMSO) den retter 1t før skade induksjon. DMSO bare legge til kontroll celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruker PtK2 celler uttrykke stabilt EGFP-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP, ble laser inngangseffekt titrering gjennomført for å bestemme optimale tilstanden deres rekruttering (figur 1)32.

På høy input-makt laser skade områder, betydelig klynging av CPD (crosslinking skader vanligvis genereres av ultrafiolett (UV) skade) og GFP-NTH1 DNA glycosylase som spesielt gjenkjenner base skade ble observert. I tillegg ble høyere XRCC1 og CtIP signaler observert, reflekterer økt antall strand bryter, og demonstrerer at komplekse DNA skade er indusert under denne tilstanden (figur 2A). Andre DNA glycosylases smeltet fluorescerende proteiner (f.eks, GFP-nei endonuclease VIII som 2 (NEIL2) og GFP-8-Oxoguanine glycosylase (OGG1)) og condensin jeg kan også brukes som base skade markører44,59. I samsvar med dette, vi fant at PAR svaret er betydelig indusert av høy inndata-makt laser (dvs., energi og Irradians i fokus spot i prøven), men svakt ved lav laser makt i fokus spot (figur 2B, øverst til venstre). PAR signaler, men ikke PARP1 protein lokalisering, på skade steder var følsom for den PARP inhibitor (data ikke vist). I tillegg siRNA spesifikke for PARP1 redusert både PAR og PARP1 på skade områder (figur 2B, øverst til høyre)32. Under forutsetning av høy inngangseffekt, γH2AX vises først på skade nettsteder, og sprer seg raskt til hele kjernen i en ATM/DNA-PK-avhengige måte (figur 2B, bunnen). Lignende ATM/DNA-PK-avhengige spredning av γH2AX ble rapportert γ-bestråling60. Konsekvente resultater ble oppnådd med både 800 og 780 nm NIR laser systemer32. Sammen resultatene viser at det er mulig å sjarmere laser inngangseffekt (og derfor energi og Irradians i fokus spot i cellen) å finne betingelsene som induserer ulike grader av PARP svar samkjøre med antall DSBs og kompleksiteten i DNA-skade.

Over resultatene foreslått opprinnelig at tilstedeværelsen av komplekse DNA skade kan ha forårsaket differensial rekruttering av 53BP1 og TRF2. Interessant, men var 53BP11220-1711 rekruttering til en strømsparende skade området effektivt hemmet av tilstedeværelsen av andre skade området indusert av høy inngang-effekt i samme cellekjernen (figur 3A i motsetning til figur 3B ). Resultatene tyder på at høy-input-kraft laser skade undertrykker 53BP1 rekruttering i trans. Hemming av PÅLYDENDE av PARP hemmer samt hemming av kjernefysiske hele γH2AX sprer seg ATM/DNA-PK hemmere gjenopprette denne rekruttering til høy inngangseffekt skade området (figur 3A). Dette er forskjellig fra rekruttering av megler av DNA skade Checkpoint 1 (MDC1) til skade nettsteder, som hovedsakelig var hemmet av γH2AX spredning, og derfor ble restaurert av ATM/DNA-PK hemmere, ikke PARP hemmer (figur 3A, bunnen). Viktigere, hyperactivation på linje ved PARG hemming (uten å påvirke γH2AX status) effektivt undertrykkes første 53BP1 rekruttering selv på lav input-power skade nettsteder som normalt rekruttere 53BP1 effektivt (figur 3B)32. Til sammen disse resultatene indikerer at PAR signalering, og ikke hvilken skade per se, forstyrrer rekrutteringen av 53BP132. Dette er et eksempel på allsidigheten av laser microirradiation, som tillater oss å undersøke hvordan flere skade områder innflytelse og samhandle med hverandre.

Figure 1
Figur 1 : Titrering laser input makt. For å bestemme laser makt til å bruke for senere eksperimenter, PtK2 celler uttrykke stabilt EGFP-53BP1 og TRF2-YFP ble utsatt for laser microirradiation med input krefter varierer mellom 20 mW og 155 mW bruker 800 nm NIR laser/invertert epi-fluorescensen mikroskopet system. EGFP-53BP1 rekruttering blitt overvåket i 15 min post bestråling (pi), mens TRF2-YFP celler ble fulgt i 6 min p.i. Tallene direkte ovenfor barer representerer antall celler som viste positiv rekrutteringen av EGFP-53BP1 eller TRF2-YFP til skade nettsteder over antall celler testet. Dette tallet ble endret fra Saquilabon Cruz32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Induksjon av komplekse skade og robust DDR signalering av høy inndata-makt laser. (A) høy-input-kraft laser microirradiation induserer komplekse skader inkludert strand bryter (SSBs og DSBs) og crosslinking base skade. CPD, XRCC1 (SSB og DSB reparasjon), NTH1 DNA glycosylase (BER) og CtIP (alternativ NHEJ og HR) vises (bare GFP-NTH1 er en levende celle image og resten er observert etter immunofluorescence flekker). Kvantitativ fluorescens intensitet målinger av skade nettstedet rekruttering ble gjort som nevnt i avsnitt 7-protokollen og vises i boxplots. Antall celler (n) testet ses under hver kvantifisert protein. p-verdien < 0,05. (B) Top (venstre): Robust PAR og PARP1 signaler på høy input-power skade områder. Toppen (til høyre): PARP1 siRNA uttømming er tilstrekkelig til å avskaffe PAR signal32,44. Bunnen: Tid kurs analyse av γH2AX i cellene med lav (øverst) og høy (nederst) input makt skade som angitt. Skalere barer = 10 µm. Dette tallet ble endret fra Saquilabon Cruz32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Differensiell aktivisering DDR signalnettverk påvirker 53BP1 rekruttering skader områder. (A) topp: PtK2 celler stabilt uttrykke EGFP-53BP11220-1711 var microirradiated med både lav (15%) og høy (25%) input makt (hvit og gul pilspisser, henholdsvis) i samme kjernen bruker 780 nm NIR/AC confocal mikroskop system. Dette ble utført i nærvær av DMSO PARP hemmer (Pi) eller kombinasjonen av ATM, DNA-PK og PARP hemmere (Ai + Di + Pi) som indikert. Live-celle avbildning av EGFP-53BP11220-1711 tatt på 30 min DSB induksjon. Cellene ble deretter fast og farget med et antistoff spesifikke for γH2AX som en DSB markør. Endringer av fluorescens intensiteten av EGFP-53BP11220-1711 på skade nettsteder vises på høyre side med p-verdier (mener verdier er: DMSO 0,03 ± 0,02; PI, 0.34 ± 0,19; AI + Di + Pi, 0.98 ± 0,23). Bunnen: Effekten av Pi og Ai + Di behandling på MDC1 lokaliseringen med høy input-power skade som indikert. Skala er 10 µm. Høyre: Endringer av fluorescens signaler av MDC1 på høy inngang-effekt skade områder i nærvær av DMSO, Pi eller Ai + Di med p-verdier (mener verdier er: DMSO 0,07 ± 0,10; PI, 0,05 ± 0,07; AI + Di, 0,86 ± 0.26). Skala bar = 10 µm. N = 10 for hver intensitet måling. (B) effekten av forsterkning av PAR signaler av PARGi behandling på endogene 53BP1 rekruttering til lav input-power skade områder. Høyre: Boxplots representerer kvantitativ analyse av endogene 53BP1 rekruttering (oppdaget av immunofluorescence flekker) med lav input-makt laser (60 mW i 800 nm NIR laser/invertert epi-fluorescens mikroskop systemet) på 15 min post bestråling i nærvær av DMSO eller PARGi som angitt. Venstre: PAR og 53BP1 immunofluorescence flekker bilder av celler skadet under samme vilkår med DMSO eller PARGi. DMSO behandling, 100% av celler undersøkt (N = 25) utstilt robust 53BP1 rekruttering (til høyre). Derimot 20/25 viste ingen 53BP1 rekruttering i nærvær av PARGi (nederst til høyre) og 5 celler viste svak rekruttering. Skala bar = 10 µm. Dette tallet ble endret fra Saquilabon Cruz32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordelene med å bruke laser microirradiation for DDR forskning er:

1. det er mulig å indusere forskjellige mengder DNA skade fra enkel strand bryter komplekse DNA skade og for å oppdage ulike reparasjon faktorer i DNA skade områder ved å justere laser irradiation parameterne. Det er også mulig å påføre skade flere ganger i samme cellekjernen for å vurdere trans effekter (som i Figur 3).

2. viktigst, kan hendelser som skjer på skade områder og sekundære hendelser som skjer andre steder i kjernen lett skilles.

3. det er mulig å gjennomføre høyoppløselig sanntid målinger av fluorescently merket protein dynamics Svar å skade på en enkelt cellenivå, inkludert, men ikke begrenset til: han selvmord resonans energi overføring (bånd), fluorescens levetid Imaging ( FLIM), par korrelasjon funksjon (pCF), etc., for å fange DDR i levende celler.

4. Kombinere med RNA forstyrrelser eller hemmer, er det relativt enkelt å teste oppstrøms faktor krav i et lite antall celler.

5. det skal også bemerket at NIR (eller grønn) laserstråling krever ikke før sensibilisering DNA med nukleotid analogs eller DNA-intercalating fargestoffer, dermed unngår uønskede bivirkninger på chromatin pakking. Dette er det UV Lasersystemet som krever allergi på lav dose og forårsaker avvikende DDR på høy dose39,49,61.

Avgjørende skritt i protokollen/endringer og feilsøking
Det er viktig at cellene er i sunne arbeidsforhold når DDR analyser utføres for å minimere gjenstand og eksperimentell variasjoner. DNA - eller siRNA-transfekterte cellene er vanligvis mer følsom eller enkelt frittliggende som vokser på gridded dekkglassvæske. Det hjelper å holde celler for kortere ganger i transfection reagensen så lenge hva fungerer, og frø mer transfekterte celler på gridded dekkglassvæske parabolen sammenlignet untransfected cellene. Dette er nødvendig for å oppnå sammenlignbare celle confluences for eksperimenter.

Det har blitt rapportert at thymidine blokken fører til økte nivåer av γH2AX i synkroniserte celler62, som kan påvirke DDR og forskyve resultatene. Videre viste grunnlinjen γH2AX signalet seg å være høyere i S og G2/M fasen selv uten noen ytre skader63,64. Vi imidlertid følger ikke alle betydelig γH2AX signal i nucleoplasm som vil påvirke eller forstyrre bestemte γH2AX svaret på laser-indusert skade steder i cellene synkroniseres i S/G2 fase av en dobbel thymidine blokk51.

For å oppnå konsistente resultater, er det nødvendig å regelmessig kontrollere laser system utdataparametere (hver 2 til 4 uker) og optiske innretting (hver 2 måneder). Over tid, laser systemkomponentene må være nytt justert, linsen kan bli skadet og må byttes, og stabiliteten i totale inngangseffekt kan endres. Nøkkelen er å evaluere tilstedeværelsen av skade (crosslinking (CPD og/eller 6-4PP) og base skade (8-oxoG)), markør proteiner (f.eks, DNA-glycosylases, Rad51, cohesin og Ku) og PAR modifikasjon beskrevet i denne protokollen til å bestemme dosering og kompleksiteten i DNA skade forårsaket av laser mikroskop systemet brukes.

Begrensninger av teknikken
Laser microirradiation har begrensninger. DNA skade forårsaket av laserstrålen er svært gruppert i ett område i kjernen sammenlignet med naturlig forekommende skader som kan spres gjennom kjernen. Dette kan endre hvordan skade signalnettverk overføres i den nærliggende chromatin eller i kjernen. Siden et relativt lavt antall celler kan bli irradiated samtidig, kan ikke befolkningen-baserte biokjemiske analyser (f.eks, Western blot, protein kompleks rensing, chromatin immunoprecipitation (ChIP)) utføres enkelt. Avhengigheten fluorescently merket proteiner (med over uttrykk av eksogene rekombinante proteiner eller med de uttrykt endogenously bruker CRISPR-mediert tag innsetting) for dynamisk imaging gjør studiene sårbare protein fusion-indusert gjenstander. Den enestående naturen av laser-indusert skade og potensielle artifactual effekter av merket proteiner, derfor, må evalueres sammenliknet med resultatene med konvensjonelle DNA skade metoder (IR, kjemisk skadelige stoffer) og med den endogene ukodede proteiner (selv om noen ganger det ikke er mulig å utføre fullstendig parallelle eksperimenter).

Betydning når det gjelder eksisterende metoder
Bruk av sekvens-spesifikke endonucleases som-SceI, FokI, AsiSI og PpoI gir en alternativ strategi for å indusere stedsbestemte DSBs (strengt enkel DSBs). Faktor rekruttering eller modifikasjoner kan analyseres av stedsbestemte eller genomet hele ChIP analyse65,66,67,68,69. Relativt synkron induksjon av DSBs kan oppnås ved å merke endonuclease med en steroid hormon reseptor og et dårligere signal (degron) for rask kjernefysiske translokasjon og fornedrelse, henholdsvis65,66 , 67 , 68 , 69. man må ta hensyn, men som effektiviteten av endonuclease uttrykk og målet området tilgjengelighet, og pågående reparasjonsstatusen kan være variabel i forskjellige celler og på ulike steder. Disse heterogeneities vil være gjennomsnitt i befolkningen-baserte ChIP analyse, som kan forskyve resultatene. Laser microirradiation, derimot, tilbyr den høyeste timelige oppløsningen (millisekunder) og romlig oppløsning (submicrometer) på skade svar dynamikk, som kan analyseres på encellede nivå. Stor skade tetthet, men kan påvirke utfallet. Begge strategier kan være følsomme for objekter antistoff tilgjengelighet og/eller peptid merking. Derfor er det viktig å forstå fordeler og ulemper med begge strategier, som kan brukes til å utfylle hverandre.

Framtidige applikasjoner
Med raske utviklingen av fluorescens bildebehandling og dynamics teknikker, allsidighet av laser systemer å indusere ulike mengder og typer DNA skade på bestemte steder og celle syklus scene gir en verdifull mulighet til å lage mobilnettet og molekylær svar til DNA skade med høy spatiotemporal oppløsning på en enkelt celle-nivå. Det vil være mulig for eksempel å tease ut skade områdespesifikke og kjerne - og celle-brede DDR signal signaltransduksjon med millisekunds oppløsning (f.eksoppdage molekylære interaksjoner eller endringer som skjer utelukkende på skade områder, undersøke dynamiske endringer av chromatin strukturen i sanntid, eller observere sanntid spredning av skade signalnettverk fra skade områder til hele kjernen). Det er også mulig å følge den samme cellen over lang tid å undersøke effekten av DNA skade på cellen skjebne. Vi ser at laser microirradiation metoder, hvis brukt riktig, vil fortsette å bidra vesentlig til fremme av DNA reparasjon feltet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Akira Yasui på Tohoku University, Japan for GFP-NTH1 uttrykk plasmider og Dr. Eros Lazzerini Denchi ved Scripps Research Institute, La Jolla i California for TRF2-YFP og EGFP-53BP11220-1711 uttrykk plasmider. Dette arbeidet ble støttet av Air Force Office for forskning (FA9550-04-1-0101) og Beckman Laser Institute Inc. grunnlaget (for M.W.B), Ford Foundation fellesskap fra National Academy of Sciences (til B.A.S.), og NSF kalt MCB-1615701 og CRCC CRR-17-426665 (til K. Y.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Genetikk problemet 131 Laser microirradiation lasere i medisin DNA skade DNA skade svar DNA-reparasjon poly (ADP-ribose) utvalg (PARP) komplekse skade strand pauser base skade
Laser Microirradiation å studere <em>i Vivo</em> mobilnettet Svar å enkle og komplekse DNA skade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B.… More

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter