Summary
Цель настоящего Протокола заключается в описывается использование лазера microirradiation побудить различные типы повреждений ДНК, включая перерывы относительно простой нити и сложные повреждения, для изучения ДНК повреждения сигнализации и ремонт фактор Ассамблеи в местах повреждения в естественных условиях .
Abstract
Повреждение ДНК индуцирует конкретные ответы сигнализации и ремонт в ячейку, которая имеет решающее значение для защиты целостности генома. Лазерная microirradiation стал ценным экспериментальный инструмент для расследования в ДНК повреждения ответ (РДР) в естественных условиях. Это позволяет анализ в реальном времени с высоким разрешением одноклеточных макромолекулярных динамики в ответ на лазерно индуцированным ущерб ограничивается субмикронной регионом в ядре клетки. Однако без признания различий в типах индуцированного повреждения были использованы различные условия лазера. В результате, характер повреждения часто не является хорошо характеризуется или под контролем, вызывая явного несоответствия в вербовки или изменения профилей. Мы продемонстрировали, что различные облучения условий (т.е., различных длинах волн а также различных входных полномочия (irradiances) Фемтосекундные (fs) ближней ИК-области спектра (NIR) лазера) индуцированной различные DDR и ремонт сборки белков. Это отражает тип повреждения ДНК производства. Этот протокол описывает, как титрования входной мощности лазера позволяет индукции различных объемов и сложности повреждения ДНК, которая может легко контролироваться обнаружения базы и сшивки убытков, дифференциальные поли (АДФ рибоза) (PAR) сигнализации, и путь конкретных ремонт фактор сборки в местах повреждения. После того, как ущерб условия определяются, можно исследовать эффекты сложности различных повреждений и дифференциальные повреждения сигнализации, а также истощение вверх по течению factor(s) на любой фактор интереса.
Introduction
В естественных условиях Повреждения ДНК сигнализации является не вполне понятны
В естественных условиях, ДНК complexed с гистонами и другие факторы, чтобы волокна chromatin формы. Регулирование структуры хроматина имеет первостепенное значение для метаболизма ДНК. Например вариант гистон H2AX фосфорилированных мутировал атаксии телеангиэктазии (ATM) и другие киназы следующие двухнитевые разрывы индукции (DSB) и имеет важное значение для усиления сигнала DSB ущерб, а также обеспечение закрепления сайта для других факторов. Распространяя ущерб сигнализации и ремонта пути выбора, как представляется, быть критически под влиянием местных хроматина структуры в ущерб сайтов1. Количество chromatin remodeling факторов, сопровождающих гистона и изменения ферментов Гистон набираются действительно повредить сайты и имеют важное значение для эффективного восстановления ДНК, подчеркнув важность регулирования хроматина в ГДР и ремонт2 , 3 , 4. Кроме того, ущерб сайт кластеризации или перемещение было отмечено в дрожжей и дрозофилы5,6,,7,8, напоминает relocalization генных локусов в субатомные отсек, связанный с геном правила9,10. Недавние исследования в клетки человека и мыши также показали мобилизацию DSB сайтов, которые влияний ремонт верности и путь выбор11,12. В этой связи возникает возможность, что DDR/ремонт может также быть тесно связан с ядерной архитектуры, организации хроматина более высокого порядка и хромосомы динамика в ядре клетки. Таким образом крайне важно разработать методы с высоким разрешением для изучения DDR и ремонта процессов в контексте внутреннего ядерного среды в живой клетке для того чтобы понять кратко - и долгосрочной перспективе последствия повреждения ДНК.
Решающую роль НОМИНАЛЬНОЙ полимеразы (ПАРП) в измерении масштабов и тип повреждения и регулировании Ассамблеи белка в месте повреждения
PARP1-сенсор Ник ДНК быстро активированную повреждения ДНК, что играет решающую роль в ДНК ремонт13. PARP1 первоначально считалось функционировать вместе с рентген ремонт крест дополнение 1 (XRCC1) для облегчения ремонта база эксцизии (BER), но последние исследования показывают свою роль в другие ДНК ремонт пути, включая DSB ремонт14. Активирован PARP1 использует Никотинамидадениндинуклеотид (NAD+) как субстрат для ADP-ribosylate несколько целевых белков, включая себя саму. Этот фермент и других членов семьи привлекли большое внимание в последние годы как ингибиторы ПАРП появились как многообещающие лечебных препаратов для рака. Хотя первоначально битор PARP оказались эффективными в ген рака молочной железы (BRCA)-мутировал клеток рака молочной железы, в настоящее время существует множество доказательств для их эффекты в моно - и комбинация терапии вместе с ДНК повреждения агентов/облучения против широкий спектр рака с мутациями, не ограничиваясь BRCA15,16,,1718,19,20.
На молекулярном уровне активации ПАРП было показано играть решающую роль в организации местных хроматина структуры в местах повреждения. PAR-зависит от набора хроматина модификация ферментов способствует DSB ремонт и ремонт диктует выбор пути, предлагая роль важных лесов НОМИНАЛЬНОЙ модификации в местах повреждения. 13,21,,2223,24,25,26,27,28,29, 30,31 мы недавно продемонстрировали исключение белок p53-1 (53BP1) от повреждения сайтов PAR 32, обеспечивая Альтернативное объяснение для 53BP1-зависимых гиперактивацию (не гомологичных endjoining NHEJ), ПАРП ингибитора и подчеркнув значимость ПАРП в ДГЖД ремонт пути выбора33,34. PARP1 также непосредственно ремонт PARylates и влияет на активность нескольких ДНК факторов14.
Использование лазерной Microirradiation как инструмента для изучения DDR/ремонт в естественных условиях
Лазерная microirradiation производить субмикронных изменения отдельных хромосом впервые описано в 1969 году35 и подробно рассматривается в 1981 году36. Несколько десятилетий спустя, лазерная microirradiation было показано, чтобы вызвать повреждение ДНК на определенных субмикронной региона в ядре клетки и было доказано, чтобы быть полезен для изучения набора или изменения различных факторов поражения ДНК в vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. Этот метод позволяет обнаружение тех факторов, которые не образуют собственный облучения индуцированной очагов (IRIF) в ущерб сайтов39,42. Это также возможно для изучения динамики пространственно-временных хроматина структурных изменений как в местах повреждения, так и в остальной части ядра. Мы тщательно сравнить инвентаризацией, вызванных различными лазерных систем и ввода полномочия для оценки взаимосвязи между типом повреждения ДНК и microirradiation условий32,,4344, 45. Аномальным набора моделей 53BP1 и telomeric повторить связывание фактор 2 (TRF2) были замечены в ходе предыдущих исследований ущерб лазера, которые послужили основой для повторяющихся озабоченность для «не физиологические» Природа лазерного разрушения46 ,47,48,49. Мы обнаружили, что эти очевидных расхождений теперь может быть объяснено дифференциального ПАРП сигнализации, который измеряет количество и сложность индуцированных повреждений32. Мы подтвердили, что: 1) лазер microirradiated клетки (даже после высокой входной мощности облучения) арестованы в интерфазе образом ущерб контрольно-пропускной пункт управления зависимых и оставаться жизнеспособными (по крайней мере до 48 ч)32,50; и 2) ремонт фактор вербовки/модификации добросовестно повторить те с лечения с обычными ДНК повреждения агентов и DSB индукции под наблюдением эндонуклеазами32,,3942, 44,50,,5152. Эти результаты решительно поддерживают физиологические актуальность изучения лазерной повреждения индуцированных клеточных реакций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка основные клетки
Примечание: Этот шаг является для обнаружения стандартных иммунофлюоресценции эндогенного белка вербовки или модификации и для использования клеточной линии, стабильно выражая дневно тегами рекомбинантных белков. К примеру, Potorustridactylus (PtK2) эпителиальных клеток сумчатых почек стабильно выражая1220-1711 EGFP-53BP1 или TRF2-рекламы ЯФП были использованы в нашем предыдущем исследования (рис. 1)32. В первом случае, фокус, образуя региона 53BP1 (аминокислоты 1220-1711), содержащий олигомеризации домен, Тудор домена и набор зависящих от ubiquitylation (УДР) мотив, был сливается с расширенной GFP (1220-1711EGFP-53BP1). Этот синтез белка резюмирует ущерб сайт вербовки полнометражные 53BP153,54,55. В клетки HeLa дневно тегами субблоки когезинов (например, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52и GFP-SA2 51) должны быть стабильно выражены для обеспечения эффективного включения в комплекс и пилки S/G2 клеточного цикла фаза специфические повреждения сайта набор эндогенного когезинов51.
-
Семя любой тип адэрентных клеток на 35 мм тканевой культуры блюдо с сетчатая coverslip для идентификации отдельных клеток. Регулировать количество первоначальных клеток для достижения 60% confluency в 36-48 ч, основанный на скорость распространения конкретной клеточной линии. Например:
- Для сумчатых почек PtK2 эпителиальных клеток (дикого типа или тех, кто стабильно выражая1220-1711 EGFP-53BP1 или TRF2-рекламы ЯФП): плита 2.0 x 104 клетки в 2 мл Расширенный Основные средний минимум (MEM) дополнены 2 мм L-глютамином, 4% плода говядину сыворотка (ФБС) и антибиотики (100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл) и инкубировать при 37 ° C с 7% CO2.
- Для НеЬа клетки с стабильно выражая дневно меткой рекомбинантных белков GFP-SA2: семя 1.0 x 105 клеток в 2 мл Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) с 10% FBS, 2 мм L-глютамина, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл, и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2. Другие клетки HeLa может также использоваться в том числе неизмененной клетки или клетки, выражая hSMC1-GFP.
- Позволяют клеткам присоединиться и размножаться для 36-48 ч до ДНК повреждения индукции при впадении 30-60% (для обеспечения визуализации числа сетки). Перейдите к разделу 4.
2. Переходное Transfection
Примечание: Иногда хорошие антитела не доступны для обнаружения эндогенного белков. Если не доступны клеточных линий, стабильно выражая маркер белки, осуществляют переходных transfections для мониторинга дневно обозначенные протеины для анализа живой клетки.
- Клетки HeLa, день 1 семян 6-8 х 104 клетки в 0,5 мл культуры средств массовой информации в одной скважине 24-ну плиты и инкубировать в увлажненные инкубатор 100% при 37 ° C и с 5% CO2. Смотрите Шаг 1.1 для условий культуры средств массовой информации.
- День 2, используйте кодирования дневно тегами ДНК плазмида млекопитающих выражение ремонт фактор (например, GFP-NTH1 или GFP-OGG1 базовый урон32,5644,, GFP-ку для высокой дозы DSBs57, GFP-53BP1 32 для относительно простых DSBs, или других протеинов интереса, склеенный флуоресцентные метки) для выполнения липосомы опосредованной трансфекции ДНК. Разбавьте 0,3 мкг плазмидной ДНК в 25 мкл сыворотки свободной культуры средств массовой информации в 1,5 мл.
- В другой 1,5 мл разбавьте 1 мкл на основе липосом ДНК трансфекции реагента в 25 мкл сыворотки свободной культуры средств массовой информации и осторожно перемешать.
- Осторожно перемешать разреженных ДНК и трансфекции агент и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре (RT) в форму ДНК липидных комплексов.
- Один раз ополосните клетки с 0,5 мл культуры средств массовой информации, удалить средства массовой информации и добавить 0,5 мл свежего СМИ культуры клеток (как в шаге 1.1).
- Добавьте комплексов ДНК липидов клеток. Смешайте нежно покачиваясь пластину в несколько раз. Положите клетки обратно в инкубаторе как шаг 2.1.
- После 4-6 ч, извлеките носитель культуры из клеток и 300 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА. Удалить его, 200 мкл трипсина-ЭДТА и инкубировать в инкубаторе 37 ° C для 3-4 мин.
- После подтверждения, что отдельные клетки, добавить 800 мкл культуры средств массовой информации и Ресуспензируйте клетки, нежно закупорить разбить ячейки сгустки. Передавать 35 мм культуры блюдо с сетчатая coverslip суспензию клеток и добавить культуры средств массовой информации в окончательный объем 2 мл.
- Инкубировать клетки в инкубаторе как шаг 2.1 за 48 ч, затем перейдите к разделу 4.
Примечание: Если выражение Рекомбинантный белок является токсичным (transfected клеток показывают круглой или нерегулярных морфология после инкубации в шаге 2.8), сократить время выражение и выполнения лазерной microirradiation (раздел 4) в 16-20 ч после трансфекции, пока выражение протеина могут быть подтверждены (флуоресценции обнаружения, см. шаг 4.3). В этом случае выполняют трансфекции непосредственно в блюдо 35 мм. Семя 3.0 x 105 НеЬа клетки в 35 мм блюдо с сетчатая coverslip для достижения примерно 50-70% слияния после 30 ч Transfect ДНК плазмиды и изменить СМИ 2-6 ч после transfection. Продолжить с лазерной microirradiation 12-20 h позже, если выражение протеина является разумным и клетки появляются здоровыми.
3. клеточный цикл синхронизации
Примечание: Для гомологичная рекомбинация ремонт (HR) белков, таких как Rad51 и Когезин, набор более видное место в S/G2 фазе клеточного цикла, в котором HR ремонт занимает51место. Таким образом чтобы контролировать набор этих белков, необходим синхронизации клеток в S/G2 фазе.
-
S/G2 фазе синхронизации
- Используйте протокол блок двойной тимидина для синхронизации клеток в S/G2 фазе50,51. После заполнения ячеек в сетке coverslip блюдо 35 мм (см. шаг 1.1), инкубации клеток с тимидина (до конечной концентрации 2,5 мм) в культуре средств массовой информации (как в шаге 1.1) для 17 ч при 37 ° C и 5% CO2.
- Промойте клетки с 1 мл тимидин свободной культуры средств массовой информации (как в шаге 1.1) дважды и проинкубируйте клетки в 2 мл тимидин свободной культуры средств массовой информации для 9 h как шаг 1.1.
- Добавьте 200 мкл раствора 27,5 мм тимидина штока (растворяют в культуре средств массовой информации) в культуре СМИ с клетками в конечной концентрации тимидина 2,5 мм. Инкубировать клетки как шаг 3.1.1 для другой 15 h. полоскания и инкубации клеток в тимидин свободной культуры средств массовой информации для 4-6 ч и вызвать повреждение ДНК (раздел 4).
- Подтверждение эффективности синхронизации с помощью маркеров клеточного цикла (циклин A2 и B1 для S/G2 и G2, соответственно), S/G2 фазе ДНК повреждения ремонт факторов (например, Rad51 или когезинов), или путем включения (для S фазе клетки) ПИН/EdU51.
-
G1 фазе синхронизации
- Семян 6-8 х 104 клетки HeLa в 35 мм культуры блюдо с сетчатая coverslip (шаг 2.1).
- После 2 дней определите метафаза клетки, которые слегка поднял и круглые, под инвертированным микроскопом, используя цель 10 X и 10 X глазной линзы. Получение образов для записи положение метафаза клеток на сетке coverslip.
- После 3-4 ч подтвердите клеточного деления на 2 клетки дочи (в фазе G1) и вызвать повреждение ДНК (раздел 4).
4. титрование лазерной Потребляемая мощность
Примечание: В настоящем Протоколе, мы вызвать повреждение ДНК с помощью 780 нм импульсный fs NIR лазерная система придает Конфокальный микроскоп, или 800 Нм импульсный fs NIR лазера в сочетании с Перевернутый epi флуоресцентным микроскопом. Хотя мощность (фактическая освещенность на лазерной координационным центром в образец) необходимо побудить сопоставимых DDR отличается в этих системах, основной принцип тока титрования применимы к обоим, или любой, NIR систем32,57 . В situ энергии за лазерного импульса и пик освещенность на координационным центром для двух лазерных систем были в диапазоне 5.33-2-4 × 10 × 10-1 nJ и 7 × 1010-5.24 × 1011 Вт/см2, соответственно32.
- Включите лазер НИР и позволить системе лазерного нагрева за 1 час перед использованием.
- Поместите блюдо клеток на сцене с подогревом (37 ° C) в камере, что позволяет CO2 (5%) и контроль влажности (100%).
Примечание: Если камера CO2 не доступен, используйте CO2-независимые средства массовой информации культуры для до 5-6 ч. Если этап Отопление не доступен, держите клетки под микроскопом для < 20 мин и немедленно замените в инкубатор культуры ткани с надлежащей температуры, CO2и контроля влажности. Эти культуры условия могут меняться в зависимости от типа конкретной ячейки, а также организм наследования (например, млекопитающих и земноводных). - Для жить анализа клеток дневно тегами белков выберите GFP (450-490 Нм возбуждения, 515-586 Нм выбросов) или Cy3 фильтр (540-552 Нм возбуждения, выбросов > 590 нм) для GFP или плавленый mCherry белков, соответственно, с использованием 100 X или 63 X нефти погружения Цель.
- Поиск ячеек, которые имеют сопоставимые флуоресценции сигналов, отражающие сопоставимых уровней экспрессии белков. Избегайте клетки, которые имеют слишком слаб, или слишком сильное выражение для того, чтобы снизить изменчивость в ячейке в измерениях флуоресценции.
-
Титруйте входной мощности лазера.
- NIR лазер, 780 нм придается Конфокальный микроскоп
- Используйте функцию отбеливатель программного обеспечения для линейной треков внутри клеточного ядра для воздействия одного лазерного сканирования (512 x 512 пикселей, зум X1, отбеленные региона 50 x 4 пикселей, время нахождения пиксель 12.8 МКС, итерации x1) через цель нефти (100 X / 1,3 NA).
- Отрегулируйте процент передачи лазер (с использованием программно аппаратных, встроенный в систему Микроскоп лазера изготовителем) до 5% без изменения других параметров.
- Место ячейки в центре поля. Нажмите на регион интерес (ROI) инструмента и нарисовать линию или поле (примерно 50 x 4 пикселей) в ядре, с помощью мыши и нажмите кнопку «Блич», чтобы вызвать повреждение ДНК.
Примечание: В последующие облучения шаги, «обесцвечивание» следует увеличить с шагом 5% до 40% или до 100% при необходимости. - 800 Нм лазер NIR придает epi флуоресцентным микроскопом
- Контроль входной мощности через (63 X / 1.4 NA) фаза контраст масло погружения цель моторизованных вращением поляризации фильтра представил на пути луча и монтируется на контролируемой компьютером моторизованных вращательных этап32,39 , 58.
- Отрегулируйте угол поляризатора (°) и измерить входная мощность (МВт) ввод в Микроскоп, с помощью измерителя мощности лазера. Определите углы поляризатор, которые обеспечивают ввода полномочия в диапазоне от 20 МВт-155 МВт на 5-10 МВт шагом.
- Задайте угол поляризатор, который соответствует до 20 МВт мощности.
Примечание: Для нашей лазерной системы, если угол поляризатор 40 °, входная мощность-65 МВт. Увеличение мощности с шагом 5-10 МВт.
- NIR лазер, 780 нм придается Конфокальный микроскоп
- Для анализа живых клеток перейдите на шагах 6.1 и 6.3. Для обнаружения иммунофлюоресценции эндогенного белки или модификации перейдите к раздел 5. После анализа перейдите к шагу 4.7 для дальнейшего титрования мощности лазера. Анализировать требование вверх по течению фактор, перейдите к разделу 7.
Примечание: Набор BER и NHEJ факторов является быстрое (в течение нескольких минут) и переходные (< ~ 30 мин - 1 ч в зависимости от фактора и < ~ 4 h пост ущерб индукции, соответственно). Напротив набор факторов HR Rad51 и когезинов обнаруживаемая в ~ 30 мин - 1 h, и они, как правило, сохраняются более чем 8 h неустраненный ДНК поражения44,50,51. Таким образом необходимо изучить различные время очков после облучения для ремонта различных факторов. - Увеличить мощность на желаемый шагом (т.е., 5% для 780 NIR лазеров и 5-10 МВт для 800 NIR) как в шаге 4.4 и повторите шаги 4,5-4,7 на новый набор клеток для определения порога (50% от вербовки шоу поврежденных клеток) и пик (100% клеток шоу набор) для каждого белка.
5. иммунофлюоресценции пятнать
Примечание: для обнаружения ковалентных белка модификации, такие как PAR (сложные повреждения маркер) и H2AX фосфорилирования (γH2AX) (DSB маркер), а также Циклобутан пиримидина димер (CPD)/(6-4) фотопродуктов (6-4PP) и 8-oxoguanine (8-oxoG) (сшивки и Базовый урон маркеры, соответственно), клетки должна быть фиксированной и витражи с специфическими антителами. Кроме того лучше подтвердить результаты, полученные с тегами, дневно рекомбинантных белков обнаружение антител эндогенного белков, чтобы отличить артефактов, вызванных гиперэкспрессия рекомбинантных синтеза белков.
- Исправить клетки в разное время точках после повреждения индукции (шаг 4.5) в зависимости от факторов, заменив культуры средств массовой информации (см. шаг 1.1) 1,5 мл 4% параформальдегида/1 ПБС втечение 10 мин на RT.
Предупреждение: Параформальдегида паров токсичных и все должно быть сделано в вентилируемых зонта. - Удалите 4% параформальдегида/PBS и добавьте 1 мл 0,5% моющего средства/PBS 10 мин на RT.
- Удалить 0,5% моющего средства/PBS и промыть клетки с 2 мл PBS для 5 минут дважды и инкубации клеток в 2 мл блокирования решения (10% телячьей сыворотки, 1% BSA/PBS) за 1 ч на RT.
- Удалять блокирующие решение и добавить 2 мл PBS в клетки и заменить PBS с 250 мкл основное антитело раствор 3% BSA/PBS на ночь при 4 ° C или 1 ч на RT. использования 1: 200-разведение 1: 500 (типичные концентрации примерно 1 мкг/мл, эмпирически установлено) на наличие антител конкретные для различных маркеров ДНК повреждения (например, γH2AX/53BP1 (DSB); Ку (DSB, NHEJ); Rad51/когезинов (DSB, HR); ДСП/6-4PP (сшивки повреждения); 8-oxoG/ДНК glycosylases (например, NTH1) (базовый урон); PAR (высокие дозы сложные повреждения)).
- Удалить раствор антител и промыть 2 мл PBS для 5 минут дважды, удалить PBS и проинкубируйте с 250 мкл 0,1% вторичное антитело в 3% BSA/PBS на 1 ч в темноте на RT.
- Удаление решения вторичного антитела и добавить 2 мл PBS для 5 минут дважды и сохранить клетки в 1,5-2 мл PBS на 4 ° C для изображений в шагах 6.1 и 6.2.
6. количественные флуоресцентный анализ Immunostained или живых клеток
- Захват изображения окрашенных или живых клеток (n > 10) с помощью микроскопа, используемые для облучения. Для Микроскоп epi-флюоресценции использовать резолюции 1344 x 1 024 пикселей и сохранять изображения как файлы TIFF 16 бит. Для конфокального микроскопа используйте 1 крат; Аргоновый лазер для GFP/FITC, HeNe 594 лазер для Cy3/mCherry; 512 x 512 или 1024 x 1024 пикселей разрешение изображения; 5, номер скорость сканирования: 1 для быстрого сканирования или 2 + для усреднения несколько сканов улучшить соотношение сигнал-шум.
-
Использование анализа изображений, программы, предназначенные для измерения интенсивности пикселей.
- Используйте инструмент прямоугольник тома рисовать ROI вокруг повреждения сайта в отдельной ячейки изображения. Используйте тот же размер РУА измерения фонового сигнала флуоресценции в нуклеоплазмы рядом, но не перекрываются с сайтами, ущерб. Это имеет важное значение для нормализации Фотообесцвечивание, связанный с системой не конфокального микроскопа.
- Для измерения флуоресценции сигналов с помощью программы анализа изображений, нажмите кнопку «Громкость анализ отчет» в панели инструментов. Появится новое окно. В разделе «Для отображения данных» установите флажки только «Имя» и «Плотность». Нажмите кнопку «Готово», чтобы визуализировать измерения.
- Экспортируйте значения в программу электронных таблиц, нажав на значок таблицы, нашли в нижней части окна тома отчета и выберите «вкладки (excel формат)» для разделители полей и «Файл» для назначения экспорта.
- Для получения относительного сигналов, используйте программу электронной таблицы разделить интенсивности флуоресценции на месте повреждения (колонка 1), что в элементе управления фона региона (колонка 2) в нуклеоплазмы и вычесть 1 для нормализации.
-
Реальном времени количественные флуоресценции время курс анализ с использованием Конфокальный микроскоп
- Идентифицировать дневно тегами белка положительных клеток с помощью микроскопа как шаг 4.3.
- Выполните замедленной флуоресценции изображений до повреждения и в разное время точках после повреждения индукции в разделе 4. Сначала нарисуйте отбеливатель ROI (для индукции ущерб), а затем выберите «приобретать > временных рядов «подменю, установите «Номер» 20, а также «цикла задержки» как 30 s, выберите «Блич один раз после первого сканирования» и нажав кнопку «начать B». В этом случае первое изображение приобретается непосредственно перед ущерб индукции, следуют 19 изображений приобретений с интервалом 30 s. Интервалы («цикла задержки») могут быть изменены в зависимости от цели исследования.
- После завершения загрузки изображений, нажмите кнопку «Означает» и привлечь ROI в регионе ущерб. Нажмите кнопку «Показать таблицу», чтобы получить таблицу с перечислением интенсивности в пределах выбранного ROIs. Нормализовать данные путем деления интенсивности флуоресценции повреждения сайта в разное время точках по интенсивности этого же региона до повреждения и вычесть 1.
7. Малые вмешательство РНК (siRNA) Transfection
Примечание: Истощение целевого белка является эффективным способом определить требование вверх по течению фактор для набора наблюдаемых белка повредить сайты (раздел 4). Кроме того, эта стратегия является лучшим способом для решения специфичность антитела, используемые для обнаружения иммунофлюоресценции (см. раздел 5).
- День 1: Подготовьте 2 скважин клеток HeLa в пластине 24-Ну, посев 6-8 х 104 клетки HeLa в 0,5 мл культуры средств массовой информации в каждой скважине, один для управления siRNA transfection и один для PARP1 малых интерферирующих РНК (5'-CCG Ага AAT КТК TTA CCT CAA-3').
- День 2: Убедитесь, что клетки являются приблизительно 40-50% притока. Выполните первый раунд siRNA трансфекции: разбавить 5 пмоль малых интерферирующих РНК в 25 мкл сыворотки свободной культуры средств массовой информации, добавить 3 мкл липидов основанных трансфекции реагента в трубу, осторожно перемешать и проинкубируйте 5-10 мин на RT.
- Один раз ополосните клетки с 0,5 мл, свежие культуры средств массовой информации и сохранить клетки в 0,5 мл свежего культуры средств массовой информации (см. шаг 1.1).
- Добавьте комплексы РНК липидов в клетки и осторожно перемешать, наклоняя блюдо взад и вперед. Положите клетки обратно в инкубаторе как шаг 2.1.
- Аспирационная трансфекции микс и добавить 0,5 мл свежего культуры средств массовой информации (шаг 1.1) через 6 ч.
- День 3: Выполните второй раунд siRNA transfections (см. шаг 7.2). Затем семян 60-100% клеток в блюдо сетчатая coverslip 35 мм, как описано в шаге 2.3.
- День 5: Перейти с лазерной microirradiation с использованием оптимальной лазерной энергии условия для максимального набора фактора интереса, как определено в разделе 4. Как правило эффективный истощения можно наблюдать в примерно 60-90% клеток HeLa.
Примечание: В качестве альтернативы и взаимодополняющих подход, ингибиторы, если таковые имеются, может использоваться для подавления функции фактор интереса32,44. Для анализа влияния ингибирующих сигналов DDR, добавить 20 АБС битор PARP мкм, 1 мкм PAR glycohydrolase (PARG) ингибитор или 10 мкм ДНК зависимая протеинкиназа с ингибитором каталитическая субъединица (ДНК-PKcs) и 10 мкм ATM ингибитора в диметилсульфоксида (ДМСО) блюда 1 h до повреждения индукции. Добавьте ДМСО только клетки управления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью PtK2 клетки, стабильно выражая1220-1711 EGFP-53BP1 или TRF2-рекламы ЯФП, титрование входной мощности лазера была проведена определить оптимальные условия для их найма (рис. 1)32.
На высокий входной мощности лазерного ущерб сайтов наблюдались значительные кластеризации ДСП (сшивки повреждения обычно генерируемых ультрафиолетового (УФ) повреждения) а также glycosylase GFP-NTH1 ДНК, что конкретно признает базовый урон. Кроме того выше сигналы XRCC1 и CtIP были замечены, отражающие увеличение количество стренги перерывов и демонстрируя, что сложные повреждения ДНК индуцируется под это условие (рис. 2A). Другие glycosylases ДНК сливается с флуоресцентных белков (например, GFP-неи эндонуклеазы VIII-как 2 (NEIL2) и glycosylase GFP-8-Oxoguanine (OGG1)) а также condensin я также может использоваться как базовый урон маркеры44,59. В соответствии с этим, мы нашли что ответ PAR значительно индуцируется высокой ввода мощность лазера (то есть, энергии и освещенность в фокуса месте образца), но только слабо, мощность лазера низкой в фокуса месте (Рисунок 2B, слева сверху). PAR сигналов, но не PARP1 белка локализации, в местах повреждения были чувствительны к АБС битор PARP (данные не показаны). Кроме того, siRNA, специфических для PARP1 уменьшилась PAR и PARP1 в местах повреждения (Рисунок 2B, вверху справа)32. В условиях высокой входной мощности γH2AX изначально появляется в местах повреждения и быстро распространяется на весь ядра образом ATM/ДНК-PK-зависимый (Рисунок 2Б, внизу). Подобные ATM/ДНК-PK-зависимой распространение γH2AX было сообщено для γ-облучения60. Согласованные результаты были получены с 800 и 780 нм NIR лазерных систем32. Взятые вместе, результаты показывают, что это можно титровать входной мощности лазера (и, следовательно, энергии и освещенность в месте фокуса в ячейку) чтобы найти условия, которые вызывают различные степени реагирования ПАРП, соотнося с количество DSBs и сложность повреждения ДНК.
Вышеуказанные результаты первоначально предложил, что наличие сложных повреждений ДНК может быть причиной дифференциального набора 53BP1 и TRF2. Интересно однако, 53BP11220-1711 набора на маломощных ущерб сайт был эффективно тормозится наличием второго сайта повреждения, вызванные высокой Ввод мощность в ядре же клетки (Рисунок 3А в отличие от рисунок 3B ). Результаты показывают, что высокий Ввод мощность лазера ущерб подавляет 53BP1 набора в транс. Ингибирование НОМИНАЛЬНОЙ АБС битор PARP, а также торможение-широкий γH2AX распространение ATM/ДНК-PK ингибиторы восстановить этот набор даже к месту повреждения высокий входной мощности (Рисунок 3А). Это отличается от набора посредника ДНК повреждения контрольно-пропускного пункта 1 (MDC1) повреждения сайты, которые главным образом тормозится γH2AX дисперсии и поэтому был восстановлен ATM/ДНК-PK ингибиторы, не ПАРП ингибитора (рис. 3A, внизу). Важно отметить, что гиперактивацию НОМИНАЛЬНОЙ ингибитированием PARG (не затрагивая γH2AX статус) эффективно подавляется набора первоначальных 53BP1 даже на сайтах низкая мощность входного повреждения, которые обычно эффективно набирать 53BP1 (рис. 3B)32. Вместе взятые, эти результаты показывают что PAR сигнализации, а не тип повреждения per se, мешает с набором 53BP132. Это пример универсальность лазерных microirradiation, который позволяет нам изучить как множественные повреждения сайтов влияют и взаимодействуют друг с другом.
Рисунок 1 : Титрование лазера Потребляемая мощность. Чтобы определить мощность лазера для дальнейших экспериментов, PtK2 клетки, стабильно выражая EGFP-53BP1 и TRF2-рекламы ЯФП были подвергнуты лазерные microirradiation с ввода державами, колеблется от 20 МВт и 155 МВт с использованием 800 Нм NIR лазер/Перевернутый epi флуоресценции система микроскопа. EGFP-53BP1 набор был контроль за 15 мин пост облучения (ПЗ), в то время как TRF2-рекламы ЯФП клетки последовали за 6 мин п.и. Непосредственно над решеткой цифры количество ячеек, которые показали позитивные набора сайтов ущерб EGFP-53BP1 или TRF2-рекламы ЯФП над общее количество клеток испытания. Эта цифра была изменена с Saquilabon Крус32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Индукция сложного повреждения и надежной передачи сигналов DDR лазером высокая мощность входного. (A)-мощность высокого входного лазерного microirradiation индуцирует комплекс ущерб, включая перерывы Стрэнд (DSBs и рабочего тормоза РСРТ), сшивки и базовый урон. ДСП, XRCC1 (ремонт SSB и DSB), glycosylase NTH1 ДНК (BER) и CtIP (альтернативная NHEJ и HR) отображаются (только GFP-NTH1 представляет собой изображение живых клеток и остальные наблюдаются после окрашивания иммунофлюоресценции). Измерения интенсивности количественных флуоресценции ущерб сайт вербовки были сделаны, как указано в протоколе статья 7 и приведены в boxplots. Общее количество клеток (n) испытания можно увидеть под каждой количественных белка. p-значение < 0,05. (B) сверху (слева): надежные PAR и PARP1 сигналы на высокую мощность входного ущерб сайтов. Вверху (справа): PARP1 siRNA истощения является достаточным для отмены НОМИНАЛЬНОЙ сигнал32,44. Внизу: Время курс анализа γH2AX в клетках с низкой (вверху) и высокой (внизу) входного питания ущерб, как указано. Масштаб баров = 10 мкм. Эта цифра была изменена с Saquilabon Крус32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Дифференциальные активации сигнализации DDR влияет на 53BP1 набора повредить сайты. (A) Top: PtK2 клетки, стабильно выражая EGFP-53BP11220-1711 были microirradiated с низким (15%) и высокой (25%) входная мощность (белые и Желтые стрелки, соответственно) в ядре же, используя система NIR/Конфокальный микроскоп 780 нм. Это была проведена в присутствии ДМСО, ПАРП ингибитор (Pi), или сочетание ATM, ДНК-PK и иы АБС битор PARP (Ai + Di + Pi) как указано. Жить Клеточная томография EGFP-53BP11220-1711 был захвачен в 30 мин после индукции DSB. Клетки были затем фиксированной и витражи с антител специфических для γH2AX как маркер DSB. Показаны изменения интенсивности флуоресценции1220-1711 EGFP-53BP1 в местах повреждения на право с p-значения (значения означает: ДМСО, 0,03 ± 0,02; Пи, 0.34 ± 0,19; AI + Di + Pi, 0.98 ± 0,23). Внизу: Эффект от лечения Pi и Ai + Di MDC1 локализации с высокой входной мощности ущерб как указано. Линейки-10 мкм. Справа: Изменения флюоресценции сигналов MDC1 на высокую мощность входного повредить сайты присутствии ДМСО, Pi или Ai + Di с p-значения (значения означает: ДМСО, 0.07 ± 0.10; Пи, 0,05 ± 0,07; AI + Di, 0,86 ± 0,26). Шкалы бар = 10 мкм. N = 10 для каждого измерения интенсивности. (B) эффект повышения НОМИНАЛЬНОЙ сигналов по PARGi лечения на эндогенных 53BP1 набора сайтов низкий входной мощности повреждения. Справа: Boxplots, представляющий количественного анализа эндогенных 53BP1 набор (обнаружены путем пятнать иммунофлюоресценции) с низкой ввода мощность лазера (60 МВт в 800 Нм NIR лазер/Перевернутый epi флуоресцентным микроскопом системе) в 15 мин пост облучения присутствии ДМСО или PARGi как указано. Слева: PAR и 53BP1 иммунофлюоресценции, окрашивание фотографии клеток повреждены при тех же условиях с ДМСО или PARGi лечения. Для лечения ДМСО, 100% клеток изучены (N = 25) выставлены надежные 53BP1 набор (справа). В отличие от этого 20/25 показал найма не 53BP1 присутствии PARGi (внизу справа) и 5 клеток показали слабые вербовки. Шкалы бар = 10 мкм. Эта цифра была изменена с Saquilabon Крус32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущества использования лазерной microirradiation для DDR исследований являются:
1. целесообразно побудить различные типы и количество ДНК повреждения от простых стренги перерывы сложные повреждения ДНК, и обнаружить ремонт различных факторов в ДНК повреждения сайты, регулируя параметры лазерного облучения. Это также возможно наносить ущерб несколько раз в ядре же клетки с целью оценить эффекты транс (как показано на рис. 3).
2. Важно отметить, что события, происходящие в местах повреждения и вторичные события, которые происходят в других местах в ядре можно легко отличить.
3. это можно осуществить с высоким разрешением в реальном времени измерения динамики дневно тегами белка в ответ на повреждение на уровне отдельной ячейки, включая, но не ограничиваясь: Фёрстер резонанс энергии передачи (лад), флуоресценции жизни Imaging ( FLIM), пара корреляционная функция (ФКП), и т.д., чтобы захватить DDR в живых клетках.
4. Сочетание с РНК интерференции или ингибитор лечения, это относительно простой способ проверить вверх по течению фактор требование в небольшое количество клеток.
5. Следует также отметить, что НДК (или зеленый) лазерного излучения не требует предварительной сенсибилизации с аналогами нуклеотидов ДНК или ДНК, интеркалирующие красители, таким образом избегая нежелательных побочных эффектов на упаковке хроматина. Это в отличие от УФ лазерной системы, которая требует сенсибилизации при низкой дозе и заставляет аномальные DDR в высокой дозе39,,4961.
Важнейшие шаги в рамках протокола/модификации и устранение неполадок
Важно, что клетки находятся в здоровых условиях, когда DDR анализы проводятся для того, чтобы свести к минимуму артефакт и экспериментальной вариации. ДНК - или малых интерферирующих РНК transfected клеток обычно являются более чувствительными или легко отдельностоящий при выращивании на сетке coverslip. Это помогает сохранить клетки для короче раз в трансфекции реагент, покуда трансфекции работает и семена более transfected клеток на сетке coverslip блюдо, по сравнению с untransfected клеток. Это необходимо для достижения сопоставимых клеток слияниях для экспериментов.
Сообщается, что блок тимидина приводит к повышению уровня γH2AX в синхронизированных клеток62, которые могут повлиять на DDR и исказить результаты. Кроме того сигнал базовой линии γH2AX было показано выше в S и G2/M фазе даже без каких-либо внешних повреждений63,64. Мы, однако, не соблюдают любые значительные γH2AX сигнал в нуклеоплазмы, которые могли бы повлиять на или вмешиваться с конкретным γH2AX ответ на участках лазерного разрушения в клетках синхронизированы в S/G2 фазе двойной тимидина блок51.
Для получения согласованных результатов, необходимо периодически проверять лазерной системы выходных параметров (каждые 2 до 4 недель) и оптическое выравнивание (каждые 2 месяца). Со временем лазерные компоненты системы может потребоваться повторно унифицированных, объектив может быть поврежден и должны быть заменены, и стабильность общей входной мощности может измениться. Ключ должен оценить наличие повреждения (сшивки (ДСП или 6-4PP) и базовый урон (8-oxoG)), маркер белков (например, ДНК-glycosylases, Rad51, Когезин и КУ) и НОМИНАЛЬНОЙ изменения, описанные в этом протоколе с целью определить дозировку и сложность повреждения ДНК, вызванные лазерный микроскоп система используется.
Ограничения метода
Лазерная microirradiation имеет ограничения. Повреждения ДНК, вызванные лазерный луч очень сосредоточены в одной области в ядре, по сравнению с естественным ущерб, который может распространиться на ядро. Это может измениться, как повреждения сигнализации распространяется в соседних хроматина или в ядре. Поскольку относительно небольшое количество клеток может быть облученных в одно время, Популяционно ориентированные биохимических анализов (например, Западная помарка, комплекс очищение протеина, иммунопреципитации chromatin (обломока)) не может быть легко выполнена. Опора на дневно тегами белков (с над выражением экзогенных рекомбинантных белков или даже с теми выразил эндогенно с помощью вставки ТРИФОСФАТЫ опосредованной тегов) для динамических изображений делает исследования уязвимых фьюжн индуцированного белка артефакты. Уникальная природа лазерного разрушения и потенциальные последствия артефакты tagged белков, поэтому, должны оцениваться по сравнению с результатов с использованием обычных ДНК повреждения методы (IR, повреждающих агентов химического) и эндогенных непомеченным белков (хотя иногда это не позволяет выполнить полный параллельные экспериментов).
Значение в отношении существующих методов
Использование последовательности конкретных эндонуклеазами-SceI, Фоки, AsiSI и PpoI обеспечивает альтернативную стратегию побудить участкам DSBs (строго простой DSBs). Фактор вербовки или модификации могут быть проанализированы по участкам или геном всей чип анализ65,66,67,68,69. Относительно синхронных индукции DSBs может быть достигнуто путем пометки эндонуклеазы с рецепторов стероидных гормонов и деградации сигнала (degron) для быстрого ядерной транслокации и деградации, соответственно,6566 , 67 , 68 , 69. один должны принимать во внимание, однако, что эффективность эндонуклеазы выражение и доступность целевого сайта, и статус текущего ремонта может быть переменной в разных ячейках и на различных целевых объектах. Эти неоднородностей будет усредняться в анализе на основе населения чип, который может исказить результаты. Лазерная microirradiation, с другой стороны, предлагает максимальным временным разрешением (в миллисекундах), а также пространственное разрешение (субмикронной) ущерб ответ динамики, которые могут быть проанализированы на уровне одной ячейки. Плотность высокий урон, однако, могут повлиять на результат. Обе эти стратегии могут быть чувствительны к артефактов, вызванных антитела доступности и/или пептид пометки. Таким образом, важно понять плюсы и минусы обеих стратегий, которые потенциально могут быть использованы для дополнения друг друга.
Будущие приложения
Быстрое развитие флуоресценции изображений и методы динамики, универсальность лазерных систем побудить различные объемы и виды повреждения ДНК в определенных местах и стадии клеточного цикла обеспечивает ценную возможность допросить сотовой и молекулярные ответы на ДНК повреждения с высоким пространственно-временных резолюции на уровне отдельной ячейки. Можно, например, дразнить из повреждения участкам и ядро - и клеток широкий DDR сигнала трансдукция с резолюцией миллисекунды (например, обнаружить молекулярных взаимодействий или изменения, которые происходят исключительно в местах повреждения, изучить динамические изменения структуры хроматина в режиме реального времени, или наблюдать в реальном времени распространения ущерба сигнализации от повреждения сайтов в целом ядро). Это также можно следовать той же клетке в течение долгого времени для изучения последствий повреждения ДНК на судьбу клеток. Мы предполагаем, что лазерные методы microirradiation, если они используются правильно, продолжит в значительной степени способствовать улучшению поля ремонта ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Акира Ясуи в Университете Тохоку, Япония для плазмида GFP-NTH1 выражение и доктор Eros Lazzerini Denchi на Scripps научно-исследовательский институт, Ла-Хойя, Калифорния TRF2-рекламы ЯФП и EGFP-53BP11220-1711 выражение плазмид. Эта работа была поддержана военно-воздушных сил управлением научных исследований (FA9550-04-1-0101) и Институт лазерной Бекман Inc. Фонд (для M.W.B), Стипендия Фонда Форда в национальной академии наук (до B.A.S) и NSF MCB-1615701 и CRCC КАБ-17-426665 (для к. Г.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 | Coherent Inc. | Mira 900 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | |
| 63X/1.4 NA objective | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
| Compact Rotation Stage | Newport Corp | PR50PP | |
| Temperature Controller | Warner | TC-344B | |
| Heating System | Ibidi | 10918 | |
| Gas Incubation System | Ibidi | 11920 | |
| Laser Power and Energy Meter (RoHS) | Coherent | FieldMaxII-TOP | |
| ORCA-R2 Digital CCD Camera | Hamamatsu | C10600 | |
| LSM 510 META Laser Scanning Microscopes | Carl Zeiss | ||
| 100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
| 35mm Gridded Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
| PtK2 kidney epithelial cells | ATCC | CCL 56 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| DMEM | Life Technologies | 11885-092 | |
| CO2-Independent Medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| Advanced MEM | Life Technologies | 12492-013 | supplemented with L-Glutamine, 4% FBS |
| penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | 15140122 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Thymidine | SIGMA | T9250 | |
| serum free media (Opti-MEM I Reduced Serum Media) | Fisher Scientific | 11058021 | |
| Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) | Kamiya Biomedical Company | MC-062 | |
| Anti-XRCC1 (mouse ) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
| Anti-53BP1 (rabbit) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
| Anti-CtIP (rabbit) | Abcam | ab70163 | |
| Anti-PAR polymers (mouse) | Enzo Life Sciences | BML-SA216-0100 | |
| Anti-PAR (rabbit) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
| Anti-TRF2 (mouse) | Novus Biological | NB100-56506 | |
| Anti 6-4PP (mouse) | Kamiya Biomedical | ||
| Anti-Rad21 (Rabbit) (for cohesin detection) | generated in Yokomori (KY) lab | ||
| Anti-Rad51 (Rabbit) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8349 | |
| Anti-Ku70 (mouse) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
| 8-oxiguanine | Trevigen, Inc. | ||
| Anti-PARP1 (Rabbit) | generated in KY lab | ref 43 | |
| Anti-hCAPG (Rabbit) (for condensin detection) | generated in KY lab | ref 42 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
| Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
| HiPerFect siRNA Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| GFP-SMC1 stable cell line | generated in KY lab | ref 49 | |
| GFP-NEIL2 stable cell line | generated in KY lab | ref 54 | |
| GFP-NTH1 stable cell line | generated in KY lab | ref 32 | |
| GFP-SMC1 plasmid | generated in KY lab | ||
| GFP-Ku plasmid | generated in KY lab | ||
| Anti-MDC1 (rabbit) | Novus Biologicals | NB100–395 | |
| Anti-gH2AX (rabbit) | Millipore | 07–164 | |
| EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| TRF2-YFP PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
| PARG inhibitor | Trevigen | 4680-096-03 | |
| DNA–PKcs inhibitor NU7026 | Sigma | N1537 | |
| ATM inhibitor KU55933 | Calbiochem | 118500 | |
| Olaparib | Apexbio Technology | A4154 | |
| Paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
| Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | image analysis program |
| Excel | microsoft | spreadsheet program | |
| Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium | Fisher Scientific | 14200166 | dilute to 1X |
References
- Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
- van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
- Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
- Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
- Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
- Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
- Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
- Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
- Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
- Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
- Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
- Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
- Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
- Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
- Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
- Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
- Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
- Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
- Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
- Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
- Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
- Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
- Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
- Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
- Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
- Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
- Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
- Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
- Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
- Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
- Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
- Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
- Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
- Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
- Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
- Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
- Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
- Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
- Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
- Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
- Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
- Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
- Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
- Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
- Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
- Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
- Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
- Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
- Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
- Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
- Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
- Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
- MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
- Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
- Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
- Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
- Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
- Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).
