Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Laser Microirradiation att studera In Vivo cellulära svar till enkla och komplexa DNA-skador

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56213
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2,3,4, 1
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

Målet med detta protokoll är att beskriva hur man använder laser microirradiation att framkalla olika typer av DNA-skador, inklusive relativt enkla strand raster och komplex skada, att studera DNA skador signalering och reparation faktor församlingen vid skada platser i vivo .

Abstract

DNA-skada inducerar specifika signalering och reparation reaktioner i cellen, vilket är avgörande för skyddet av genomet integritet. Laser microirradiation blev ett värdefullt experimentella verktyg att undersöka i DNA skador svar (DDR) i vivo. Det tillåter enskild cell-högupplösta realtidsanalys av makromolekylära dynamics svar på laser-inducerad skada begränsas till en submicrometer region i cellkärnan. Dock har olika laser villkor använts utan uppskattning av skillnader i typer av skada inducerad. Som ett resultat, arten av skadan är ofta inte väl karakteriserade eller kontrolleras, orsakar uppenbar inkonsekvenser i rekrytering eller modifiering profiler. Vi visat att olika bestrålningsvillkoren (dvs, olika våglängder samt olika ingående befogenheter (irradiances) av en (fs) nära infrarött (NIR) femtosecondlaser) inducerad distinkta DDR och reparation protein församlingar. Detta återspeglar typ av DNA-skador som produceras. Det här protokollet beskriver hur titrering av laser ineffekt tillåter induktion av olika belopp och komplexiteten i DNA-skador, som enkelt kan övervakas genom påvisande av bas och crosslinking skador, differentiell poly (ADP-ribos) (PAR) signalering, och väg-specifika reparation faktor församlingar på skada platser. När skador villkoren bestäms, är det möjligt att undersöka effekterna av olika skador komplexitet och differentiell skada signalering samt utarmning av uppströms faktorer på någon faktor av intresse.

Introduction

In Vivo DNA skador signalering är inte förstått
In vivo, DNA är komplex med histoner och andra faktorer till formuläret kromatin fibrer. Reglering av kromatinstruktur är av avgörande betydelse för DNA ämnesomsättning. Till exempel är Histon varianten H2AX fosforyleras av ataxi-telangiektasi muterat (ATM) och andra kinaser följande dubbel-strand breaks (DSB) induktion, och är viktigt för DSB skada signal förstärkning samt att ge en för webbplats för andra faktorer. Fördelningen av skador signalering och reparation väg val verkar påverkas kritiskt av lokala kromatinstruktur på skada platser1. Ett antal kromatin remodeling faktorer, Histon chaperones och Histon ändra enzymer rekryteras verkligen skada platser och är viktiga för effektiv DNA-reparation, belyser betydelsen av kromatin förordning i DDR och reparera2 , 3 , 4. Dessutom skada webbplatsen klustring eller ompositionering observerades i jäst och drosophila5,6,7,8, som påminner om relocalization gen loci i den subnuclear fack associerade med gen förordning9,10. Nyligen genomförda studier i mus och mänskliga celler visade också mobilisering av DSB platser, vilka influenser reparera trohet och väg val11,12. Det väcker möjligheten att DDR och reparera kan även intimt kopplas till nukleära arkitektur, högre ordningens kromatin organisation och kromosom dynamics i cellkärnan. Därför är det avgörande att utveckla högupplösta metoder för att studera DDR och processer i samband med den endogena nukleär miljön i en levande cell reparation för att förstå kort - och långsiktiga konsekvenserna av DNA-skador.

Avgörande roll för PAR-polymeras (PARP) i mäta omfattningen och typen av skada och reglerar Protein montering på webbplatsen skador
PARP1 är en DNA nick sensor snabbt aktiveras av DNA-skador som spelar en avgörande roll i DNA reparation13. PARP1 ursprungligen tänkt att fungera tillsammans med röntgen reparera Cross kompletterar 1 (XRCC1) att underlätta base excision repair (BER), men senare studier avslöja dess roll i andra DNA reparation vägar, däribland DSB reparation14. Aktiverad PARP1 använder nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) som substrat till ADP-ribosylate flera målprotein, inklusive sig själv. Detta enzym och andra familjemedlemmar har uppmärksammats mycket på senare år som PARP-hämmare har uppstått så lovande terapeutiskt läkemedel mot cancer. Även om PARP-hämmare initialt befanns vara effektivt i bröstcancergenen (BRCA)-muterat bröstcancerceller, finns det nu en uppsjö av bevis för deras effekter i mono- och kombination terapi tillsammans med DNA skada agenter/bestrålning mot ett brett spektrum av cancer med mutationer inte begränsat till BRCA15,16,17,18,19,20.

På molekylär nivå visades PARP aktiveringen att spela avgörande roller i att organisera den lokala kromatinstrukturen på skada platser. PAR-beroende rekrytering av kromatin modifiering enzymer underlättar DSB reparation och dikterar reparera väg val, att föreslå viktiga byggnadsställningar roll PAR modifiering vid skada platser. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 vi nyligen visat uteslutandet av p53-bindande protein 1 (53BP1) från skador platser av PAR 32, att ge en alternativ förklaring för 53BP1-beroende överaktivering av icke-homolog endjoining ( NHEJ) av PARP-hämmare och lyfta fram betydelsen av PARP i DSB reparera väg val33,34. PARP1 också faktorer direkt PARylates och påverkar aktiviteten av flera DNA reparation14.

Använda Laser Microirradiation som ett verktyg för att studera DDR och reparera In Vivo
Laser microirradiation att producera sub micron ändringar på enskilda kromosomer först beskrevs i 196935 och granskas i detalj i 198136. Flera decennier senare, laser microirradiation visades att inducera DNA-skador på en definierad submicrometer region i cellkärnan och visade sig vara en värdefull teknik att studera rekrytering eller ändringar av olika faktorer DNA lesioner i vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. denna metod kan upptäcka de faktorer som inte utgör distinkta bestrålning-inducerad foci (IRIF) vid skada platser39,42. Det är också möjligt att undersöka spatiotemporal dynamiken i kromatin strukturella förändringar både på skada platser och i resten av kärnan. Vi jämförde noggrant de Identifieringsdataposter som induceras av olika lasersystem och input befogenheter att utvärdera förhållandet mellan typ av DNA-skador och de microirradiation villkor32,43,44, 45. De avvikande rekrytering mönster av 53BP1 och telomeric upprepa bindande faktor 2 (TRF2) observerades i de tidigare laser skada studier, som utgjorde basen för den återkommande oro för ”icke-fysiologisk” laser-inducerad skada46 ,47,48,49. Vi hittade att dessa uppenbara skillnader nu kunde förklaras av differentiell PARP signalering som mätare mängden och komplexiteten av inducerad skada32. Vi bekräftade att: 1) laser-microirradiated celler (även efter hög input-power bestrålning) grips i interphasen på ett sätt som skador checkpoint kontroll-beroende och förbli lönsamt (åtminstone upp till 48 h)32,50; och 2) reparation faktor rekrytering/ändringar troget sammanfatta dem som observerats med behandling med konventionella DNA skadande agens och DSB induktion av endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. Dessa resultat stöder starkt den fysiologiska betydelsen av studera laser skador-inducerad cellulära svar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. grundläggande Cell förberedelse

Obs: Detta steg är för standard immunofluorescens detektion av endogen protein rekrytering eller modifiering och för användning av en cellinje stabilt uttrycker en fluorescently märkta rekombinant protein. Till exempel studie Potorustridactylus (PtK2) pungdjur njure epitelceller stabilt uttrycker andra-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP användes i vår tidigare (figur 1)32. I det förstnämnda fallet, fokus bildar regionen av 53BP1 (aminosyra 1220-1711) som innehåller domänen oligomerisering, Tudor domänen och ubiquitin-beroende rekrytering (UDR) motivet, var smält till förbättrad GFP (andra-53BP11220-1711). Detta fusionsprotein recapitulates skada webbplatsen rekrytering av den hellånga 53BP153,54,55. I HeLa cells uttryckas fluorescently märkta subenheter av cohesin (t.ex., hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52och GFP-SA2 51) stabilt att säkerställa effektivt införlivande i anläggningen och att sammanfatta S/G2 cellcykeln fas-specifik skada webbplatsen rekrytering av den endogena cohesin51.

  1. Utsäde någon fastsittande celltyp på en 35 mm vävnadsodling skålen med ett inrutade täckglas för enskild cell identifiering. Justera den inledande mobilnummer för att uppnå 60% konfluens i 36-48 h baserat på andelen spridning av viss cell linje. Till exempel:
    1. För PtK2 pungdjur njure epitelceller (vildtyp eller de som stabilt uttrycker andra-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP): plattan 2.0 x 104 celler i 2 mL avancerade minst viktigt Medium (MEM) kompletteras med 2 mM L-glutamin, 4% fostrets nötkreatur serum (FBS) och antibiotika (100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin), och inkubera vid 37 ° C med 7% CO2.
    2. För HeLa celler med stabilt uttrycker fluorescently taggade rekombinanta proteiner GFP-SA2: utsäde 1,0 x 105 celler i 2 mL Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin, och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2. Andra HeLa-cellerna kan också användas inklusive omodifierade celler eller celler som uttrycker hSMC1-GFP.
  2. Tillåta celler att följa och föröka för 36-48 h innan DNA skador induktion på 30-60% confluence (att tillåta visualisering av antalet rutnät). Fortsätt till avsnitt 4.

2. övergående Transfection

Obs: Ibland bra antikroppar finns inte att upptäcka de endogena proteinerna. Om cellinjer stabilt uttrycker markör proteiner inte är tillgängliga, utföra övergående transfections att övervaka fluorescently märkta proteiner för levande cell analyser.

  1. För HeLa cells, dag 1, utsäde 6-8 x 104 celler i 0,5 mL kultur media i ett väl platta 24-väl och inkubera i en 100% befuktade inkubator vid 37 ° C och med 5% CO2. Se punkt 1.1 för kultur media villkor.
  2. Dag 2, Använd en däggdjur uttryck plasmid kodning en fluorescently märkta DNA reparation faktor (t.ex., GFP-NTH1 eller GFP-OGG1 för GRUNDSKADA32,44,56, GFP-Ku för hög dos DSBs57, GFP-53BP1 32 för relativt enkla DSBs eller andra proteiner av intresse smält till fluorescerande tagg) att utföra Liposom-medierad DNA transfection. Späd 0.3 µg plasmid DNA in 25 µL serum-fri kultur media i en 1,5 mL tub.
  3. I en annan 1,5 mL röret, späd 1 µL Liposom-baserad DNA transfection reagens in 25 µL serum-fri kultur media och blanda försiktigt.
  4. Blanda den utspädda DNA och transfection agenten försiktigt och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur (RT) till formuläret DNA-lipid komplex.
  5. Skölj celler med 0,5 mL odlingssubstrat en gång, ta bort materialet och lägga till 0,5 mL färsk kulturmassmedia i cellerna (som i steg 1.1).
  6. Lägg till DNA-lipid komplexen i cellerna. Blanda försiktigt genom att gunga plattan några gånger. Sätta cellerna tillbaka i inkubatorn som i steg 2.1.
  7. Efter 4-6 h, ta bort kultur media från cellerna och tillsätt 300 µL 0,05% Trypsin-EDTA. Ta bort den, tillsätt 200 µL Trypsin-EDTA, och inkubera i 37 ° C inkubator för 3-4 min.
  8. Efter att ha bekräftat att cellerna är fristående, lägga till 800 µL kulturmassmedia och resuspendera cellerna av försiktigt pipettering att bryta upp cell klumpar. Överföra cellsuspensionen till en 35 mm kultur skålen med ett inrutade täckglas och lägga till kultur media till en slutlig volym av 2 mL.
  9. Inkubera cellerna i inkubatorn som i steg 2.1 för 48 h, sedan gå vidare till avsnitt 4.
    Obs: Om uttrycket av rekombinant protein är giftiga (transfekterade celler Visa runda eller oregelbundna morfologi efter inkubation i steg 2,8), förkorta uttryck och utför laser microirradiation (avsnitt 4) på 16-20 h efter transfection så länge som den proteinuttryck kan bekräftas (för fluorescens detektering, se steg 4,3). I det här fallet utför transfection direkt i 35 mm skålen. Utsäde 3.0 x 105 HeLa celler i en 35 mm skålen med ett inrutade täckglas att uppnå cirka 50-70% sammanflödet efter 30 h. Transfect DNA plasmider och ändra media 2-6 h efter transfection. Fortsätt med laser microirradiation 12-20 h senare om proteinuttryck är rimligt och celler visas friska.

3. cellcykeln synkronisering

Obs: För homolog rekombination reparation (HR) proteiner, såsom Rad51 och cohesin, rekrytering är mer framträdande i S/G2 fas i cellcykeln, i vilken HR reparation tar plats51. Således, för att övervaka rekryteringen av dessa proteiner, cell synkronisering till S/G2 fas är nödvändigt.

  1. S/G2 synkroniseringsfas
    1. Använda dubbel tymidin block protokollet för cell synkronisering till S/G2 fas50,51. Efter sådd cellerna i en 35 mm inrutade täckglas maträtt (se steg 1.1), inkubera cellerna med tymidin (till en slutlig koncentration av 2,5 mM) i kultur media (som i steg 1.1) för 17 h vid 37 ° C och med 5% CO2.
    2. Skölj cellerna med 1 mL Tymidinanalog-fri kultur media (som i steg 1.1) två gånger och inkubera cellerna i 2 mL Tymidinanalog-fri Odlingsmedier för 9 h som i steg 1,1.
    3. Tillsätt 200 µL av 27,5 mM tymidin stamlösning (upplöst i kultur media) i kultur media med celler till en slutlig koncentration av 2,5 mM tymidin. Inkubera cellerna som i steg 3.1.1 för en annan 15 h. Skölj och inkubera cellerna i Tymidinanalog-fri Odlingsmedier för 4-6 h och inducerar DNA-skador (avsnitt 4).
    4. Bekräfta synkroniseringen effektivitet med hjälp av cellcykeln markörer (cyklin A2 och B1 för S/G2 och G2, respektive), S/G2 fas-specifik DNA skador reparation faktorer(t exRad51 eller cohesin), eller genom IdU/EdU inkorporering (för S fas celler)51.
  2. G1 synkroniseringsfas
    1. Utsäde 6-8 x 104 HeLa celler i en 35 mm kultur skålen med inrutade täckglas (steg 2.1).
    2. Efter 2 dagar, identifiera metafas celler, som är något upplyft och runda, under en inverterade Mikroskop använder 10 X-objektiv och 10 X okulär linser. Hämta bilder för att spela in positionen för metafas celler på det inrutade täckglaset.
    3. Efter 3-4 h, bekräfta celldelning i två dottercellerna (i G1-fasen) och inducerar DNA-skador (avsnitt 4).

4. titrering av Laser ineffekt

Obs: I detta protokoll, vi inducerar DNA-skador med en 780 nm pulsade fs NIR lasersystem kopplade till confocal Mikroskop eller en 800 nm pulsade fs NIR laser kopplad till en inverterad påljusfluorescens mikroskopet. Ineffekt (faktiska irradians på laser kontaktpunkten i preparatet) behövs för att framkalla jämförbara DDR är olika i dessa system, är den grundläggande principen av ineffekt titrering tillämpliga på båda, eller någon, NIR system32,57 . I situ energin per laser puls och peak irradians på kontaktpunkt för två lasersystem var i intervallet 5,33 × 10-2-4 × 10-1 nJ och 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, respektive32.

  1. Slå på NIR laser och laser systemet ska värma upp för 1 h före användning.
  2. Placera en maträtt av celler på en uppvärmd (37 ° C) scen i en kammare som tillåter CO2 (5%) och fuktkontroll (100%).
    Obs: Om en CO2 kammare inte finns, använda CO2-oberoende Odlingsmedier för upp till 5-6 h. Om en värme scen inte finns, hålla cellerna under lupp för < 20 min och omedelbart ersätta i vävnadsodling inkubatorn med rätt temperatur, CO2och fuktstyrning. Dessa odlingsbetingelser kan variera beroende på den specifika celltypen som används samt organismen av härledning (t.ex., däggdjur kontra amfibier).
  3. För levande cell analys av fluorescently märkta proteiner, Välj en god Jordbrukarsed filter (450-490 nm excitation, 515-586 nm utsläpp) eller Cy3 filter (540-552 nm excitation, > 590 nm utsläpp) för god Jordbrukarsed eller mCherry-smält protein, respektive, med en 100 X eller 63 X oljeimmersion mål.
  4. Söka efter celler som har jämförbara fluorescens signaler, reflekterande jämförbara nivåer av proteinuttryck. Undvika celler som har för svag eller för stark uttryck för att minska cell till cell variabilitet i fluorescens mätningar.
  5. Titrera den laser ineffekten.
    1. 780 nm NIR laser bifogas confocal Mikroskop
      1. Använd funktionen programvara blekmedel för att rikta linjär spår inuti cellkärnan för exponering för enda laser scannar (upplösning 512 x 512 pixlar, zoom X1, blekt regionen 50 x 4 pixlar, 12,8 µs pixel dröjtiden, iteration x1) genom syftet olja (100 X / 1.3 NA).
      2. Justera laser överföring procentandelen (med hjälp av mjukvara/hårdvara som byggts in i systemet med laser i Mikroskop av tillverkaren) 5% utan att ändra några andra inställningar.
      3. Placera en cell i mitten av fältet. Klicka på regionen i intresse (ROI) verktyg, och rita en linje eller en låda (ca 50 x 4 pixlar) i kärnan med hjälp av musen och klicka på knappen ”blekmedel” inducerar DNA-skador.
        Obs: I efterföljande bestrålning steg, ”blekning” bör ökas i steg om 5% till 40% eller upp till 100% om det behövs.
      4. 800 nm NIR laser kopplad till epi-fluorescens Mikroskop
      5. Styra ineffekt genom en (63 X / 1.4 NA) oljeimmersionsobjektivet i fas kontrast av motoriserad rotation av en polarisation filter infördes strålgång och monterad på en datorstyrd motordrivna roterande scenen32,39 , 58.
      6. Justera polarisator vinkel (°) och mäta den tillförd effekt (mW) in mikroskopet, använder en laser kraftmätare. Bestämma polarisator vinklar som ger ingående befogenheter som sträcker sig från 20 mW-155 mW på 5-10 mW steg.
      7. Ställa in polarisator vinkeln som motsvarar till 20 mW tillförd effekt.
        Obs: För våra lasersystem, om polarisator vinkeln är 40 °, den tillförda effekten är 65 mW. Öka ineffekt med 5-10 mW steg.
  6. För levande cell analys, gå till steg 6.1 och 6.3. Fortsätt till avsnitt 5 för immunofluorescens detektion av endogena proteiner eller ändringar. Efter analysen, gå till steg 4,7 för ytterligare titrering av laser makt. För att analysera kravet uppströms faktor, gå till avsnitt 7.
    Obs: Rekrytering av BER och NHEJ faktorer är snabb (inom några minuter) och övergående (< ~ 30 min - 1 h beroende på faktor och < ~ 4 h inlägget skada induktion, respektive). Däremot rekrytering av HR faktorer Rad51 och cohesin detekteras på ~ 30 min - 1 h och de tenderar att kvarstå mer än 8 h vid oreparerade DNA lesioner44,50,51. Således är det nödvändigt att undersöka olika tid punkter bokför bestrålning för olika reparation faktorer.
  7. Öka ineffekt med önskad minut (dvs.5% för 780 NIR laser och 5-10 mW för 800 NIR) som i steg 4,4 och upprepa steg 4,5-4,7 på en ny uppsättning av celler att bestämma tröskelvärde (50% av skadade celler Visa rekrytering) och peak (100% av celler Visa rekrytering) för varje protein.

5. immunofluorescens färgning

Obs: för detektion av kovalent protein modifiering, såsom PAR (komplex skada markör) och H2AX fosforylering (γH2AX) (DSB markör), samt cyclobutane pyrimidin dimer (CPD)/(6-4) ljusprodukter (6-4PP) och 8-oxoguanine (8-oxoG) (crosslinking och basera skada markörer, respektive), celler måste vara fast och färgade med specifika antikroppar. Dessutom är det bäst att bekräfta de resultat som erhålls med de fluorescently märkta rekombinanta proteinerna av av endogena proteiner, att skilja artefakter som induceras av överuttryck av rekombinant fusionsproteinerna påvisande av antikroppar.

  1. Fixa celler vid olika tidpunkter efter skada induktion (steg 4,5) beroende på vilka faktorer genom att ersätta kultur media (se steg 1.1) med 1,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD/1 X PBS för 10 min vid RT.
    Försiktighet: PARAFORMALDEHYD ångorna är giftiga och allt arbete bör göras i ett ventilerat dragskåp.
  2. Ta bort 4% PARAFORMALDEHYD/PBS och tillsätt 1 mL 0,5% tvättmedel/PBS i 10 min på RT.
  3. Ta bort 0,5% tvättmedel/PBS och skölj celler med 2 mL PBS för 5 min två gånger och inkubera cellerna i 2 mL blockerar lösning (10% kalvserum, 1% BSA/PBS) för 1 h på RT.
  4. Ta bort blockering lösning och tillsätt 2 mL PBS till cellerna och ersätta PBS med 250 µL primär antikropp lösning 3% BSA/PBS övernattning på 4 ° C eller 1 h på RT. användning en 1: 200-1: 500 utspädning (typisk koncentration ungefär 1 µg/mL, empiriskt fastställt) för antikroppar specifika för olika DNA skador markörer (t.ex., γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); CPD/6-4PP (crosslinking skador); 8-oxoG/DNA glycosylases (t.ex., NTH1) (bas skador); PAR (hög dos komplex skada)).
  5. Ta bort antikropp lösningen och skölj med 2 mL PBS för 5 min två gånger, ta bort PBS och inkubera med 250 µL 0,1% sekundär antikropp i 3% BSA/PBS för 1 h i mörker vid RT.
  6. Ta bort sekundär antikropp lösningen och tillsätt 2 mL PBS för 5 min två gånger och hålla celler i 1,5-2 mL PBS vid 4 ° C för imaging i steg 6.1 och 6.2.

6. kvantitativa fluorescens analys av Immunostained eller levande celler

  1. Fånga bilder av färgade eller levande celler (n > 10) genom Mikroskop används för bestrålning. För påljusfluorescens Mikroskop system, Använd 1 344 x 1,024 Pixel upplösning och spara bilder som TIFF 16-bitars filer. För confocal Mikroskop, Använd 1 X förstoring; Argon laser för GFP/FITC, HeNe 594 laser för Cy3/mCherry; 512 x 512 eller 1 024 x 1 024 bildpunkter för bildupplösning; Skanna hastighet 5, antal: 1 för snabb skanning eller 2 + för genomsnitt över flera genomsökningar för att förbättra signal-brus-förhållande.
  2. Använd en bildanalys program utformat för att mäta pixel intensitet.
    1. Använd verktyget volym rektangel ritas en ROI runt webbplatsen skador i enskild cell bilden. Använd samma storlek ROI för att mäta bakgrund fluorescens signalen i nukleoplasman intill, men inte överlappande med skador webbplatser. Detta är viktigt för normalisering av fotoblekning förknippas med icke-confocal Mikroskop systemet.
    2. För att mäta fluorescens signaler med hjälp av bild analys programmet, klickar du på ”volym analys rapport” Funna i verktygslådan. Ett nytt fönster visas. Under avsnittet ”Data att visa” bara du kryssrutorna ”namn” och ”täthet”. Klicka sedan på ”klar” för att visualisera mätningarna.
    3. Exportera värdena till ett kalkylblad genom att klicka på tabellikonen hittade längst ned i rapporten volym fönstret och välj ”flikar (excel format)” för fältavgränsare och ”fil” för exportera Destination.
    4. För att få relativ signaler, Använd kalkylbladsprogrammet att dela fluorescensintensiteten på webbplatsen skador (kolumn 1) av som i kontrollen bakgrund region (kolumn 2) i nukleoplasman och subtrahera med 1 för normalisering.
  3. Realtid kvantitativa fluorescens tidsförlopp analys med hjälp av mikroskopet confocal
    1. Identifiera fluorescently märkta proteinet-positiva celler använda mikroskopet som i steg 4,3.
    2. Utföra time-lapse fluorescens imaging innan skador och vid olika tidpunkter efter skada induktion i avsnitt 4. Först Rita blekmedel ROI (för skada induktion), och välj sedan den ”förvärva > tidsserien” undermeny, ange ”nummer” som 20 och ”cykel förseningen” som 30 s, Välj ”bleka en gång efter första sökningen” och sedan klicka på ”start B”. I det här fallet förvärvas den första bilden omedelbart före skadan induktion, följt av 19 bild förvärv 30 s intervall. Intervall (”cykel fördröjning”) kan ändras beroende på syftet med studien.
    3. När bild förvärv är klar, klicka på ”betyder” och rita ROI på regionen skador. Klicka på ”Visa tabell” för att få en tabell över intensiteten inom de valda ROIs. Normalisera data genom att dividera fluorescensintensiteten hos webbplatsen skador vid olika tidpunkter av intensiteten i samma region innan skador och subtrahera med 1.

7. små stör RNA (siRNA) Transfection

Obs: Utarmning av målproteinet är ett effektivt sätt att avgränsa kravet uppströms faktor för observerade protein rekrytering att skada platser (avsnitt 4). Strategin är dessutom det bästa sättet att ta itu med en antikropp som används för identifiering av immunofluorescens specificitet (se avsnitt 5).

  1. Dag 1: Förbereda 2 brunnar i HeLa celler i en 24-well platta genom sådd 6-8 x 104 HeLa cells i 0,5 mL kultur media i varje brunn, en för kontroll siRNA transfection och en för PARP1 siRNA (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3').
  2. Dag 2: Bekräfta att cellerna är cirka 40-50% konfluenta. Utföra den första omgången av siRNA transfection: Späd 5 pmol siRNA in 25 µL serum-fri kultur media, Lägg till 3 µL lipider baserat transfection reagens i röret, blanda försiktigt och inkubera i 5-10 min på RT.
  3. Skölj cellerna med 0,5 mL färsk kultur media en gång och hålla cellerna i 0,5 mL färsk kulturmassmedia (se steg 1.1).
  4. Lägga till RNA-lipid komplexen i cellerna, och blanda försiktigt genom att vinkla skålen och tillbaka. Sätta cellerna tillbaka i inkubatorn som i steg 2.1.
  5. Aspirera transfection mixen och Lägg till 0,5 mL färsk kulturmassmedia (steg 1.1) efter 6 h.
  6. Dag 3: Utför den andra omgången av siRNA transfections (se steg 7,2). Sedan frö 60-100% av cellerna i en 35 mm inrutade täckglas skålen som beskrivs i steg 2,3.
  7. Dag 5: Fortsätt med laser microirradiation med optimal laser power villkoret för maximal rekrytering av faktorn av intresse, som bestäms av avsnitt 4. Normalt kan effektivt utarmning observeras i cirka 60-90% av HeLa cells.
    Obs: Som alternativ och kompletterande tillvägagångssätt, inhibitorer, om tillgängligt, kan användas att hämma funktionen av faktorn för intresse32,44. För att analysera effekten av att hämma DDR signalering, lägga 20 µM PARP-hämmare, 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) hämmare eller 10 µM DNA-beroende proteinkinas med katalytisk subenhet (DNA-PKcs) hämmare och 10 µM ATM-hämmare i dimetyl sulfoxid (DMSO) till den rätter 1 h före skada induktion. Lägg till DMSO till kontroll celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Använder PtK2 celler som stabilt uttrycker andra-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP, utfördes laser ineffekt titreringen för att bestämma den optimala villkoren för deras rekrytering (figur 1)32.

Vid platser med hög input-power laser skada den signifikant klustring av CPD (crosslinking skada normalt genereras av ultraviolett (UV) skador) samt GFP-NTH1 DNA glykosylas som uttryckligen erkänner bas skador observerades. Dessutom observerades högre XRCC1 och CtIP signaler, vilket återspeglar det ökade antalet strand raster, och visar att komplexa DNA-skador är induceras under detta villkor (figur 2A). Andra DNA glycosylases smält till fluorescerande proteiner (t.ex., GFP-nei Amiiiiin VIII-liknande 2 (NEIL2) och GFP-8-Oxoguanine glykosylas (OGG1)) samt condensin jag kan också användas som bas skador markörer44,59. Konsekvent med detta, Vi hittade att PAR svar framkallas betydligt av hög input-power laser (dvs, energi och irradians i focal plats i preparatet), men endast svagt av låg lasereffekten i focal plats (figur 2B, överst till vänster). PAR signaler, men inte PARP1 protein lokalisering, vid skada platser var känsliga för PARP-hämmare (inga data anges). Dessutom siRNA specifika för PARP1 minskade både PAR och PARP1 vid skada platser (figur 2B, överst till höger)32. Under hög ineffekt villkora, γH2AX visas först på skada platser och sprider sig snabbt till hela kärnan i ett ATM/DNA-PK-beroende sätt (figur 2B, botten). Liknande-ATM/DNA-PK-beroende som fördelningen av γH2AX rapporterades för γ-strålning60. Konsekventa resultat erhölls med både 800 och 780 nm NIR laser system32. Sammantaget resultaten avslöjar att det är möjligt att titrera laser ineffekt (och därför energi och irradians i focal plats i cellen) att hitta villkoren som inducerar olika grader av PARP svar korrelerar med antalet DSBs och komplexiteten i den DNA-skadan.

Ovanstående resultat föreslog ursprungligen att förekomsten av komplexa DNA-skador kan ha orsakat differentierad rekrytering av 53BP1 och TRF2. Intressant, dock hämmades 53BP11220-1711 rekrytering till en låg effekt skadan webbplats effektivt av förekomsten av webbplatsen för andra skador som orsakas av hög-ingång-power i samma cellkärnan (figur 3A i motsats till figur 3B ). Resultaten tyder på att hög-ingång-power laser skada dämpar 53BP1 rekrytering i trans. Hämning av PAR av PARP-hämmare samt hämning av kärn-wide γH2AX spridning av ATM/DNA-PK-hämmare återställning denna rekrytering även till webbplatsen hög ineffekt skador (figur 3A). Detta är skild från rekrytering av medlare av DNA skada Checkpoint 1 (MDC1) till skada webbplatser som primärt hämmades av γH2AX spridning och därför återställdes av ATM/DNA-PK-hämmare, inte PARP hämmare (figur 3A, botten). Ännu viktigare, överaktivering av PAR av PARG hämning (utan att påverka γH2AX status) effektivt undertryckta inledande 53BP1 rekrytering även vid låg input-power skada webbplatser som normalt rekrytera 53BP1 effektivt (figur 3B)32. Sammantaget dessa resultat indikerar att PAR signalering, och inte typ av skada i sig., stör rekrytering av 53BP132. Detta är ett exempel på mångsidigheten hos laser microirradiation, som tillåter oss att undersöka hur flera skador platser påverkar och interagerar med varandra.

Figure 1
Figur 1 : Titrering av laser ineffekt. För att avgöra laser befogenhet att använda för framtida experiment, PtK2 celler som stabilt uttrycker andra-53BP1 och TRF2-YFP utsattes för att laser microirradiation med ingående befogenheter varierar mellan 20 mW och 155 mW med de 800 nm NIR laser/inverterad påljusfluorescens Mikroskop system. ANDRA-53BP1 rekrytering övervakades för 15 min post bestrålning (PI), medan TRF2-YFP celler följdes under 6 min p.i. Siffrorna direkt ovanför staplarna representerar antalet celler som visade positiva rekrytering av andra-53BP1 eller TRF2-YFP till skada platser över det totala antalet celler som testas. Denna siffra ändrades från Saquilabon Cruz32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Induktion av komplexa skador och robust DDR signalering av hög input-power laser. (A) hög-ingång-power laser microirradiation inducerar komplex skada inklusive strand raster (både SSBs och DSBs), crosslinking och bas skador. CPD, XRCC1 (SSB och DSB reparation), NTH1 DNA glykosylas (BER) och CtIP (alternativa NHEJ och HR) visas (endast GFP-NTH1 är en levande cell bild och resten observeras efter immunofluorescens färgning). Kvantitativa fluorescens intensitet mätningar av skada webbplatsen rekryteringen skedde som anges i protokollet avsnitt 7 och visas i boxplots. Det totala antalet celler (n) testade kan ses under varje kvantifierade protein. p-värdet < 0,05. (B) topp (vänster): Robust PAR och PARP1 signaler på hög input-power skada platser. Topp (höger): PARP1 siRNA utarmning är tillräckligt för att avskaffa de PAR signal32,44. Botten: Tid kursen analys av γH2AX i celler med låg (överst) och hög (nederst) input power skador som anges. Skala barer = 10 µm. Denna siffra ändrades från Saquilabon Cruz32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Differential aktivering av DDR signalering påverkar 53BP1 rekrytering skada platser. (A) toppen: PtK2 celler som stabilt uttrycker andra-53BP11220-1711 var microirradiated med både låg (15%) och hög (25%) ineffekt (vita och gula pilspetsar, respektive) i samma kärnan med hjälp av 780 nm NIR/confocal Mikroskop systemet. Detta utfördes i närvaro av DMSO, PARP-hämmare (Pi), eller en kombination av ATM, DNA-PK och PARP-hämmare (Ai + Di + Pi) indikerat. Live-cell avbildning av andra-53BP11220-1711 tillfångatogs i 30 min efter DSB induktion. Cellerna var sedan fixeras och färgas med en antikropp specifik för γH2AX som DSB markör. Ändringar av fluorescensintensiteten hos andra-53BP11220-1711 på skada platser visas till höger med p-värden (menar värden är: DMSO, 0,03 ± 0,02; Pi, 0,34 ± 0,19; AI + Di + Pi, 0.98 ± 0,23). Botten: Effekten av Pi och Ai + Di behandling på MDC1 lokalisering med hög input-power skada som anges. Skalstapeln är 10 µm. Höger: Förändringar av fluorescens signaler av MDC1 vid hög input-effekt skada platser i närvaro av DMSO, Pi eller Ai + Di med p-värden (menar värden är: DMSO, 0,07 ± 0,10; Pi, 0,05 ± 0,07; AI + Di, 0,86 ± 0,26). Skalstapeln = 10 µm. N = 10 för varje intensitet-mätning. (B) effekten av förbättring av PAR signaler genom PARGi behandling på endogena 53BP1 rekrytering till låg input-power skada webbplatser. Höger: Boxplots representerar kvantitativ analys av endogena 53BP1 rekrytering (upptäcks genom immunofluorescens färgning) med låg input-power laser (60 mW i 800 nm NIR laser/inverterad påljusfluorescens Mikroskop systemet) på 15 min post bestrålning i närvaro av DMSO eller PARGi som anges. Vänster: PAR och 53BP1 immunofluorescens färgning bilder av celler skadas på samma villkor med DMSO eller PARGi behandling. DMSO behandling har undersökt 100% av celler (N = 25) uppvisade robust 53BP1 rekrytering (höger). Däremot 20/25 visade inga 53BP1 rekrytering i närvaro av PARGi (nederst till höger), och 5 celler visade svag rekrytering. Skalstapeln = 10 µm. Denna siffra ändrades från Saquilabon Cruz32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fördelarna med att använda laser microirradiation för DDR forskning är:

1. det är möjligt att framkalla olika typer och mängder av DNA skada från enkla strand raster till komplexa DNA-skador, och för att upptäcka olika reparation faktorer på DNA skada platser genom att justera parametrarna laser irradiation. Det är också möjligt att orsaka skada flera gånger i samma cellkärnan för att utvärdera trans effekter (som i figur 3).

2. viktigast av allt, kan händelser som sker vid skada platser och de sekundära händelser som inträffar någon annanstans i kärnan enkelt urskiljas.

3. det är möjligt att genomföra högupplösta realtids mätningar av fluorescently märkta proteinet dynamics svar på skador på en enda cell-nivå, inklusive, men inte begränsat till: Förster resonans energi överföring (bandet), fluorescens livstid Imaging ( FLIM), par korrelationsfunktion (pCF), etc., för att fånga DDR i levande celler.

4. Kombinera med RNA interferens eller hämmare behandling, är det relativt enkelt att testa uppströms faktor krav i ett litet antal celler.

5. det bör också noteras att NIR (eller grön) laserstrålning kräver inte före sensibilisering av DNA med nukleotid analoger eller DNA-infoga färgämnen, därmed undvika oönskade biverkningar på kromatin packning. Detta är i motsats till de UV-lasersystem som kräver sensibilisering vid låg dos och orsakar avvikande DDR på hög dos39,49,61.

Kritiska steg inom de protokoll/ändringarna och felsökning
Det är viktigt att cellerna är i sunda förhållanden när DDR analyser utförs för att minimera artefakt och experimentell variationer. DNA - eller siRNA-transfekterade celler är oftast känsligare eller enkelt loss när växer på det inrutade täckglaset. Den hjälper till att hålla cellerna för kortare tider i transfection reagensen så länge transfection fungerar, och utsäde mer transfekterade celler på inrutade täckglas skålen jämfört med de untransfected cellerna. Detta är nödvändigt för att uppnå jämförbara cell sammanflöden för experiment.

Det har rapporterats att tymidin blocket leder till ökade nivåer av γH2AX i den synkronisera celler62, som kan påverka DDR och förvränga resultaten. Dessutom visades base line γH2AX signalen att vara högre i S och G2/M fas även utan något EXOGEN skada63,64. Vi, dock iakttar inte någon betydande γH2AX signal i den nukleoplasman som skulle påverka eller störa den specifika γH2AX svaren på laser-inducerad skada platser i cellerna synkroniseras i S/G2 fas av en dubbel tymidin block51.

För att få konsekventa resultat, är det nödvändigt att regelbundet kontrollera laser system utdataparametrar (varje 2 till 4 veckor) och optiska justering (varannan månad). Över tid, laser systemkomponenter kan behöva åter arrangera i rak linje, objektiv kan vara skadad och måste bytas, och stabiliteten i den totala tillförda effekten kan ändras. Nyckeln är att utvärdera förekomsten av skador (crosslinking (CPD eller 6-4PP) och bas skador (8-oxoG)), markör proteiner (t.ex., DNA glycosylases, Rad51, cohesin och Ku) och PAR modifiering beskrivs i detta protokoll att fastställa doseringen och komplexiteten av DNA-skada inducerad av laser Mikroskop systemet används.

Begränsningar av tekniken
Laser microirradiation har begränsningar. DNA-skador som induceras av laserstrålen är mycket klustrade i ett område i atomkärnan jämfört med naturligt förekommande skador som kan spridas i kärnan. Detta kan ändra hur skador signalering sprids i närliggande kromatinet eller i kärnan. Eftersom ett förhållandevis lågt antal celler kan bestrålas i taget, kan inte populationsbaserad biokemiska analyser (t.ex., Western blot, protein komplex rening, kromatin immunoprecipitation (ChIP)) enkelt utföras. Beroendet av fluorescently märkta proteiner (med över uttryck av de exogena rekombinanta proteinerna eller ens med de uttryckt endogenously använda infogning av CRISPR-medierad tagg) för dynamisk avbildning gör studierna sårbara för protein fusion-inducerad artefakter. Den unika karaktären av laser-inducerad skada och potentiella artefaktiska effekterna av märkta proteiner, därför, måste utvärderas genom jämförelse med resultaten med konventionella DNA skada metoder (IR, kemiskt skadliga ämnen) och med den endogena otaggade proteiner (men ibland det inte går att utföra kompletta parallella experiment).

Betydelse med avseende på befintliga metoder
Användningen av sekvens-specifika endonucleases såsom jag-SceI, FokI, AsiSI och jag-PpoI ger en alternativ strategi för att inducera platsspecifika DSBs (strikt enkel DSBs). Faktor rekrytering eller ändringar kan analyseras av platsspecifika eller genome-wide ChIP analys65,66,67,68,69. Förhållandevis synkrona induktion av DSBs kan uppnås genom att tagga Amiiiiin med en steroid hormonreceptor och en nedbrytning signal (degron) för snabb translokationen i cellkärnan och nedbrytning, respektive65,66 , 67 , 68 , 69. man måste ta hänsyn, dock som Amiiiiin uttryck och target webbplats tillgänglighet, effektivitet och pågående reparationsstatus kan vara variabel i olika celler och olika mål platser. Dessa heterogeneitiesna kommer att vara i genomsnitt i populationsbaserade ChIP analysen, som kan förvränga resultaten. Laser microirradiation, erbjuder däremot, den högsta möjliga temporal upplösningen (millisekunder) liksom rumslig upplösning (submicrometer) skada svar dynamik, som kan analyseras på enskild cell nivå. Hög skada densitet, dock kan påverka resultatet. Båda strategierna kan vara känsliga för artefakter som orsakas av antikropp tillgänglighet eller peptid taggning. Det är därför viktigt att förstå fördelar och nackdelar med båda strategierna, som kan potentiellt användas som komplement till varandra.

Framtida tillämpningar
Med snabb befordran av fluorescens imaging och dynamics tekniker, mångsidighet av lasersystem att framkalla olika mängder och typer av DNA-skador på specifika platser och cellcykeln skede ger en värdefull möjlighet att förhöra cellulära och Molekylär Svaren till DNA skada spatiotemporal med hög upplösning på en enda cell-nivå. Det kommer att vara möjligt, exempelvis att retas skada platsspecifika och nucleus - och cell-wide DDR signaltransduktion med millisekund-upplösning (t.ex., upptäcka molekylära interaktioner eller ändringar som förekommer uteslutande vid skada platser, undersöka dynamiska förändringar av kromatinstruktur i realtid, eller Observera realtid sprida skada signalering från skada platser till hela kärnan). Det är också möjligt att följa samma cell under en lång tid att undersöka effekterna av DNA-skador på cellen öde. Vi ser framför oss att laser microirradiation metoderna, om det används korrekt, kommer att fortsätta bidra avsevärt till befordran av fältet för DNA-reparation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Akira Yasui vid Tohoku University, Japan för GFP-NTH1 uttryck plasmiden, och Dr Eros Lazzerini Denchi vid Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornien för TRF2-YFP och andra-53BP11220-1711 uttryck plasmider. Detta arbete stöds av av Air Force Office för vetenskaplig forskning (FA9550-04-1-0101) och stiftelsen Beckman Laser Institute Inc. (till M.W.B), de Ford Foundation Fellowship från National Academy of Sciences (till B.A.S), och NSF MCB-1615701 och CRCC CRR-17-426665 (till K. Y.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Genetik fråga 131 Laser microirradiation lasrar i medicin DNA-skador DNA skador svar DNA-reparation poly (ADP-ribos) polymeras (PARP) komplex skada strand raster bas skador
Laser Microirradiation att studera <em>In Vivo</em> cellulära svar till enkla och komplexa DNA-skador
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B.… More

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter