Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/56213
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2,3,4, 1
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Abstract

DNA hasarı genom bütünlüğünün korunması için önemlidir hücredeki belirli sinyal ve onarım yanıt neden olmaktadır. Lazer microirradiation DNA hasarı yanıt (DDR) vivoaraştırmak için değerli bir deneysel araç oldu. Hücre çekirdeği submicrometer bölgede sınırlı lazer kaynaklı hasara cevaben makromoleküllerin dynamics gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü tek hücreli analiz sağlar. Ancak, çeşitli lazer koşullar indüklenen zarar türleri farklılıkları takdir olmadan kullanılmaktadır. Sonuç olarak, çoğu zaman hasar doğası değildir belirgin tutarsızlıkları işe alım veya değişiklik profillerindeki neden karakterize veya kontrollü, iyi. Biz farklı ışınlama koşulları (örneğin, farklı dalga boylarında gibi farklı giriş (irradiances) güçlerin femtosecond (fs) yakın kızılötesi (Nur) lazer) farklı DDR ve onarım protein derlemeler indüklenen gösterdi. Bu üretilen DNA hasar türünü yansıtır. Bu protokolü nasıl farklı tutarlarda indüksiyon ve kolayca Bankası ve crosslinking zararlar, fark Poli (ADP-riboz) (PAR) sinyal, algılama tarafından takip edilebilir DNA hasarı karmaşıklığı titrasyon lazer giriş güç sağlar açıklar ve yol özgü onarım faktör derlemeler hasar sitelerde. Bir kez hasar koşulları belirlenir, farklı zarar karmaşıklık ve diferansiyel hasar sinyal etkileri yanı sıra ilgi herhangi bir faktör üzerinde ters yönde factor(s) tükenmesi araştırmak mümkündür.

Introduction

Vivo DNA hasarı sinyal de anlaşılmadı mı
Vivo, DNA Histon ve diğer faktörler formu Kromatin iplikler için complexed olduğunu. Düzenleme Kromatin yapısı, DNA metabolizması için büyük önem taşımaktadır. Örneğin, Histon değişken H2AX mutasyona uğramış ataksi-Telanjiektazi (ATM) ve aşağıdaki iki iplikçikli (DSB) indüksiyon tatili ve yerleştirme bir site için diğer sağlamak olarak DSB hasar sinyal güçlendirme için önemli diğer kinazlar tarafından fosforile etkenler. Hasar sinyal ve onarım yolu seçimi yayılan görünür eleştirel yerel Kromatin yapısı hasar siteleri1tarafından etkilendiği için. Faktörler, Histon chaperones ve enzimler değiştirme Histon remodeling Kromatin birkaç siteleri zarar için gerçekten işe ve DDR yönetmelikte Kromatin önemini vurgulayarak verimli DNA tamiri için önemlidir ve2 onarım , 3 , 4. Ayrıca, kümeleme veya yeniden konumlandırma hasar sitesi Maya ve drosophila5,6,7,8, gen loci relocalization anımsatan gözlenmiştir gerçekliğimizin bölme gen Yönetmeliği9,10ile ilişkili. Fare ve insan hücreleri son araştırmaları Ayrıca seferberlik hangi etkileri sadakat ve yol seçim11,12onarmak DSB sitelerin saptandı. Bu DDR/onarım da yakından nükleer mimarisi, üst düzey Kromatin organizasyon ve kromozom ile hücre çekirdeği dinamiklerini bağlantılı olabilir ki olasılığını yükseltir. Böylece, DDR çalışma ve onarma işlemlerinde canlı hücrede endojen nükleer çevre bağlamında kısa ve uzun vadeli sonuçları DNA hasarı anlamak için yüksek çözünürlüklü yöntemleri geliştirmek için önemlidir.

Ölçüde ve hasar türünü ölçme ve Protein derleme hasar sitesinde düzenleyen PAR polimeraz (PARP) kritik rolü
PARP1 hızla DNA onarım13' te kritik bir rol oynamaktadır DNA hasarının aktif bir DNA nick sensör olduğunu. PARP1 x-ışını onarmak çapraz tamamlayan baz eksizyon tamir (BER) kolaylaştırmak için 1 ile birlikte (XRCC1) çalışması için Aslında düşündüm fakat DSB onarım14dahil olmak üzere diğer DNA onarım yolları rolü son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya koyuyor. PARP1 kullandığı Nikotinamid adenin dinükleotit (NAD+) ADP-ribosylate için bir substrat olarak kendisi de dahil olmak üzere birden çok hedef proteinler aktif. PARP inhibitörleri olarak umut verici tedavi ilaçlar kanser için ortaya çıktı gibi bu enzim ve diğer aile üyeleri son yıllarda çok dikkat çekmiştir. PARP inhibitörleri başlangıçta meme kanser geni (BRCA1) etkili olduğu bulundu rağmen-mutasyona meme kanseri hücreleri, şimdi kanıt etkileri ajanlar/ışınlama karşı zarar DNA ile birlikte mono - ve kombinasyonu tedaviler için bir bolluk olduğunu Kanser için BRCA115,16,17,18,19,20sınırlı değildir mutasyonlar ile geniş bir yelpazede.

Moleküler seviyede PARP etkinleştirme yerel Kromatin yapısı hasar sitelerdeki organize kritik rol oynamak için gösterildi. Kromatin modifikasyon enzimleri alımı PAR-bağımlı DSB onarım kolaylaştırır ve baskıları yolu seçimler, PAR değişiklik hasar sitelerdeki önemli iskele rolü düşündüren onarmak. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 biz son zamanlarda gösterdi p53-bağlayıcı protein 1 (53BP1) dışlanması zararlardan siteleri homolog olmayan endjoining () 53BP1 bağlı hyperactivation için alternatif bir açıklama sağlayan PAR 32tarafından NHEJ) tarafından PARP onarım inhibitörü ve DSB PARP önemini vurgulayarak yolu seçim33,34. Onarım faaliyetin birden fazla DNA'ın PARylates ve etkileri doğrudan PARP1 de14faktörler.

Lazer Microirradiation DDR/onarım Vivo içinde çalışmak için bir araç olarak kullanarak
Alt mikron değişiklikler üzerinde bireysel kromozomlar üretmek için lazer microirradiation ilk 196935 içinde açıklanan ve ayrıntılı olarak 198136gözden. Birkaç yıl sonra lazer microirradiation, hücre çekirdeği tanımlanmış submicrometer bölgede, DNA hasar ikna etmek için gösterildi ve işe alım veya DNA lezyonlar içinde vivo çeşitli faktörlerin değişiklikleri incelemek için değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. bu yöntem farklı ışınlama kaynaklı foci (IRIF) oluşturmaz bu faktörlerin tespiti hasar siteleri39,42, sağlar. Kromatin yapısal değişiklikler hasar siteleri hem çekirdeği geri kalanında kronolojik zamanmekansal dinamiklerini incelemek mümkündür. Biz dikkatle farklı lazer sistemleri tarafından indüklenen DDR'lar göre ve giriş yetkileri DNA hasar türünü ve microirradiation koşulları32,43,44, arasındaki ilişki değerlendirmek için 45. Anormal işe alım kalıpları 53BP1 ve telomeric bağlayıcı faktör 2 (TRF2) lazer kaynaklı hasar46 "fizyolojik olmayan" doğası için yinelenen endişe için temel sağlanan önceki lazer hasar çalışmaları, gözlendi tekrar ,47,48,49. Bu belirgin farklılıklar şimdi fark PARP tarafından açıklanabilir hangi indüklenen zarar32karmaşıklığını ve miktarını ölçer sinyal bulduk. Biz doğruladı: 1) lazer-microirradiated hücreleri (yüksek giriş güç ışınlama) sonra bile Interphase içinde bir hasar denetim noktası denetim bağlı şekilde tutuklandı ve geçerli kalır (en az en fazla 48 saat)32,50; ve 2) onarım faktör işe alım/değişiklikler sadakatle bu geleneksel DNA zararlı ajanlar ile tedavi ve DSB indüksiyon ile endonucleases32,39,42tarafından, gözlenen özetlemek 44,50,51,52. Bu sonuçlar güçlü lazer zarar indüklenen hücresel yanıt eğitimi fizyolojik alaka destek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. temel hücre hazırlık

Not: Bu standart ayirt endojen protein alımı veya değişiklik algılanması ve stabil bir fluorescently tagged rekombinant protein ifade bir hücre kültürünü kullanımı için bir adımdır. Örneğin, Potorustridactylus (PtK2) keseli böbrek epitel hücreleri stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade bizim önceki kullanılmıştır (şekil 1)32çalışma. Eski durumda, 53BP1 bölgesinin şekillendirme odak (amino asit 1220-1711) içeren Oligomerizasyonda etki alanı, Tudor etki alanı ve ubiquitylation bağımlı işe alım (UDR) motifi, Gelişmiş GFP (EGFP-53BP11220-1711) erimiş. Bu füzyon proteinin tam uzunlukta 53BP153,54,55hasar site alımı beyannamedir. HeLa hücreleri, cohesin (örneğin, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52ve GFP SA2 51) in fluorescently etiketli alt birimleri stabil tesisin içine verimli birleşme sağlamak ve özetlemek için ifade gerekir S/G2 hücre döngüsü aşama özel hasar site işe endojen cohesin51.

  1. Tek hücre kimliği için izin vermek için herhangi bir yapisan hücre tipi gridded coverslip ile bir 35 mm doku kültürü yemek üzerine tohum. % 60 confluency 36-48 h belirli hücre proliferasyon oranını temel alarak elde etmek için ilk cep numarasını ayarlayın. Örneğin:
    1. PtK2 keseli böbrek epitel hücreleri (vahşi türü veya bu stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade) için: plaka 2.0 x 104 hücreleri 2 ml gelişmiş en az gerekli orta (MEM) takıma 2 mM L-glutamin, % 4 fetal sığır Serum (FBS) ve antibiyotik (100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin) ve % 7 CO237 ° C'de kuluçkaya.
    2. İçin HeLa hücreleri stabil fluorescently ifade ile rekombinant proteinler GFP SA2 tagged: tohum 1.0 x 105 hücreleri 2 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) %10 FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin, desteklenen ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya. Diğer HeLa hücreleri de değiştirilmemiş hücreleri veya hSMC1-GFP ifade hücreleri de dahil olmak üzere kullanılabilir.
  2. Uygun ve daha önce DNA hasarı indüksiyon (Görsel Kılavuz numarası olarak izin vermek için) % 30-60 izdiham, 36-48 h için çoğalırlar hücrelere izin. Bölüm 4'e geçin.

2. geçici Transfection

Not: Bazen iyi antikorlar endojen proteinler algılamak kullanılabilir değil. Stabil marker proteinler ifade hücre hatları kullanılabilir değilse, canlı hücre analizleri için fluorescently etiketli proteinler izlemek için geçici transfections yerine getirir.

  1. Günde 1, HeLa hücreleri için 6-8 x 104 hücreleri 0.5 mL kültür medya 24-şey plaka bir iyi tohum ve bir % 100 oksijen kuluçka 37 ° C'de ve % 5 CO2kuluçkaya. Adım 1.1 Kültür ortam koşulları için bkz.
  2. Gün 2, fluorescently etiketli bir DNA kodlama bir memeli ifade plazmid onarım kullanım faktörü (örneğin, GFP-NTH1 veya GFP-OGG1 baz hasarı için32,44,56, GFP-Ku yüksek doz DSBs57, GFP-53BP1 için 32 nispeten basit DSBs veya floresan etikete erimiş ilgi diğer proteinler) lipozom aracılı DNA transfection gerçekleştirmek için. 0.3 µg plazmid DNA 25 µL serum serbest kültür medya bir 1,5 mL tüp içine sulandırmak.
  3. Başka bir 1,5 mL tüp, 1 µL lipozom tabanlı DNA transfection reaktif 25 µL serum serbest kültür ortamının sulandırmak ve karışımı yavaşça.
  4. Seyreltilmiş DNA ve transfection Ajan karışımı yavaşça ve form DNA-lipid kompleksleri için (RT) oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  5. Durulama hücreleri 0.5 mL kültür medya ile bir kez, medyayı çıkarın ve hücrelere (aynı derecede içinde adım 1.1) 0.5 mL taze kültür ortamı ekleyin.
  6. DNA-lipid kompleksleri hücrelere ekleme. Bir kaç kez plaka rock yaparak karışımı yavaşça. Hücreleri geri adım 2.1 olduğu gibi kuluçka makinesi koymak.
  7. 4-6 h sonra hücrelerden kültür ortamını çıkarın ve 300 µL % 0.05 eklemek tripsin-EDTA. Bunu kaldırmak, 200 µL eklemek tripsin-EDTA ve 3-4 dk 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
  8. Teyit hücreler ayrılır sonra 800 µL kültür ortamı ekleyin ve hafifçe hücre kümeleri kırmaya pipetting tarafından hücreleri resuspend. Hücre süspansiyon gridded coverslip ile bir 35 mm kültür yemek takabilir ve kültür ortamı son hacmi 2 mL için ekleyin.
  9. Hücreler olduğu gibi adım 2.1 kuluçka 48 h için kuluçkaya, daha sonra bölüm 4'e geçin.
    Not: Ifade rekombinant protein toksik ise (transfected hücreleri gösterir yuvarlak veya düzensiz Morfoloji kuluçka adım 2.8 sonra), ifade süresini kısaltmak ve lazer microirradiation (Bölüm 4) 16-20 h transfection sürece olarak sonra gerçekleştirmek protein ifade doğruladı (floresan tespiti için bkz: adım 4.3). Bu durumda, transfection 35 mm tabak içinde gerçekleştirin. Tohum 3.0 x 105 HeLa hücreleri bir 35 mm tabak 30 h. Transfect DNA plazmid sonra yaklaşık % 50-70 izdiham ulaşmak ve medya 2-6 h değiştirmek için gridded bir coverslip ile transfection sonra. Lazer microirradiation 12-20 h ile devam sonraki protein ifade ise makul ve hücreler sağlıklı görünür.

3. Hücre döngüsü eşitleme

Not: onarmak için homolog rekombinasyon (HR) proteinler, işe alım hücre döngüsü, hangi HR onarım yer51alır S/G2 aşamasında daha belirgin Rad51 ve cohesin gibi. Böylece, bu protein alımı izlemek için hücre eşitleme S/G2 faz için gereklidir.

  1. S/G2 aşama eşitlemesi
    1. Hücre eşitleme için S/G2 faz50,51Kişilik timidin blok protokolünü kullanır. Bir 35 mm gridded coverslip yemek hücrelerde tohum sonra (bkz. Adım 1.1), kuluçkaya hücreleri (için son bir konsantrasyon 2.5 mm) timidin kültür medya (aynı derecede içinde adım 1.1) 17 h 37 ° C'de ve % 5 CO2.
    2. 1 mL (aynı derecede içinde adım 1.1) kültür medya timidin içermeyen hücrelerle iki kez durulama ve 2 mL timidin ücretsiz kültür medya adım 1.1 olduğu gibi 9 h için hücrelerde kuluçkaya.
    3. 27,5 mM timidin hisse senedi çözüm (kültür ortamda çözünmüş) 200 µL kültür medya ile hücre içine 2.5 mM timidin son bir konsantrasyon için ekleyin. Hücreler olduğu gibi başka bir 15 h. durulama için adım 3.1.1 kuluçkaya ve 4-6 h için kültür medya timidin ücretsiz hücrelerde kuluçkaya ve DNA hasar (Bölüm 4) neden.
    4. Hücre döngüsü işaretçileri kullanarak eşitleme verimliliği onaylamak (siklin A2 ve B1 S/G2 ve G2, sırasıyla), S/G2 faz özgü DNA hasarı tamir faktörler (örneğin, Rad51 veya cohesin), veya IdU/EdU birleşme (için S faz hücreleri)51.
  2. G1 aşama eşitlemesi
    1. Tohum 6-8 x 104 HeLa hücreleri gridded coverslip (Adım 2.1) ile bir 35 mm kültür yemek.
    2. 2 gün sonra hafifçe kaldırdı ve yuvarlak şekilli, 10 X objektif ve 10 X oküler lens kullanarak ters bir mikroskop altında metafaz hücrelerini tanımlamak. Metafaz hücreleri üzerinde gridded coverslip konumunu kaydetmek için görüntüleri elde etmek.
    3. 3-4 h sonra hücre bölünmesi iki kızı hücrelere (G1 aşamasında) onaylamak ve DNA hasar (Bölüm 4) teşvik.

4. titrasyon lazer güç girişi

Not: Bu protokol için biz bir 780 kullanarak DNA hasar neden nm Geniş puls confocal mikroskop veya 800 bağlı fs NIR lazer sistemi nm Geniş puls fs NIR lazer bir ters epi-Floresans mikroskobu birleştiğinde. Giriş gücü (numune lazer odak noktasında gerçek olma) karşılaştırılabilir DDR ikna etmek için gerekli bu sistemlerinde farklı olsa da, her iki, veya herhangi bir, NIR sistemleri-32,57 giriş gücü titrasyon temel prensibi geçerlidir . Lazer nabız ve en yüksek olma iki lazer sistemleri için odak noktada başına in situ enerji vardı 5,33 × 10-2-4 × 10-1 aralığında nJ ve 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, sırasıyla32.

  1. NIR lazer açmak ve lazer sistemi ısınma için kullanmadan önce 1 h için izin verir.
  2. Bir tabak hücre ısıtmalı (37 ° C) Sahne Alanı'nda CO2 (% 5) ve nem oranı (% 100) kontrol sağlar bir odaya yerleştirin.
    Not: bir CO2 Oda yoksa, CO2kullanın-bağımsız kültür medya en fazla 5-6 saat için. Bir Isıtma sahne kullanılabilir değilse, hücreler < 20 dk için mikroskop altında tutmak ve doku kültürü kuluçka uygun sıcaklık, CO2ve nem kontrolü ile içine yerini alması. Bu kültür koşullar türetme (örneğin, amfibiler karşı memeliler) organizmanın yanı sıra kullanılan belirli hücre türüne bağlı olarak değişebilir.
  3. Canlı hücre analizi için fluorescently tagged proteinlerin, GFP filtre (450-490 nm uyarma, 515-586 nm emisyon) veya Cy3 filtre (540-552 nm uyarma, > 590 nm emisyon) GFP veya protein mCherry erimiş, sırasıyla, bir 100 X veya 63 X yağı daldırma kullanarak seçin Amaç.
  4. Karşılaştırılabilir floresan sinyallerini, protein ifade karşılaştırılabilir düzeyde yansıtan içeren hücreleri için arama. Floresans ölçümlerde hücre hücre değişkenliği azaltmak için çok zayıf veya çok güçlü ifade içeren hücreleri kaçının.
  5. Lazer giriş gücü titre.
    1. 780 nm NIR lazer confocal mikroskop için bağlı
      1. Hücre çekirdeği yağı amaç aracılığıyla tek lazer taramaları (Çözünürlük 512 x 512 piksel, ağartılmış zum X1, bölge 50 x 4 piksel, 12.8 µs piksel bekleme süresi, yineleme x1) maruz kalma doğrusal parça hedeflemek için yazılım çamaşır suyu işlevini kullanın (100 X / 1.3 NA).
      2. (Üretici tarafından lazer mikroskop sisteminde bulunan yazılım/donanım kullanarak) lazer iletim yüzde %5 için diğer ayarları değiştirmeden ayarla.
      3. Bir hücre alanın ortasına yerleştirin. Faiz (ROI) aracı, bölgeyi tıklatın ve fareyi kullanarak çekirdeğinde bir çizgi veya kutusu (yaklaşık 50 x 4 piksel) çizme ve DNA hasar ikna etmek için "Çamaşır suyu" düğmesini tıklatın.
        Not: sonraki ışınlama adımda "beyazlatma" % %40 5 artışlarla artırılmalıdır veya en fazla %100 gerekirse.
      4. 800 nm NIR lazer epi-floresan mikroskop için bağlı
      5. Giriş gücü sayesinde kontrol bir (63 X / 1.4 NA) faz kontrast yağı daldırma amaç motorlu döndürme polarizasyon filtresi tarafından ışın yolundaki tanıttı ve bir bilgisayar kontrollü motorlu dönme sahne32,39 nolu monte , 58.
      6. Bir lazer güç ölçeri kullanmayı mikroskop girerek giriş gücü (mW) ölçmek ve polarize açısı (°) ayarlayın. 5-10 mW artışla, 20 mW-155 mW arasında değişen giriş güçler sağlamak polarize açıları belirler.
      7. Karşılık gelen polarize açısı 20 mW giriş gücü için ayarlayın.
        Not: polarize açı 40 °, bizim lazer sistemi için giriş gücü 65 ise mW. Giriş gücü 5-10 mW artışlarla artırmak.
  6. Canlı hücre analizi için 6.1 ve 6,3 adımlara geçin. Endojen proteinler veya modifikasyon ayirt tespiti için Bölüm 5'e geçin. Analizden sonra daha fazla titrasyon lazer güç 4.7 adıma gidin. Ters yönde faktör gereksinimi çözümlemek için Bölüm 7'ye gidin.
    Not: Hızlı (içinde birkaç dakika) ve geçici istihdamı BER ve NHEJ faktörlerin değil (< ~ 30 dk - 1 h faktörü ve < ~ 4 h sonrası bağlı olarak zarar indüksiyon, sırasıyla). Buna ek olarak, insan kaynakları faktörler Rad51 ve cohesin alımı ~ 30 dk - 1 h olarak algılanabilir ve onlar daha 8 h Düzeltilmemiş DNA lezyonlar44,50,51kalıcı eğilimindedir. Böylece, bu noktaları farklı onarım faktörleri için Işınlama sonrası farklı zaman incelemek gereklidir.
  7. Adım 4.4 olduğu gibi istenen artışlarla (Yani, 780 NIR lazer % 5'i ve 5-10 mW 800 NIR için) giriş gücü artırmak ve hücre eşik (hasarlı hücreleri gösteri istihdam % 50) ve en yüksek (% 100 hücreleri gösterinin belirlemek için yeni bir takım 4,5-4,7 adımları yineleyin İşe Alım) her protein için.

5. ayirt boyama

Not: PAR (karmaşık hasar işareti) ve H2AX fosforilasyon (γH2AX) gibi kovalent protein değişiklik algılanması için (DSB işaretleyici) yanı sıra cyclobutane pirimidin dimer (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) ve 8-oxoguanine (8-oxoG) (çapraz ve temel hasar işaretleri, sırasıyla), hücreleri sabit ve belirli antikorlar ile lekeli. Buna ek olarak, antikor algılama rekombinant füzyon protein overexpression tarafından indüklenen eserler ayırt etmek için endojen proteinlerin tarafından fluorescently tagged rekombinant proteinler ile elde edilen sonuçları onaylamak en iyisidir.

  1. Hücreleri farklı zaman noktalarda faktörlere bağlı olarak hasar indüksiyon (Adım 4.5) sonra 10 dk RT. az için % 4 paraformaldehyde/1 X PBS 1,5 mL (bkz. Adım 1.1) kültür medya değiştirerek düzeltmek
    Dikkat: Paraformaldehyde dumanı zehirlidir ve tüm iş havalandırılmış duman mahallede yapılmalıdır.
  2. %4 paraformaldehyde/PBS kaldırmak ve RT. % 0.5 deterjan/PBS için 10 dk 1 mL ekleyin
  3. % 0.5 deterjan/PBS ve durulama PBS 2 mL 5 min için hücrelerle iki kez kaldırmak ve çözüm engelleme 2 mL hücrelerde kuluçkaya (% 10 buzağı serum, % 1 BSA/PBS) RT. 1 h için
  4. Engelleme çözümü kaldırmak ve PBS 2 mL hücrelere ekleme ve PBS % 3 ile 250 µL birincil antikor çözüm yerine BSA/PBS bir gecede 4 ° C veya 1 h RT. kullanım olarak bir 1: 200-1:500 seyreltme (tipik konsantrasyon yaklaşık 1 µg/ampirik olarak belirlenen mL,) karşı antikorlar Özel farklı DNA hasarı işaretleri (örneğin, γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (DSB, NHEJ); Rad51/cohesin (DSB, HR); CPD/6-4PP (crosslinking hasar); 8-oxoG/DNA glycosylases (örneğin, NTH1) (baz hasar); PAR (yüksek doz karmaşık hasar)).
  5. Antikor çözümü kaldırmak ve durulama ile PBS 2 mL 5 min için iki kez, Kaldır PBS ve 250 µL % 0,1 ikincil antikor %3 ile kuluçkaya BSA/PBS RT., karanlıkta 1 h için
  6. İkincil antikor çözümü kaldırmak ve PBS 2 mL 5 min için iki kere ekleyin ve görüntüleme adım 6.1 ve 6.2 için 1.5-2 ml PBS 4 ° C'de hücreler tutmak.

6. kantitatif floresan analiz Immunostained ve canlı hücreler

  1. Esir alma imge lekeli veya canlı hücre (n > 10) ışınlama için kullanılan mikroskop kullanarak. Epi-floresan mikroskop sistem 1344 x 1024 piksel çözünürlükte kullanın ve görüntüleri TIFF 16-bit dosyaları olarak kaydedin. Confocal mikroskop için 1 X büyütme kullanın; Argon lazerin GFP/FITC, Helene 594 lazer için Cy3/mCherry; 512 x 512 ya da 1024 x 1024 piksel görüntü çözünürlüğü için; hız 5, numarasını inceden inceye gözden geçirmek: hızlı tarama veya sinyal gürültü oranı artırmak için Çoklu tarama üzerinde ortalama için 2 + 1.
  2. Piksel yoğunluğu ölçmek için program tasarlanmış bir görüntü analizi kullanın.
    1. Birim dikdörtgen aracı hasar site tek hücre görüntünün çevresinde bir yatırım Getirisi çizmek için kullanın. Aynı boyutta ROI arka plan Floresans sinyal nucleoplasm bitişik, ama hasar siteleri ile örtüşen değil ölçmek için kullanın. Bu photobleaching confocal mikroskop sistemi ile ilgili normalleştirme için önemlidir.
    2. Görüntü analiz programı kullanarak Floresans sinyalleri ölçmek için "Birim Çözümleme Araç kutusunda bulunan raporu"'ı tıklatın. Yeni pencere-ecek gözükmek. "Veri için görüntü" bölümünün altında sadece "Ad" ve "Yoğunluk" kutuları işaretleyin. O zaman tıkırtı "ölçüleri görselleştirmek için bitmiş".
    3. Değerleri birim rapor penceresi ve "select sekmeleri (excel formatında)" altındaki alan ayırıcıları ve "Dosya" için verme hedef için bulunan tablo simgesini tıklatarak bir elektronik tablo programına vermek.
    4. Göreli sinyalleri almak için kontrol nucleoplasm (sütun 2) bölgede arka plan ve normalleştirme için 1 tarafından çıkarma tarafından hasar sitesinde (sütun 1) floresan yoğunluğu bölmek için elektronik tablo programı kullanın.
  3. Confocal mikroskop kullanarak gerçek zamanlı kantitatif floresan zaman ders analizi
    1. Adım 4,3 olduğu gibi mikroskop kullanarak fluorescently tagged protein-pozitif hücreleri tanımlamak.
    2. Hızlandırılmış Floresans görüntüleme önce hasar ve farklı zaman noktalarında hasar indüksiyon sonra bölüm 4'te gerçekleştirin. İlk çamaşır suyu ROI (hasar indüksiyon için) çizmek, o zaman seçme "edinme > saat serisi" 20 ve "döngüsü gecikme" alt menüsü, ayarla "Sayı" 30 s, "bir kez ilk taramadan sonra çamaşır suyu" seçin ve "B Başlat"'ı tıklatarak. Bu durumda, ilk görüntü hemen hasar indüksiyon 19 görüntü tarafından satın alınan şirketler bir 30 s aralıklarla takip önce kazanılır. Aralıkları ("döngüsü gecikme") çalışma amaç bağlı olarak değiştirilebilir.
    3. Resim alma işlemi tamamlandıktan sonra "Demek"'ı tıklatın ve yatırım Getirisi hasar bölgesi çizin. Yoğunluk içinde seçili ROIs listelendiği bir tablo almak için "tabloyu göster" seçeneğini tıklatın. Verileri farklı zaman Puan hasar sitesinde floresan yoğunluğu aynı bölgede daha önce hasar yoğunluğu tarafından bölerek normalize ve 1 tarafından çıkarın.

7. küçük Interfering RNA (siRNA) Transfection

Not: Hedef protein tükenmesi gözlenen protein işe alım siteleri (Bölüm 4) zarar ters yönde faktörü gereksinimini betimlemek için etkili bir yoldur. Ayrıca, strateji ayirt algılama için kullanılan bir antikor özgüllük gidermek için en iyi yoldur (bkz Bölüm 5).

  1. 1. gün: 6-8 x 104 HeLa hücreleri 0.5 mL kültür medyada her şey, bir denetim siRNA transfection ve bir PARP1 siRNA için tohum tarafından HeLa hücreleri bir 24-şey plaka 2 kuyu hazırlamak (5'-MOLDOVA'da AGA AAT CTC TTA SKK CAA-3').
  2. 2. gün: hücreleri yaklaşık % 40-50 birleşmesi olduğunu onaylayın. SiRNA transfection ilk turunda gerçekleştirmek: 5 seyreltik pmol siRNA 25 µL serum serbest kültür ortamının içine 3 µL lipidler dayanarak transfection reaktif tüpün içine ekleyin, karışımı yavaşça ve 5-10dk RT. adlı için kuluçkaya
  3. Bir kez 0.5 mL taze kültür medya hücrelerle durulama ve hücreleri (bkz. Adım 1.1) 0.5 mL taze kültür medyada tutmak.
  4. RNA-lipid kompleksleri hücrelere ekleyin ve karışımı yavaşça ileri geri çanak eğerek. Hücreleri geri adım 2.1 olduğu gibi kuluçka makinesi koymak.
  5. Transfection mix Aspire edin ve 0.5 mL taze kültür ortamı (Adım 1.1) 6 h sonra ekleyin.
  6. 3. gün: (bkz. adım 7.2) siRNA transfections ikinci tur gerçekleştirmek. O zaman, hücreleri 60-%100 2.3 adımda anlatıldığı gibi bir 35 mm gridded coverslip tabak içine tohum.
  7. 5. gün: Bölüm 4 tarafından belirlenen faiz, en büyük faktör alımı için en uygun lazer güç formu kullanarak lazer microirradiation devam etmek. Tipik olarak, verimli tükenmesi HeLa hücreleri yaklaşık % 60-90 görülebilmektedir.
    Not: Alternatif olarak ve tamamlayıcı yaklaşım, inhibitörleri, varsa, faktör faiz32,44fonksiyonun inhibe için kullanılabilir. DDR sinyal inhibe etkisini analiz etmek için 20 µM PARP inhibitörü, 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) inhibitörü veya 10 µM DNA-bağımlısı protein kinaz katalitik alt birim (DNA-PKcs) inhibitörü ve 10 µM ATM inhibitörü Dimetil sülfoksit (DMSO) eklemek 1 h önce hasar indüksiyon yemekleri. DMSO sadece kontrol hücreleri ekleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stabil EGFP-53BP11220-1711 veya TRF2-YFP ifade PtK2 hücreleri kullanarak, lazer giriş gücü titrasyon onların işe alım (şekil 1)32için en uygun koşul belirlemek için gerçekleştirilmiştir.

Yüksek giriş güç lazer hasar siteler, önemli CPD (genellikle ultraviyole (UV) hasar tarafından oluşturulan crosslinking hasar), özellikle baz hasarı tanır GFP-NTH1 DNA glycosylase yanı sıra kümeleme gözlendi. Buna ek olarak, daha yüksek XRCC1 ve CtIP sinyalleri, kırılmalara sayısının artmasına yansıtan ve karmaşık DNA hasar bu şartla (şekil 2A) indüklenen gösteren tespit edildi. Diğer DNA glycosylases yuvarlak floresan proteinler için (örneğin, GFP nei endonükleaz VIII gibi 2 (NEIL2) ve GFP-8-Oxoguanine glycosylase (OGG1)) condensin yanı sıra ben de baz hasarı işaretleri44,59kullanılabilir. Bununla tutarlı, PAR yanıt önemli ölçüde yüksek giriş güç lazer (Yani, enerji ve numune odak noktada olma), tarafından indüklenen sadece zayıf düşük lazer gücü ile odak noktada (2B şekil, sol üst) bulduk. PAR sinyallerini destekler ancak değil PARP1 protein yerelleştirme, hasar sitelerdeki PARP inhibitörü (veri gösterilmez) hassas olduğunu. Ayrıca, PARP1 için belirli siRNA PAR ve PARP1 hasar siteleri (2B şekil, sağ üst), azalmış32. Yüksek giriş güç koşul altında γH2AX başlangıçta hasar sitelerinde görünür ve tüm çekirdeği bir ATM/DNA-PK-bağımlısı şekilde (şekil 2B, alt) için hızlı bir şekilde yayılır. Benzer ATM/DNA-PK-bağımlı γH2AX yaymak için γ-ışınlama60bildirildi. 800 ve 780 nm NIR lazer sistemleri32ile tutarlı sonuçlar elde edilmiştir. Birlikte ele alındığında, sonuçları ortaya bu lazer giriş gücü titre mümkündür (ve bu nedenle, enerji ve hücre odak noktada olma) DSBs numarası ile korele PARP yanıt farklı derecelerde neden koşulları bulmak için ve DNA hasarı karmaşıklığı.

Yukarıdaki sonuçlar başlangıçta karmaşık DNA hasar varlığı 53BP1 ve TRF2 fark alımı neden olabilir önerdi. İlginçtir, ancak, 53BP11220-1711 işe bir düşük güç hasar siteye etkili yüksek giriş aynı hücre çekirdeği (şekil 3A şekil 3B aksine güç tarafından indüklenen ikinci hasar sitenin varlığı ile inhibe yapıldı. ). Sonuçlar yüksek giriş güç lazer hasar 53BP1 işe alım içinde transbastırır gösterir. PAR inhibisyonu PARP inhibitörü yanı sıra yüksek giriş güç hasar sitesi (şekil 3A) bile bu işe alım ATM/DNA-PK inhibitörleri geri yükleme tarafından yayılan inhibisyonu çapında nükleer γH2AX. Bu aracı DNA hasar denetim noktası 1 (MDC1) alımı öncelikle γH2AX dağılım tarafından inhibe ve bu nedenle, Bina içinde ATM/DNA-PK inhibitörleri, değil PARP inhibitörü (şekil 3A, alt) tarafından restore edilerek hasar sitelere farklıdır. Önemlisi, PAR hyperactivation PARG inhibisyon (γH2AX durumu etkilemeden) tarafından etkili bir şekilde ilk 53BP1 işe bile normalde 53BP1 verimli bir şekilde işe düşük giriş-güç hasar sitelerde bastırılır (şekil 3B)32. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar PAR sinyal ve tipi değil hasar başınagösterir, 53BP132alımı ile müdahale. Bu birden çok hasar siteleri etkisi ve etkileşim ile her diğer incelemek için bize sağlayan lazer microirradiation çok yönlü bir örnektir.

Figure 1
Resim 1 : Titrasyon lazer giriş gücü. Gelecekteki deneyler için kullanmak için lazer güç belirlemek için stabil EGFP-53BP1 ve TRF2-YFP ifade PtK2 hücreleri 20 arasında değişen giriş güçlerle microirradiation lazer için tabi tutuldu mW ve 155 800 nm NIR lazer/ters epi-floresan kullanarak mW mikroskop sistem. TRF2-YFP hücreleri 6 dk p.ı. için takip edildi ise EGFP-53BP1 işe alım 15 dk sonrası radyoterapi (özel dedektif), izlenen yapıldı. Barlar hemen üstündeki sayılar test hücreleri toplam sayısı üzerinden EGFP-53BP1 veya TRF2-YFP olumlu alımı hasar sitelere gösterdi hücre sayısı temsil eder. Bu rakam Saquilabon Cruz32güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Karmaşık hasar ve sağlam DDR yüksek giriş güç lazer tarafından sinyal indüksiyon. (A)yüksek giriş güç lazer microirradiation kırılmalara (SSBs ve DSBs), çapraz ve baz zarar da dahil olmak üzere karmaşık hasar neden olmaktadır. CPD, XRCC1 (onarım SSB ve DSB), NTH1 DNA glycosylase (BER) ve CtIP (alternatif NHEJ ve insan kaynakları) gösterilir (GFP-NTH1 bir canlı hücre görüntü ve dinlenme gözlenen ayirt boyama ardından sadece). Kantitatif floresan yoğunluk ölçümleri hasar site alımı Bölüm 7 iletişim kuralında belirtilen şekilde yapılmıştır ve öğretici olarak boxplots gösterilir. Test hücreleri (n) toplam sayısı her quantified protein altında görülebilir. p-değeri < 0,05. (B) üst (sol): yüksek giriş güç hasar sitelerdeki sağlam PAR ve PARP1 sinyalleri. Üst (sağ): PARP1 siRNA tükenmesi PAR sinyal32,44kaldırılması için yeterli. Alt: Saat ders analizi γH2AX düşük (üst) ve yüksek (alt) ile hücrelerdeki güç hasar belirtildiği gibi girdi. Ölçek çubukları 10 µm =. Bu rakam Saquilabon Cruz32güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : DDR sinyal fark aktif 53BP1 işe alım siteleri zarar etkiler. (A)Top: stabil olduğunu microirradiated yüksek (% 25) ve düşük (% 15) ile EGFP-53BP11220-1711 ifade PtK2 hücreleri giriş gücü (beyaz ve sarı ok uçları, sırasıyla) 780 nm NIR/confocal mikroskop sistem kullanarak aynı çekirdek içinde. Bu DMSO, PARP huzurunda gerçekleştirilen inhibitörü (PI), ya da ATM, arada DNA-ba ve PARP inhibitörleri (Ai + Di + Pi) belirtildiği gibi. EGFP-53BP11220-1711 canlı hücre görüntüleme 30 dk sonra DSB indüksiyon ele geçirildi. Hücreler daha sonra sabit ve bir antikor ile belirli bir DSB marker olarak γH2AX için lekeli. EGFP-53BP11220-1711 hasar sitelerdeki floresan yoğunluğu değişiklikleri pile sağ gösterilir-değerleri (değerlerdir demek: DMSO, 0,03 ± 0,02; Pi, 0.34 ± 0,19; AI + Di + Pi, 0,98 ± 0,23). Alt: MDC1 yerelleştirme belirtildiği gibi yüksek giriş güç hasar ile Pi ve AI + Di tedavi etkisi. Ölçek çubuğu 10 µm var. Sağ: Değişiklikler MDC1 floresan sinyallerinin yüksek giriş güç zarar DMSO, Pi veya AI + Di huzurunda sitelerle p-değerleri (değerler demek: DMSO, 0,07 ± 0.10; Pi, 0,05 ± 0,07; AI + Di, 0,86 ± 0,26). Ölçek çubuğu 10 µm. N = = 10 her yoğunluk ölçüm için. (B) PAR geliştirme etkisi PARGi tedavi endojen 53BP1 istihdamı düşük giriş-güç hasar siteleri için sinyal gönderir. Sağ: kantitatif analiz (ayirt boyama tarafından tespit) endojen 53BP1 alımı düşük giriş güçte lazer ile temsil eden öğretici Boxplots (60 mW 800 nm NIR lazer/ters epi-floresan mikroskop sistemi) 15 dk ışınlama sonrası DMSO ya da belirtildiği gibi PARGi huzurunda. Sol: ayirt DMSO ile veya PARGi ile aynı koşullarda hasarlı hücrelerinin resimleri boyama PAR ve 53BP1. DMSO tedavisi için hücrelerin % 100 muayene (N = 25) sağlam 53BP1 işe alım (sağda) sergilenmektedir. Buna ek olarak, 20/25 PARGi (sağ altta) huzurunda hiçbir 53BP1 işe alım ve 5 hücreleri zayıf işe alım gösterdi gösterdi. Ölçek çubuğu 10 µm =. Bu rakam Saquilabon Cruz32güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lazer microirradiation DDR araştırma için kullanmanın yararları şunlardır:

1. bu farklı teşvik için uygun ve DNA'ın tutarları basit kırılmalara karmaşık DNA hasar zarar ve algılamak için farklı onarım faktörler DNA, siteleri lazer ışınlama parametreleri ayarlayarak zarar. Hasar birden çok kez aynı hücre çekirdeği içinde trans etkileri ( şekil 3) olduğu gibi değerlendirmek için mümkündür.

2. önemli, hasar siteleri ve başka bir yerde çekirdeğinde ortaya çıkan ikincil olayları gerçekleşen etkinlikler kolayca ayırt edilebilir.

3. fluorescently tagged protein dinamikleri dahil olmak üzere, bir tek hücre düzeyinde zarar karşılık yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı ölçümleri gerçekleştirmek mümkün ama bunlarla sınırlı olmamak üzere değil: Förster rezonans enerji transferi (FRET), () floresan ömür boyu görüntüleme FLIM), çift korelasyon işlevi (pCF), vb, DDR canlı hücrelerdeki yakalamak için.

4. RNA girişim veya inhibitörü tedavisi ile birleştirerek, nispeten az sayıda hücre içinde ters yönde faktör gereksinimi sınamak basit.

5. Ayrıca olmalıdır bu Nur (veya yeşil) kaydetti lazer radyasyon nükleotid analogları ile DNA'ın ön Sensitizasyonu gerektirmez veya böylece boya, DNA enterkalasyon istenmeyen yan etkileri Kromatin ambalaj üzerinde. Düşük doz, sensitizasyon gerektirir ve anormal DDR yüksek doz39,49,61, neden olan UV lazer sistemi aksine bu.

Protokolü/değişiklikler içinde kritik adımlar ve sorun giderme
Bu DDR analizleri yapı ve deneysel çeşitleri en aza indirmek için ne zaman gerçekleştirileceğini hücreleri sağlıklı koşullarda önemlidir. DNA veya siRNA transfected genellikle gridded coverslip üzerinde büyüyen daha duyarlı ya da kolayca müstakil hücrelerdir. Bu transfection çalıştığı sürece hücreler daha kısa zamanlarda transfection reaktif için tutmak ve daha transfected hücre untransfected hücrelere kıyasla gridded coverslip çanak üzerine tohum yardımcı olur. Bu deneyler için karşılaştırılabilir hücre akışlar sağlamak için gereklidir.

Bu timidin blok DDR etkiler ve sonuçları çarpık yüksek düzeyde eşitlenmiş hücreleri62, γH2AX için yol bildirilmiştir. Ayrıca, temel hat γH2AX sinyal bile olmadan herhangi bir eksojen hasar63,64S ve G2/M aşamasında daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Biz, ancak, herhangi bir önemli γH2AX sinyal etkileyen veya belirli γH2AX yanıt, hücreleri hasar lazer kaynaklı sitelerdeki müdahale nucleoplasm S/G2 aşamasında bir çift timidin blok51tarafından senkronize uygulamıyor.

Tutarlı sonuçlar elde etmek için lazer sistemi çıkış parametreleri (her 2-4 hafta) ve optik uyum (her 2 ay) düzenli olarak kontrol etmek gereklidir. Zamanla, lazer sistemi bileşenleri yeniden hizalanmış gerekebilir, objektif lens bozuk olabilir ve değiştirilmesi gerekir, ve toplam giriş gücü kararlılığını değişebilir. Hasar (çapraz (GBM ve/veya 6-4PP) ve baz hasarı (8-oxoG)), işaretleyici proteinler (örneğin, DNA glycosylases, Rad51, cohesin ve Ku) ve dozu belirlemek için bu iletişim kurallarını açıklanan PAR değişiklik varlığı değerlendirmek için anahtardır ve kullanılan lazer mikroskop sistem tarafından indüklenen DNA hasarı karmaşıklığı.

Teknik sınırlamaları
Lazer microirradiation sınırlamalar vardır. Lazer ışını tarafından indüklenen DNA hasar son derece doğal olarak meydana gelen için karşılaştırıldığında çekirdeği bir alanda kümelenmiş çekirdeği yayılabilir hasar. Bu-ebilmek değişmek hasar sinyal komşu Kromatin veya çekirdek nasıl dağıtılır. Görece az sayıda hücre aynı anda ışınlanmış beri biyokimyasal testleri (örneğin, Western blot, protein kompleksi arıtma, Kromatin immunoprecipitation (ChIP)) nüfus tabanlı kolayca gerçekleştirilemez. Güven fluorescently tagged proteinler (ile ifade eksojen rekombinant proteinlerin veya bu ile bile üzerinde endogenously CRISPR-aracılı etiketi ekleme kullanarak ifade) için dinamik görüntüleme çalışmaları füzyon kaynaklı protein etkisine açık hale getirir eserler. Lazer kaynaklı hasar eşsiz doğası ve potansiyel manipülasyonun etkileri proteinler, bu nedenle öğesini, geleneksel DNA yöntemleri (IR, kimyasal ajanlar zarar) zarar kullanarak sonuçları işlemekte ve endojen ile değerlendirilecek gerekir etiketsiz proteinler (ama bazen tam paralel deneyler yapmak mümkündür değil).

Mevcut yöntemler açısından önemi
Siteye özgü DSBs (kesinlikle basit DSBs) ikna etmek için alternatif bir strateji fingerprinting endonucleases-SCEI, FokI, AsiSI ve ben-PpoI gibi kullanımı sağlar. Faktör işe alım veya modifikasyon siteye özgü veya genom geniş ChIP analiz65,66,67,68,69tarafından çözümlenebilir. DSBs nispeten zaman uyumlu indüksiyon endonükleaz steroid hormon reseptörü ve bir bozulma sinyali (degron) hızlı nükleer translocation ve yıkımı, sırasıyla65,66 ile etiketleyerek elde edilebilir , 67 , 68 , 69. bir gerekir dikkate, ancak, bunu kabul endonükleaz ifade ve hedef site erişilebilirlik, verimliliğini ve devam eden onarım durumu değişken farklı hücrelerinde ve farklı hedef sitelerde olabilir. Bu heterogeneities hangi sonuçları çarpık nüfus tabanlı çipi analiz, ortalama. Lazer microirradiation, öte yandan, Uzaysal çözünürlük (submicrometer) tek hücre düzeyinde analiz edilebilir hasar yanıt dinamiklerin yanı sıra en yüksek olası geçici çözüm (milisaniye) sunmaktadır. Yüksek hasar yoğunluğu, ancak, sonucu etkileyebilir. Hem stratejileri hassas yapılara antikor erişilebilirlik ve/veya peptid etiketleme tarafından neden olabilir. Bu, bu nedenle, artılarını ve eksilerini potansiyel olarak birbirlerini tamamlayıcı kullanılan her iki stratejinin anlamak önemlidir.

Gelecek uygulamaları
Floresans görüntüleme ve dinamikleri teknikleri hızlı gelişme ile farklı tutarlarda ve türleri belirli konumları ve hücre döngüsü aşamasını DNA hasar ikna etmek için lazer sistemleri çok yönlülüğü hücresel sorguya çekmek için değerli bir fırsat sağlar ve DNA moleküler yanıt kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlüklü bir tek hücre düzeyinde zarar. Bu örneğin, hasar siteye özgü kızdırmak için mümkün ve çekirdek ve hücre çapında DDR sinyal iletimi milisaniyesini-çözünürlük ile (örneğin, moleküler etkileşimler ya da hasar siteler sadece, oluşan değişiklikleri incelemek tespit Kromatin yapısı içinde dinamik değişiklikleri gerçek zamanlı, ya da hasar sitelerden tüm çekirdeği sinyal zararın gerçek zamanlı yayılan gözlemlemek). Aynı hücre hücre kader DNA hasarı etkilerini incelemek için uzun bir süre takip etmek mümkündür. Biz lazer microirradiation yöntemleri, uygun bir şekilde, kullanıldığında DNA onarım alan ilerlemesi için önemli ölçüde katkı vermeye devam edeceğini öngörülüyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz Dr Akira Yasui Tohoku Üniversitesi, Japonya için GFP-NTH1 ifade Plazmid ve Dr Eros Lazzerini Denchi Scripps Araştırma Enstitüsü, La Jolla, Kaliforniya TRF2-YFP ve EGFP-53BP11220-1711 ifade plazmid için teşekkür ederiz. Bu eser Hava Kuvvetleri Office bilimsel araştırma (FA9550-04-1-0101) ve Beckman lazer Enstitüsü A.ş. Vakfı (için M.W.B), Ford Vakfı Bursu ve NSF MCB-1615701 ve CRCC Bilimleri (için B.A.S), ulusal Akademisi tarafından desteklenmiştir CRR-17-426665 (için K. Y.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread--chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R. Jr, Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed? Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A. Jr, Piccart, M. An update on PARP inhibitors--moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Genetik sayı: 131 lazer microirradiation tıp DNA hasarı DNA hasarı yanıt DNA tamiri Poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) karmaşık hasar lazerler tatili baz hasarı strand
<em>Vivo</em> hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B.… More

Kong, X., Cruz, G. M. S., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter