Summary
Bristen på verktyg för att mäta materialegenskaper och spännan parametrar i vivo förhindrar validera sina roller under utveckling. Vi anställd atomic force microscopy (AFM) och nanopartiklar-tracking att kvantifiera mekaniska funktioner på cellen intakt zebrafiskar embryo äggula under epiboly. Dessa metoder är pålitliga och allmänt tillämpliga undvika påträngande interventioner.
Abstract
Klarlägga de faktorer som direkt plats och tid organisation utvecklas vävnader är en av de primära uppgifterna i studien av utveckling. Olika propositioner påstår sig ha varit viktiga bidrag till förståelsen av de mekaniska egenskaperna av celler och vävnader i deras spatiotemporal organisation i olika utvecklings- och morphogenetic processer. På grund av bristen på tillförlitlig och lättillgänglig verktyg att mäta materialegenskaper och spännan parametrar i vivo, har validera dessa hypoteser dock varit svårt. Här presenterar vi metoder som anställer atomic force microscopy (AFM) och partikel spårning i syfte att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos cellen intakt zebrafiskar embryo äggula under epiboly. Epiboly är en tidig bevarade developmental process vars studie underlättas av insyn i embryot. Dessa metoder är enkla att genomföra, tillförlitliga och allmänt tillämpliga eftersom de övervinna påträngande interventioner som skulle kunna påverka vävnad mekanik. En enkel strategi tillämpades för montering av provexemplar, AFM inspelning och nanopartiklar injektioner och spårning. Detta synsätt gör dessa metoder lätt att anpassa till andra utvecklingsmässiga gånger eller organismer.
Introduction
De fysikaliska principer biomekaniska kontroll av morphogenetic processer är i hög grad odefinierat. Medan biomekaniska studier på molekylär och cellulär nivå samlas betydande momentum, är utforskandet av biomekaniska parametrar på vävnad/organism nivå i sin linda. Hydrodynamiska Regression1 eller Video tvinga mikroskopi2 tillåter forskare att skilja mellan aktiva och passiva styrkor, medan laser microsurgery3eller mindre påträngande atomic force microscopyen (AFM) dissocierade celler4 eller i vivo 5 eller nanopartiklar microrheology6 tillåta föregripande av en vävnads mekaniska egenskaper och svaren.
AFM är en tredimensionell topografiska teknik med hög atomär upplösning att lösa ytjämnhet och efterlevnad från omläggning av fribärande tips vid kontakt med en sonderade yta7. Olika metoder anställa AFM har utvecklats för att undersöka ytegenskaper, inklusive mäta friktion, vidhäftning styrkor och viskoelastiska egenskaperna hos olika material. Nyligen, AFM har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att hämta information på de mekaniska egenskaperna av biologiska prover. AFM kan i synnerhet icke-invasivt extrahera komplexa skjuvning modulus från enstaka celler genom att tillämpa oscillerande fördjupningar med micro spets bifogas en fribärande av kända böjande konstant8. Detta låter oss härleda resulterande styrkorna. Ännu, AFM är inte unika och olika metoder att utvinna reologiska data och mekaniska egenskaper från enskilda celler (t.ex. mikropipett aspiration9, magnetiska vrida flödescytometri (MTC)10, eller enaxlig brottgräns provning11).
Ändå, tillämpningen av dessa nya metoder för komplexa morphogenetic processer är inte okomplicerad. De huvudsakliga utmaningarna när bestämning av mekaniska egenskaper av embryonala vävnader är små (µm till mm), soft (i 102 - 104 Pa rad) och viskoelastiskt (ger upphov till tidsberoende fenomen) arten av de materiella12. Det är därför viktigt att anpassa de metoder som används för bestämning av mekaniska egenskaper (stelhet, viskositet, vidhäftning) det särskilda fallet av embryon och utveckla organismer. Två viktiga frågor behöver beaktas när man analyserar reologiska metoder att studera utveckling: att undvika påträngande störningar och ge lätt tillgänglighet. I det här fallet uppvisar mikropipett aspiration, MTC och tensile tester begränsningar. I det första fallet kan hög deformation som en cell lider påverka dess fysiologiska och mekaniska egenskaper9. I det andra fallet kan behöver ordentligt följa den experimentella vävnaden som ett substrat för att säkerställa att de påfrestningar tillämpas deformera cytoskelettet lokalt också införa effekter på cellernas aktiveringsläge och därmed i deras mekaniska funktioner10 . Sista, enaxlig brottgräns metoder begränsas av geometri utveckla organismer och tillgänglighet11.
AFM verkar vara bättre lämpad för studier av utvecklingsprocesser eftersom det tillåter studier av biologiska prover direkt i deras naturliga miljö utan någon besvärlig provberedning. Dessutom eftersom dissociation av embryonala vävnader är allmänt svårt, ger reducerade storleken på AFM sonder en hög grad av mångsidighet utan begränsning i valet av vilken typ av medium (vattenlösning eller icke vattenhaltigt), provtemperaturen eller kemiska provets sammansättning. AFM är mångsidig nog att tillämpas på stora domäner och tid skalor och har varit anställd att hämta materialegenskaperna hos vävnader i olika utvecklingsstadier eller fysiologiska förhållanden. Hela infödda vävnader såsom artärer13 eller ben14 har studerats ur ett topografiska synvinkel och i vissa fall, som sklera, mekaniska egenskaper har också läst15. Topografin har också undersökts i levande embryon möjliggör visualisering av, till exempel cell rearrangering under morfogenes i Xenopus16. Sista, omfattande prov förberedelse protokoll har utvecklats för att bestämma mekaniska parametrar under olika utvecklingsprocesser. Nanoindentation kartor har genererats på infödda ofixerad vävnad sektioner för chick embryonala mag-tarmkanalen11; självhäftande och mekaniska egenskaper hämtas för enskilda ektoderm, mesoderm och endoderm stamceller isoleras från gastrulating zebrafiskar embryon4; stelhet-mätningar som gjorts för epiblast och primitiva strimma på bladsticklingar från aviär embryon17; och ett distinkt mönster av stelhet övertoningar direkt definieras i Xenopus5embryonala hjärna.
Ett betydande kvalitativt språng för att tillämpa AFM för att utforska fosterutvecklingen kan komma från närmar sig enkla tillgängliga morphogenetic processer. Zebrafiskar epiboly är en väsentlig och bevarade händelse, där olika vävnader samordna i ett begränsat sfäriska utrymme att styra utbyggnaden av blastoderm i några timmar. På uppkomsten av zebrafisk epiboly (sfäriska arrangerar) täcker ett ytligt lager av celler, omslutande lagret (EVL), en semi sfäriska mössa av blastomerer centrerad på djur stolpe av embryot sitter på en massiv äggula syncytial cell. Epiboly består av kortikala vegetal ward expansion av EVL, djupa celler (DCs) blastoderm och det yttre lagret av cellen syncytial äggula (E-YSL) runt äggulan. Epiboly avslutas med nedläggningen av EVL och DCs vid vegetal pole18,19,20. Hur och var krafterna alstras under epiboly och hur de är globalt sammankopplade är ännu inte klart1,21.
Här beskriver vi i detalj hur man ansöker AFM för att härleda passiva mekaniska vävnad boenden under epiboly i zebrafiskar äggulan cell i vivo. Det gör anställt vi små mikrosfärer bifogas AFM utliggare som sonder. Detta tillåter hämtning av exakt lokal information inom icke-enhetlig äggula cellytan och studera spännan övertoningar och deras dynamik över tid. Alternativa AFM närmar sig till exempel med kil utliggare22, kommer inte göra lokala data som är tillräckligt exakt. Kil tekniken, som kräver mycket noggrann manipulation färdigheter att limma en kil som är större än urvalsstorleken i slutet av uthänget, är inte väl lämpad för avsökning av embryo (~ 2 gånger större än längden av uthänget) mekanik.
Modellering och karaktärisera de viskoelastiska egenskaperna av celler i kvalitativa och kvantitativa sätt möjliggör en bättre förståelse för deras biomekanik. Från en biomekanisk synvinkel är det viktigt att förstå epiboly, och inte bara efterfrågan kunskaper på kortikal spänning mätningar och dynamik, som kan extraheras av AFM; Således finns det behov av information om biofysiska egenskaper av vävnad. Extrahera informationen genom en mängd olika cell reologi tekniker har utvecklats under åren för att karakterisera olika celltyper enligt olika fysiologiska villkor23. De inkluderar AFM, MTC och optisk pincett (OT). Dessa metoder, men har visat otillräcklig för Mesoskopisk analyser på omfattningen av embryon eller organ. Som ett alternativ, har vi framgångsrikt anpassat nanopartikel-tracking microrheology6 för i vivo reologiska mätningar. Denna teknik analyserar de Brownian förskjutningarna av enskilda partiklar och härleder lokala mikromekaniska boenden.
Grupp AFM och nanopartiklar microrheology att definitionen av kortikala spännan dynamics och inre mekaniska egenskaper av äggulan under epiboly. Denna information stöder fullt ut en modell där Anisotrop stress framkallar till följd av skillnader i EVL deformation svar och den äggula cytoplasmiska lager (YCL) isotropiskt actomyosin sammandragning av E-YSL cortex är viktigt för directional netto rörelsen av EVL och epiboly progression1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll steg beskrivs nedan följa riktlinjerna för djurens vård av våra institutioner.
1. zebrafiskar kultur
- Ras och underhålla vuxna zebrafiskar under standart villkorar.
Obs: AB och TL vildtyp embryon användes för denna studie. - Samla in embryon och odla dem på 28,5 ° C i E3 embryo medium24. Arrangera dem enligt morfologi som tidigare beskrivits19.
2. atomic Force Microscopy
- Manuellt dechorionate iscensatt zebrafiskar embryon (i olika åldrar enligt enskilda intressen). Ta bort chorions med två tunna och vassa pincetten (se Tabell för material).
- Grepp chorion med hjälp av en pincett och göra en tår i det med andra tången. Håller chorion i en region förhållande till revan, tryck därefter embryot försiktigt genom öppningen.
- Utföra dechorionation under ett dissekera stereomikroskop med en justerbar utbud av förstoring mellan 8 X och 50 X.
- Montera embryon för AFM
- Bered en lösning av 2% agaros i embryo medium och fyll en 35 mm petriskål med detta. Låt det stelna. Gör små hål av 1,5 mm i diameter (två gånger embryo storleken) och cirka 350 µm djup (embryo hälften) med tunn pincett i agaros sängen.
- Placera embryona i de Petar gjort i agaros lagret och försäkra de på plats genom att sprida runt en lösning av 0,5% låg smälter agaros i embryo medium. Häll denna lösning runt bara embryon att säkra dem i hålen.
- Innan låg smältpunkt Agarens stelnar i rumstemperatur, vrid embryona på ett sådant sätt att regionen i intresse att bli utforskad av AFM kommer att möta uppåt (figur 1A).
- Undersöka embryona av AFM
- Leta upp och bild embryon i petriskål sysselsätter ett 20 X-objektiv i en inverterad Atomic Force Mikroskop (se Tabell för material25) vid rumstemperatur (23-24 ° C).
Obs: Embryona hålls levande nedsänkt i embryo medium och bifogas agaros sängen. - PROBE äggula cellytan av gjuten embryon anställa sfäriska polystyren pärlor 4,5 µm i diameter bifogas en fribärande med en nominell våren konstant 0,01 N/m. Ange peak-to-peak amplituden av svängningen fribärande 5 µm och dess frekvens till 1 Hz.
- Samla in data för varje region ska testas i olika positioner och i flera embryon, som en rutin, för data i genomsnitt.
Obs: En bra utgångspunkt är att probe fem positioner ligger i mitten och i hörnen av en 10 µm x 10 µm kvadrat genom att kontrollera fribärande ställning med XY piezo-manöverdonen mikroskopet AFM. Imaging och datainsamling tog ca 20 min per embryo. Registrera data i olika regioner av embryo äggula cellens yta, kan t.ex., vegetal pole eller olika regioner nära EVL celler marginalen (figur 1B och 1 C), endast göras genom att anställa olika exemplar orienterade annorlunda.
- Leta upp och bild embryon i petriskål sysselsätter ett 20 X-objektiv i en inverterad Atomic Force Mikroskop (se Tabell för material25) vid rumstemperatur (23-24 ° C).
- Beräkna krafterna
- Mäta den vertikala förskjutningen av AFM uthänget (z) med töjningsmätaren sensorer kopplade till piezo-ställdon, och dess böjning (d) använda en kvadrant fotodiod av metoden optisk spaken med programvaran Mikroskop kontroll (se Tabell för material ( 25).
- Använd lutningen av en d-z-kurva som erhålls från data som samlats in från en bare region i ett täckglas för att kalibrera korrelationen mellan fotodiod signalen och den fribärande deformationen (d).
Obs: Den uppmätta vertikala förskjutningen är lika med den fribärande deformationen och lutningen representerar nedböjning känsligheten hos den optiska spak26. - Härleda den fribärande vår konstanten (k) från de termiska variationerna beskrivs som tidigare27.
- Beräkna indragningen av provet (h):
h = (z - zc) -(d - doff) (1)
Obs: Här zc är positionen av kontaktpunkten och doff är förskjutningen av fotodioden. - Beräkna kraft (F) på av uthänget som:
F = k · d (2)
- Beräkna spänningen av cortex i form av en flytande-ballong modell bestående av ett elastiskt skikt av kortikala spänning Tc omslutande en trögflytande vätska. I den här modellen för små inbuktningar (jämfört med storleken på embryot), ökar force proportionellt4,28 som:
F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
Obs: Här Rb är radien av kornet och Re är radien av embryot. För zebrafiskar embryot, som radien av embryot (400 µm) är två storleksordningar större än pärlan (2,25 µm), kan denna ekvation approximeras som:
F = 4π Tc h (4)- Beräkna spänningen kraft-indraget (F-h) kurvor i varje embryo äggula cell region för fem olika peka mätningar.
- Beräkna den Tc för varje F-h kurvan av ickelinjära minstakvadratmetoden montering. För statistisk analys, kortikala spänningen Tc beräknas måste vara i genomsnitt från olika F-h kurvor.
- Mäta de viskoelastiska egenskaperna (reologi) av cortex genom att tillämpa låg amplitud (100 nm) Multi svängningar under AFM består av sinusvågor med olika frekvens25.
- Beräkna en effektiv komplexa modulus g*(ƒ) i frekvensplanet från kraft indrag kurvorna som:
g * (f), = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
här i är den imaginära enheten och F(f) och h(f) är frekvensen (f) spektra av kraft och indrag. b är korrigeringen för trögflytande dra på uthänget utvinns ur svängningarna tillämpas på ytan. - Separat g*(ƒ) i reella och imaginära delar som:
g * (Ƒ) = g' (f) + ig'' (f) (6)
EM > g'(f) är elasticitetsmodulen och är ett mått på den elastiska energin lagras och återvinnas per cykel av svängningen. g'' (f) är trögflytande modulus som står för energin som avges. - Beräkna förlust tangent, vilket ger ett index av solid-liknande (< 1) eller flytande-liknande (> 1) beteende av materiellt, som:
g'' (f) / g' (f) (7)
Obs: Med denna typ av mätning, är det möjligt att extrahera parametrar som anger hur trögflytande och hur elastiskt är sonderade material. Även om b beror lite på avståndet mellan slutet av uthänget på ytan, med tanke på de mycket låga värdena av g´´ utställda av äggulan cellen (se figur 2D nedan), små variationer i b har en försumbar inverkan i de mätningar29.
- Beräkna en effektiv komplexa modulus g*(ƒ) i frekvensplanet från kraft indrag kurvorna som:
3. partikel spårning Microrheology
-
Utföra partikel Mikroskop till cellen äggula
- Fabricera skräddarsydda mikronålar med hjälp av en horisontell mikropipett avdragare och kapillär borosilikatglas (se Tabell för material).
- Förbereda mikronålar som har en yttre diameter på 1,00 mm, en inre diameter på 0,58 mm och en längd av 10 cm med avdragare inställningar: Tryck: 500; Värme: 510; Pull: 65; Hastighet: 25; Tid: 50.
- Förbereda en injektion petriskål plattan genom att skapa raka indrag körfält i en 1% agaros i embryo medelstora säng anställa anpassade gjort formar (se Tabell för material).
- Vänd formarna upp och ned och placera dem ovanpå det flytande agarosgel och ta bort formarna när gelen stelnat. Pipettera embryon i spåren av mögel i Agarens under ett dissekera stereomikroskop på 1,2 X förstoring.
Obs: Bredden och utformningen av formarna aktivera embryona som själv justera.
- Vänd formarna upp och ned och placera dem ovanpå det flytande agarosgel och ta bort formarna när gelen stelnat. Pipettera embryon i spåren av mögel i Agarens under ett dissekera stereomikroskop på 1,2 X förstoring.
- Före injektion, nästan helt ta bort mediet för att underlätta injektion (ytspänning förhindrar embryo/chorion fastnar på nålen när du tar bort det efter injektion).
- Microinject fluorescerande nanopartiklar (radie en = 100 nm, se Tabell för material) utspätt i vatten (1:1, 000) i den vegetabiliska delen av embryo äggula cellen (figur 3A).
- Justera mikropipett med precision micromanipulators och injicera pärlor med en automatisk microinjector med tid och tryck kontroller (se Tabell för material). Ställ in trycket mellan 10 och 20 psi.
- Innan du injicerar pärla lösningen, kalibrera volymen att injicera (0,5 nL) genom att mäta droppstorlek levereras av microinjector med ett 1 x 0,01 mm objektmikrometern (se Tabell för material).
- Anställa en förstoring på 1.6 X i dissekera stereomikroskopet att visualisera embryon under injektionerna, som utförs i rumstemperatur.
- Fabricera skräddarsydda mikronålar med hjälp av en horisontell mikropipett avdragare och kapillär borosilikatglas (se Tabell för material).
-
Bedöma viskoelastiska beteendet för äggulan genom inspelning termiska variationer
- Dechorionate microinjected embryon som i steg 2.1 och bädda in dem i en 0,5% låg smältning pekar agaros i embryo medium lösning vid 30 ° C. Efteråt, överföra dem till glas botten pläterar (se Tabell av material) och orientera och driva dem mot täckglaset när Agarens är fortfarande flytande.
Obs: När Agarens stelnar i rumstemperatur, embryon är redo att avbildas. - Placera de embryon som monteras i glas botten pläterar på scenen av en confocal inverterade mikroskopet 2 h efter Mikroskop. Fånga bilder av nanopartiklarna för 26 s vid en samplingsfrekvens på 25 Hz med ett 63 X-objektiv i rumstemperatur i en inverterad confocal Mikroskop anställa standard kommersiella Mikroskop mjukvaran (pixelstorlek = 166 nm, bilder tagna varje 40 ms).
- Beräkna partiklarnas centroids ställning och definiera deras banor över tiden med TrackMate plugin av öppen källkod ImageJ programvara (figur 3B).
- Beräkna den tvådimensionella Mean Square deplacement (MSD) av varje partikel med skräddarsydd programvara6,30 som:
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
Obs: Här t är förfluten tid och fördröjningen. I en ren trögflytande vätska ökar MSD omvänt med viskositet (ν) enligt Stokes-Einstein förhållandet:
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
där T är den absoluta temperaturen.
- Dechorionate microinjected embryon som i steg 2.1 och bädda in dem i en 0,5% låg smältning pekar agaros i embryo medium lösning vid 30 ° C. Efteråt, överföra dem till glas botten pläterar (se Tabell av material) och orientera och driva dem mot täckglaset när Agarens är fortfarande flytande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kortikala spänning mätningar
För varje mätpunkt, fem kraft-deplacement (F-z) kurvor förvärvades av AFM genom rampning av uthänget på 1 Hz med en topp-till-topp amplituden av 5 µm (hastighet = 10 µm/s) upp till en maximal indrag av ~ 2 µm. Proceduren tog mindre än 20 min och påverkades inte av epiboly progression. Varje experimentella villkor testades i minst 5 embryon.
Kraft-deplacement kurvorna registreras på embryo äggula cell, tvärtom att de motsvarar den mjuk omgivande agarosen, uppvisar en proportionell linjärt samband (R2 > 0,999) (figur 2A). Vi genomförde ytterligare uppsättningar av kontroll F-z kurvor på 3 µm/s och 30 µm/s och kasseras en potentiella beroendet av kortikala spänning Tc på hastigheten av uthänget. Tc ökade bara med 13% (p < 0,01, t-test) när hastigheten sänktes från 10 till 3 µm/s och visade inte någon betydande förändring när ökade från 10 till 30 µm/s.
Kraft-indrag (F-h) kurvor inspelad på en fribärande hastighet av 10 µm/s på äggula cellen var nästan linjär och försedda med en vätska-ballong modell (figur 2B)1. Det här tillbehöret tillåts vid beräkningen av de absoluta värdena för genomsnittlig ytspänning (pN/µm) vid olika epiboly stadier och olika positioner i förhållande till EVL framkant (identifieras under genomlysning) (tabell 1).
Reologi av cortex
Skillnaderna mellan de indrag och indragning av kraft-deplacement (F-z) kurvor (figur 2 c) indikerar ett viscoelastic uppförande av embryo äggula cell cortex. Låg amplitud (100 nm) Multi svängning mätningar ger information för att beräkna den effektiva komplexa modulus g*(ƒ) äggula cellytan och dess elastiska och viskösa komponenter (se protokollet ovan).
Cortex reologi i cellen zebrafiskar embryo äggula domineras av en solid-liknande beteende med trögflytande modulus 5 gånger lägre än elasticitetsmodul1. Detta beteende är inte frekvens beroende, antingen för elastiskt (ANOVA, p = 0.123), eller för trögflytande modulus (ANOVA, p = 0.719) (figur 2D).
Reologi äggulan
Viskositeten hos äggulan beräknades genom att montera ekvation (5) MSD uppgifter från nanopartiklar spårning (se figur 4A-B). MSD av termiska variationer av fluorescerande nanopartiklar inbäddade i äggulan uppvisar ett proportionellt beroende på eftersläpning τ, konsekvent med uppförandet av en Newtonsk vätska. Effektiv skjuvning viskositeten av äggulan, som är omvänt relaterad till bulk Diffusionskoefficienterna av nanopartiklar, var 129 mPa·s.
Figur 1: AFM zebrafiskar äggula celler invivo. (A) Diagram som beskriver uppsättningen upp anställd sond zebrafiskar äggula cell cortex av AFM. Dechorionated embryon i olika åldrar var halvvägs in i hål skapas i anpassade agaros block, roteras i en viss läggning och förseglas på kanterna med låg smältpunkt agaros. Äggula cellerna var utforskad med sfäriska polystyren pärlor bifogas en fribärande (röd). (B) Embryo på 50% epiboly hälften inbäddad i agaros utforskad med en fribärande (falskt färgade i rött) på den vegetal Polen. (C) en motsvarande embryot till det i B, sonderade på cellen äggula i en region nära EVL celler marginalen. Skala barer = 100 µm (B och C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Zebrafiskar embryo äggula cell kortikala spänning och reologi. (A) kraft [nedböjning (d)]-deplacement (z) kurvor som erhållits för en representativ embryo eftersom fribärande spetsen närmar sig och kontaktar provet [agaros ytan (kontroll) i blått] och äggula cellytan i rött. (B) tvinga indrag (F-h) kurvor (n = 3 embryon, 3 mätningar per embryo på ett avstånd av 10 µm från varandra. Varje mätning representerar medelvärdet av 5 kurvor) passar med en vätska-ballong modell (från referens1). Observera den linjära ökningen nedböjning vid kontakt med embryo äggula cellens yta. Den Streckad svart linjen visar montering på modellen (som kortikal spänningen är slutsatsen). (C) tillnärmning (röd) och indragning (lila) kraft-deplacement kurvor för en representativ embryo. Böjda röda och lila pilarna pekar på den temporal regimen för datainsamling. Dubbelpilen belyser skillnaden mellan den annalkande och infällbara nedböjning värden pekar viskoelastiska karaktär av cortex. (D) viskoelasticitet av äggula cell cortex (n = 5 embryon). Effektiv komplexa modulus (g *) ur multi svängningar AFM mätningar (från 1). Röda symbolerna representerar elasticitetsmodulen (g'), och blå symboler definiera trögflytande modulus (g″), respektive. Menar och medelfel (SE) visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Partikel spårning microrheology. (A) fluorescerande nanopartiklar injiceras i cellen äggula zebrafiskar embryon vid 50% epiboly. (B) spårades förskjutningar för enskilda nanopartiklar slumpmässigt fördelas inom äggulan (vänster). Tidsförloppet för typiska trajectoriesen av nanopartiklar (centroids) inbäddad i äggulan (2 exempel) utställning random promenader som är karakteristiska för trögflytande diffusion. Skalstapeln = 100 µm (A). 1 µm (B, vänster). 200 nm (B, höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Microrheology av zebrafisk embryo äggulan. (A) MSDs av enskilda nanopartiklar (n = 99) uppvisar ett ungefärligt linjärt beroende med fördröjning. (B) menar ± medelfel MSDs av nanopartiklar och viskositet äggulan. Ensemble i genomsnitt MSDs (medelvärde - röd linje ± SE) av nanopartiklar befolkningen utställningar huvudsakligen trögflytande karaktär. Linjär slutta av förhållandet återspeglar egenskaperna Diffus i nanopartiklarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Spänning (pN/mm) medelvärde ± SE | % av Epiboly | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| Avstånd till EVL marginal | 20 μm (E-YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μm (YCL) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| Vegetal Pole | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 embryon (5 inbuktningar på varje) för varje villkor | ||||
Tabell 1: Plats och tid spänning fördelningen äggula cellytan under Epiboly.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi att materialets egenskaper och vissa biomekaniska parametrar av zebrafisk äggula cellen under epiboly lätt kan uppskattas av AFM och nanopartiklar microrheology.
Medan AFM har varit anställd att hämta reologiska egenskaper av celler och vävnader i fysiologiska förhållanden4,5,25,28, utvecklat här vi ett protokoll för att tillämpa AFM i intakt utveckla embryon som vi anställts för att testa äggula cellytan zebrafiskar embryots under epiboly.
För våra AFM mätningar säkrades orienteringen av embryon genom halv bädda in dem i låg smälttemperatur agaros. Agaros inbäddning påverkade dock inte AFM mätningar. Styvheten Agarens mättes genom sondering dess yta med en sfärisk spets. Vi hittade en Youngs modul (E) 4,2 0,2 Pa för denna gel genom att montera kraft-indrag kurvorna med Hertz kontakta modell av en sfär som drar in en plan yta av en elastisk kropp. Med tanke på att E 3g', Agarens var 50-fold mjukare än äggula cell cortex (figur 2D). Därför, med tanke på dess begränsade tjocklek och mycket låg styvhet, AFM mätningarna registreras ovanpå embryot verkar vara extremt tillförlitliga.
Det är viktigt att notera att hämtar absoluta värden för kortikala spänning från AFM data kräver extrem försiktighet på angående mekaniska modell montering. När det gäller zebrafiskar äggula cellen, med sin unika sammansättning med mikrotubuli-rika cytoplasmiska ytterlager som omfattar en mycket trögflytande äggula massa, vi kringgå problemet anställa en vätska-ballong modell som består av en elastisk cortex omslutande en trögflytande vätska. Denna modell har använts tidigare att uppskatta kortikala spänningen av leukocyter med mikropipett aspiration28, sfäriska stamceller från gastrulating zebrafiskar embryon indragen med sfäriska AFM tips4och HeLa cells med AFM använda inklämd utliggare22.
Vi beräknade cellen äggula kortikala spänning av indrag dess yta med en kommersiellt tillgänglig små sfäriska spetsen. Denna lilla sond tillät oss att direkt mäta regionala skillnader i kortikala spänning. Som beskrivits ovan, tolkades kraft-indrag data i form av en minimal vätska-ballong modell (ekv 2). Kraft kurvor inspelad på ytan av geler och celler med ett sfäriskt tips öka med indrag som en makt lag med en 3/2 exponent. Däremot hittade vi en proportionell kraft-indrag relation mycket väl utrustade med Eq. 2 (figur 2B). Lite beroende av Tc fribärande hastighet och låg g'' /g' nyckeltalet (figur 2D) visar att cortex mekanik domineras av ett elastiskt beteende.
Äggula mekanik var självständigt utforskad med microparticle reologi. En linjär ökning av MSD observerades tydligt återspeglar en ren trögflytande beteende. Det bör noteras att viskositeten av polymerlösningar beror på storleken på den sond31. Därför värdet av äggula viskositet vi mätt med en sond 100 nm i radie kunde något skiljer sig från molekylär (t.ex., fluorescerar depolarisation) eller makroskopiska mätningar. Sammantaget ger dessa resultat starkt stöd till lämpligheten av den vätska-ballong modellen och robustheten hos de kortikala mätningarna för spänning och äggula viskositet.
Vi därför att detta tillvägagångssätt enkelt skulle kunna utvidgas för att mäta blastoderm mekanik i samma embryon eller till andra utvecklingsmässiga tidpunkter i zebrafiskar och slutligen till andra organismer. Denna tillnärmning beror endast på tekniska passande fästmaterial förfaranden (se referens32) underlätta för AFM sonder till rätt ställen vid rätt tidpunkt. Ändå bör kontinuerlig rörelse i de flesta celler och vävnader under utveckling beaktas i alla program till andra utvecklingsmässiga modeller. Cell rörelser kommer att göra tillämpningen av dessa metoder mycket mer utmanande.
I vissa fall skulle AFM i vivo vara tillämplig om tillgänglighetsproblem inte kan övervinnas. Både i utvecklingsländer embryon och vuxna är celler till stor del otillgängliga. Därför, för att testa biofysiska egenskaper i situ, är imperativ att anställa metoder inte krävs direkt kontakt. Nanopartiklar spårning microrheology uppfyller dessa krav6. Denna teknik är baserad på en analys med hög rumsliga och temporal upplösning av de Brownian förskjutningarna av enskilda partiklar. Lokala mikromekaniska egenskaperna av viskoelastiska vätska som omger dessa nanopartiklar är en direkt återspegling av omfattningen och eftersläpning-beroende av sina belastningsbesvären. Detta tillvägagångssätt har redan tillämpats på utveckla organismer och har bidragit till att fastställa mycket trögflytande karaktär av C. elegans embryo cytoplasman30. Vi avslöjade att en zebrafiskar äggula visar likvärdiga egenskaper med C. elegans embryon, även om dess viskositet är två tiopotenser lägre. Linjär tid beroende av MSD med liknande värden av äggula viskositet med zebrafiskar äggulan har nyligen rapporterats i Drosophila33.
Även om vi inte oss utforska denna möjlighet, har injicerade obestruket och bestruket nanopartiklar nyligen anställts som mål för optisk pincett i zebrafiskar larverna34. Icke-invasiv mikromanipulation släpper en hel-organismen kan ge inte bara direkta insikter in cell interaktioner men in mekaniska egenskaper och aktiviteter inte är tillgängliga med hjälp av befintliga metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Amayra Hernández-Vega och Philippe-Alexandre Pouille för deltagande i ställa in grunden för dessa protokoll. Vi tackar också molekylär Imaging plattformen från IBMB-PCB, Xavier Esteban och medlemmar av laboratoriet för kontinuerligt stöd. Programmet konsoliderade grupper av Generalitat de Catalunya och DGI och Consolider bidrag från ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft i Spanien till EMB och DN stött detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
