Summary
ونقدم في المختبر نموذجي الذي يسمح بدراسة وتحليل تخثر الدم في كامل، غير أنتيكواجولاتيد الدم. منع تخثر الدم في النظام يعتمد على تأثير التخثر الطبيعية من خلايا غشائي سليمة وسيؤدي إلى تنشيط الخلايا البطانية في تخثر الدم.
Abstract
في فيفو، خلايا بطانية لها أهمية حاسمة منع تخثر الدم الطبيعية المتمثلة في تعميم الدم. ونتيجة لذلك، تنشيط الخلية البطانية يؤدي إلى تخثر الدم. يتم ملاحظة هذه الظاهرة في كثير من الحالات السريرية، مثل زرع الأعضاء حضور قبل تشكيل الأجسام المضادة المضادة الجهات المانحة، بما في ذلك السلالة، فضلا عن إصابة الاسكيمية/ضخه. من أجل الحد من التجارب الحيوانية وفقا 3R المعايير (الحد والاستبدال والصقل)، في المختبر نماذج لدراسة تأثير الخلية غشائي التنشيط في تخثر الدم سيكون مرغوباً فيه جداً. ومع ذلك، توفر أنظمة المسطحة المشتركة الثقافة غشائي خلية نسبة السطح إلى الحجم من 1-5 سم2 من البطانة كل مل دم، والذي لا يكفي لمنع تخثر الدم الطبيعية، بطانية بوساطة. استزراع خلايا بطانية على الخرز ميكروكارير قد تزيد نسبة السطح إلى الحجم إلى 40-160 سم2/mL. هذا زيادة نسبة غير كافية لضمان منع تخثر الدم "الطبيعية" للدم كله، حتى أنه يمكن تجنب استخدام مضادات التخثر. هنا وصف لدراسة آثار التعديل الوراثي لخلايا بطانية الخنزير على تخثر الدم البشري غير أنتيكواجولاتيد كله، في المختبر ميكروكارير نظام قائم. في مقايسة الموصوفة، خلايا بطانية الابهر الأساسي الخنزير، أما نوع البرية (WT) أو المحورة وراثيا للبشرية CD46 ثرومبومودولين، نمت على حبات ميكروكارير وثم يتعرض للدم البشري الطازج مرسومة من غير أنتيكواجولاتيد. هذا النموذج يسمح للقياس والتقدير الكمي للإفراج عن سيتوكين فضلا عن تفعيل علامات لتكملة وتخثر في بلازما الدم. وباﻹضافة إلى ذلك، التصوير لتنشيط الخلية البطانية وترسب المناعية، مكملاً وتخثر البروتينات على الخرز اندوثيلياليزيد أجريت بالفحص المجهري [كنفوكل]. يمكن أيضا استخدام هذا التحليل لاختبار العقاقير التي من المفترض أن تمنع تنشيط الخلية البطانية، ومن ثم، تخثر الدم. علاوة على قدرتها على خفض عدد الحيوانات المستخدمة لمثل هذه التحقيقات، مقايسة وصف سهلة لتنفيذ واستمرار استنساخه.
Introduction
البطانة الوعائية تتكون من أحادي الطبقة لخلايا بطانية (EC) الذي خط التجويف الأوعية الدموية. في حالة فيزيولوجية، هادئة الجماعة الأوروبية المسؤولة عن الحفاظ على بيئة مضادة للالتهابات وتخثر الدم. 1 هذا هو وساطة من التعبير عن تخثر الدم والبروتينات المضادة للالتهابات على سطح المفوضية الأوروبية. على سبيل المثال، تنشيط الجماعة الأوروبية الناجمة عن الاسكيمية/ضخه الإصابة أو رفض الأوعية الدموية (كرة-) زرع أجهزة النتائج في تغيير سطح غشائي من تخثر الدم والدولة للالتهابات إلى تخثر المؤيدة والمحترفين التحريضية الدولة. 1
لدراسة التفاعل بين العوامل البطانة وتخثر، نماذج في المختبر التي تحاكي كرائعة ومعقدة عن كثب قدر الإمكان الحالة في فيفو مرغوب فيه للغاية. حد مشترك الذي يميز التقليدية في المختبر فحوصات تخثر الدم هو استخدام الدم أنتيكواجولاتيد مما يجعل تحليل الآثار بوساطة تخثر شاقة ولا يمكن استنساخها حتى ريكالسيفيكيشن من سيتراتيد الدم كله النتائج التي يمكن الحصول عليها بدماء جديدة غير أنتيكواجولاتيد. 2 وعلاوة على ذلك، في نظم الثقافة التقليدية مسطحة الخلية من المستحيل استغلال خصائص التخثر البطانة كما لا يمكن الوصول إلى سطح خلية بطانية كافية لحجم الدم. النموذج المعروض هنا ويتغلب على هذه القيود باستزراع المفوضية الأوروبية على سطح حبات كروية ميكروكارير، حيث أن نسبة سطح إلى دم المفوضية الأوروبية من > يمكن الوصول إلى/mL 16 سم2، وهي مماثلة للحالة في الشرايين الصغيرة أو الأوردة، و التي وصفت كافية للسماح لمنع تخثر الدم "الطبيعية" الدم بالسطح المفوضية الأوروبية. 3 , 4 يمكن استخدام الدم كله دون إضافة مضادات التخثر في هذا الإعداد. ويمكن جمع عينات الدم أثناء التجربة والسيتوكينات، وعوامل التخثر ويمكن الكشف عن علامات التنشيط مكملاً للذوبان وتقديرها كمياً. وعلاوة على ذلك، قد حلل الخرز ميكروكارير المغلفة بالمفوضية الأوروبية لترسب مكملاً والغلوبولين المناعي، فضلا عن التعبير عن علامات تنشيط الجماعة الأوروبية بالفحص المجهري [كنفوكل]. ويشمل تطبيق آخر للاهتمام اختبار العقاقير التي من المفترض أن تمنع تنشيط الخلية البطانية، ومن ثم، تخثر الدم. 5 على الرغم من أن هذا النموذج لا يمكن أن تحل تماما محل التجريب الحيواني، ويوفر طريقة لاختبار فرضيات وظيفية محددة السابقين فيفو استخدام الخلايا وبالتالي تقليل عدد الحيوانات المستخدمة في البحوث الأساسية بشأن الاسكيمية/الاكسجينيه زرع الإصابة أو (كرة).
استخدم نموذج وصف لتقليد السلالة من الإعداد في أي خلايا بطانية الابهري الخنزير (الباكستانية) هي نمت على الخرز ميكروكارير والمحتضنة مع الدم البشري غير أنتيكواجولاتيد كله،. وجرى تحليل الباكستانية المعدلة وراثيا مختلفة، تحمل جينات بشرية عديدة مثل CD46 لتنظيم نظام مكمل و/أو ثرومبومودولين (هتبم) لتنظيم نظام تخثر الدم، لخصائصها التخثر. محكم الخاضعة لسيطرة نظم غشائي خلية التنشيط وتكملة والتخثر ومترابطة. 6 فمن المهم أن نفهم كيف تتصرف الخلايا المحورة وراثيا مختلفة بعد التعرض للدم البشري فيما يتعلق بالتصاق جزيء التعبير والإفراج عن سيتوكين، ذرف جليكوكاليكس وفقدان البروتينات التخثر. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الخنازير Landrace الألمانية (ولدت نوع البرية ولدت في مزرعة محلية والمعدلة وراثيا في معهد التربية الحيوانية الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية، جامعة لودفيغ ماكسيميليان ميونيخ، ألمانيا)، تزن بين 30 كغم إلى 40 كجم، واستخدمت في هذه الدراسة. تم إيواء جميع الحيوانات تحت ظروف قياسية مع الماء والغذاء الإعلانية المكتبة. أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لقانون المملكة المتحدة الحيوانات (إجراءات علمية) ودليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، فضلا عن قانون حماية الحيوان السويسرية. جميع الدراسات الحيوانية تمتثل للمبادئ التوجيهية سيصلون. وافقت اللجنة على التجارب الحيوانية الخدمات البيطرية الكانتونات (كانتون برن، سويسرا) جميع الإجراءات الحيوان، إذن لا. BE70/14. كانت البروتوكولات التجريبية المكرر وفقا لمبادئ 3R والتخدير الدولة للفنون، وإدارة الألم واستخدمت للتقليل من عدد الحيوانات والحد من التعرض للحيوانات للإجهاد والألم أثناء التجارب.
الدم وكان رسمها فينيبونكتوري نظام مغلق وفقا للمبادئ التوجيهية الاختصاص والأخلاق السويسرية في مستشفى جامعة برن من الأشخاص الأصحاء. العبارة " الدم غير أنتيكواجولاتيد " يعني أن الدم لم تعالج بأي تخثر.
الخطوات التالية تتم تحت ظروف معقمة. مطلوب الإلمام بتقنية تعقيم ثقافة الخلية الأساسية-
1-"عزل الباكستانية"
ملاحظة: تم الحصول على شرائح الشريان الاورطي الصدري من 6 إلى 10 سم من الخنازير Landrace الألمانية euthanized من 3 إلى 6 أشهر من العمر (يستخدم لتجارب أخرى في فيفو) وعلى الفور تحويلها إلى استخدام زجاج 500 مل زجاجة تحتوي على وسيطة النقل (دميم + 1% البنسلين/ستربتوميسين).
- قبل معطف صفيحة 6-جيدا مع فيبرونيكتين 12.5 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني 1 x ووضعه في حاضنة في 37 درجة مئوية حاء 1
- الحارة قبل PBS العقيمة 1 x وخلية الثقافة المتوسطة (دميم)-
- إخراج الشريان الاورطي الخنزير من النقل المتوسطة-
- مكان الشريان الاورطي على لوحة البوليستيرين.
- مطاردة مع برنامج تلفزيوني الحارة بلطف مسبقاً.
- قطع الشريان الاورطي طوليا وإصلاحه بالإبر.
- إضافة الخلايا الحارة الثقافة المتوسطة على سطح السفينة الداخلية-
- اعقلوها فيبرونيكتين-خلية الثقافة المتوسطة وإضافة خلايا جديدة الثقافة المتوسطة (دميم وتستكمل مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين و 0.4 في المائة من نمو الخلايا غشائي المتوسطة الملحق ميكس).
- نقع واحد مسحه القطن في مستنبت الخلية. مسحه براعم القطن والصوف في أعلى جداً من على سطح السفينة الداخلية بلطف وبطء في نفس الاتجاه.
- فرك الخلايا في بئر واحدة للوحة 6-جيدا جولة بجولة-
- القيام بنفسه بالنسبة لبقية الآبار.
- فحص الخلايا تحت المجهر، ووضع لوحة 6-جيدا في حاضنة في 37 درجة مئوية، 5% CO 2-
- تغيير في المتوسط في اليوم الثاني وتغييره مرة أخرى كل 2-3 أيام-
- عند الخلايا ستكون المتلاقية، تريبسينيزي الخلايا والبذور منها في قارورة T75 (P1 الباكستانية)-
2. توصيف الباكستانية
- معطف مسبقاً تشامبيرسليدي 8-جيدا مع فيبرونيكتين 12.5 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني 1 x ووضعه في حاضنة في 37 درجة مئوية حاء 1
- البذور 5 × 10 4 خلايا/حسنا واحتضان بين عشية وضحاها في الحاضنة في 37 درجة مئوية.
- تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني ++ (برنامج تلفزيوني وتستكمل مع كاكل 2 ومجكل 2)، 300 ميكروليتر/حسنا.
- إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 3.7 في المائة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، 200 ميكروليتر/حسنا.
- يغسل خلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ++، 300 ميكروليتر/حسنا.
- إضافة 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x-3_% جيش صرب البوسنة (حظر العازلة) وتترك 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- تطبيق الأجسام المضادة الأولية (مكافحة-هاء-كادهيرين، CD31 المضادة، مكافحة vWF) المخفف في برنامج تلفزيوني 1x-1%BSA-0.05% المنظفات، 160 ميكروليتر/حسنا واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
- أغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ++ (200 ميكروليتر في البئر).
- تطبيق الأجسام المضادة الثانوية و DAPI المخفف في برنامج تلفزيوني 1x-1%BSA-0.05% المنظفات، 160 ميكروليتر/حسنا، واحتضان ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
- أغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ++ (200 ميكروليتر في البئر).
- جبل الشرائح مع والغليسيرول المتصاعدة على أساس المتوسط والتحقق من الخلية البطانية علامات التعبير تحت مجهر fluorescence.
ملاحظة: يتم التوصل إلى ثقافة الخنزير خلايا بطانية الابهري في قارورة T175 (دميم الجلوكوز منخفضة متوسطة + 10% FBS 1% البنسلين/ستربتوميسين و 0.4 في المائة من نمو الخلايا غشائي المتوسطة الملحق ميكس) حتى التقاء 90%. (بذر الكثافة 1 × 10 6 خلايا، التقاء 90% تناظر تقريبا 5 × 10 6 خلايا).
3. طلاء من "حبات ميكروكارير"
- ميكس 7 مل حبات ميكروكارير مع 42 مل من محلول الكولاجين في أنبوب 50 مل (100 ميكروغرام/مل، تضعف في محلول حمض الخليك 0.2%)، واحتضان ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
- تغسل حبات مرتين مع 25 مل من برنامج تلفزيوني درجة الحموضة 7.4 (إضافة 25 مل من برنامج تلفزيوني، ومزيج جيد مع بيبيت والانتظار حتى يتم تسوية الخرز أسفل ثم تجاهل المادة طافية وتكرار)، ومرة واحدة مع 25 مل متوسطة دميم.
- تغطية الخرز في أنبوب 50 مل مع 10 مل متوسطة 199 تستكمل مع 10% FBS، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 1% ل الجلوتامين، 0.4 في المائة من "نمو الخلايا غشائي المتوسطة الملحق ميكس" و 25 ميكروليتر من الهيبارين (5000 وحدة دولية/مل) والسماح بالموازنة لمدة 10 دقائق قبل استخدامها مرة أخرى.
4. جمع الخلايا
- إزالة مستنبت الخلية من قارورة T175 تتضمن الباكستانية وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني الأس الهيدروجيني 7.4.
- "إزالة برنامج تلفزيوني" من قارورة T175-
- إضافة 5 مل يدتا Trypsin-0.05% واحتضان لمدة 3-4 دقائق على 37 درجة مئوية.
- جمع الخلايا قبل الشطف قارورة مع 15 مل من خلية الثقافة المتوسطة ونقل التعليق في أنبوب 50 مل.
- الطرد المركزي الخلايا في 1,200 س ز لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة الزائدة المتوسطة وريسوسبيند بيليه في 5 مل مستنبت الخلية.
5. زرع الخلايا في "قارورة محرض"
- إضافة 20 مل من خلية الثقافة المتوسطة إلى تعليق خلية وريسوسبيند-
- إضافة 20 مل خلية الثقافة المتوسطة (ث/س الخلايا) في قارورة 500 مل محرض المغناطيسي.
- إضافة الخلايا إلى الخرز ميكروكارير غسلها من الخطوة 3، 3 ويخلط بعناية ماصة 25 مل مصلية.
- نقل الخليط الخرز/خلية في قارورة الدوار المغناطيسي.
- شطف أنبوب 50 مل مع 10 مل من خلية الثقافة المتوسطة لجمع الخلايا المتبقية.
- إضافة مل 85 إضافية من خلية الثقافة المتوسطة في قارورة غزل ووضعه في الحاضنة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شاكر (ز 100 x، خلط الفاصل الزمني: 3 دقيقة كل 45 دقيقة).
- إضافة 50 مل من خلية الثقافة المتوسطة (إجمالي حجم 200 مل) ويستمر التحريك لإضافية 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في شاكر (ز 100 x، خلط الفاصل الزمني: 3 دقيقة كل 45 دقيقة).
- إضافة عديم اللون ربمي المتوسطة (تستكمل مع 10% FBS، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 1% ل الجلوتامين، 0.4 في المائة من "نمو الخلايا غشائي المتوسطة الملحق ميكس" و 25 ميكروليتر الهيبارين) حتى يتم التوصل إلى 320 مل من إجمالي حجم.
- محل المتوسط كل مل ح 48: إزالة 100 من المتوسطة القديمة وإضافة 100 مل من جديدة تستكمل ربمي عديم اللون. الثقافة
- الخلايا لمدة 5 إلى 7 أيام. يعتمد الوقت على حالة التقاء الخرز المغلفة بالخلية.
- جمع 200 ميكروليتر من حبات المغلفة بالخلية باستخدام ماصة وتحويلها إلى أنبوب البوليبروبيلين.
- تغسل حبات 3 مرات مع 600 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x (إضافة برنامج تلفزيوني، إمالة بأنبوب والمزيج برفق تجنب المفرزة من الخلايا، وانتظر الخرز يستقر وتجاهل برنامج تلفزيوني وكرر).
- إصلاح الخرز لمدة 10 دقائق بإضافة 200 ميكروليتر من حمض بارابيكريك-
- أغسل 3 مرات مع 600 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 العاشر-
- DAPI إضافة المخفف في برنامج تلفزيوني 1 x واحتضانها للحد الأدنى 10
- نقل الخرز على شريحة زجاجية وتطبيق ساترة استخدام الجلسرين على أساس تصاعد المتوسطة-
- تصور الخرز تحت مجهر [كنفوكل]-
7. الإجراء التجريبي
- إزالة الخرز المغلفة بالخلية من قارورة محرض المغناطيسي (إجراءات قد لا ينبغي القيام به تحت ظروف معقمة) مع ماصة 10 مل مصلية وتحويلها إلى مل 12 جولة لأسفل أنابيب البولي بروبلين.
- اسمحوا الخرز يستقر (حوالي 1-2 دقيقة) وإزالة الزائدة المتوسطة-
- إضافة الخرز أكثر للأنابيب حتى كل أنبوب يحتوي بالضبط 2 مل خرز-
- إضافة 5 مل ربمي واضحة لكل أنبوبة والمزيج بعناية باستخدام ماصة مصلية 10 مل.
- اسمحوا الخرز يستقر وإزالة الزائدة المتوسطة-
- كرر الإجراء الغسيل أكثر من مرة واحدة مع ربمي وإزالة جميع الزائدة المتوسطة-
8. الحضانة مع الدم أنتيكواجولاتيد عدم
- بعناية وبطء (باستخدام طائرة ولا فاكوتينيرس) سحب الدم من متطوعة صحية وأنه جمع في مل 9 أنابيب البولي بروبلين محايدة (لا تخثر الدم)-
- ببطء نقل 8 مل دم مع ماصة 10 مل مصلية في كل من أنابيب البولي بروبلين الذي يحتوي على 2 مل حبات المغلفة بالخلية (الحجم الإجمالي سيكون 10 مل). دائماً تجنب معالجة الخام من الدم أو الخرز لتجنب تفعيل الجماعة الأوروبية سابقا لأوانه. يستغرق الإجراء دقيقة 1-2
- بعناية إمالة خليط الدم/حبة ضمان خلط متساوية وختم الغطاء مع الفيلم البارافين.
- مكان الأنابيب على طاولة إمالة أفقية (مع إعدادات إمالة لطيف فقط) داخل حاضنة 37 درجة مئوية، وسجل تخثر مرات.
- في فترات زمنية محددة، مثلاً بعد 10، 20، 30، 50، 70، 90 دقيقة، إزالة مالا يقل عن 1.5-2 مل خليط الدم-حبة لتحليل مصل أو بلازما.
ملاحظة: للنقاط الزمنية 6 نقترح وجود أكثر من 3 replicates داخل مجموعة واحدة من الخلايا، كما سوف يتم أخذ عينات الدم في أنابيب مختلفة- - لجمع المصل، ترك الدم يتجمد. إضافة يدتا أو سترات لجمع البلازما، إلى أنابيب 2 مل في قبل إضافة عينات الدم.
- تخزين الأنابيب على الجليد والطرد المركزي في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وتخزين المصل/بلازما عند 80 درجة مئوية حتى استخدام.
ملاحظة: يتم توفير تفاصيل على المواد في الجدول للمواد
- في فترات زمنية محددة، مثلاً بعد 10، 20، 30، 50، 70، 90 دقيقة، إزالة مالا يقل عن 1.5-2 مل خليط الدم-حبة لتحليل مصل أو بلازما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد 7-10 أيام للثقافة في قارورة زر الزيادة والنقصان (الشكل 1) كانت الخلايا المتلاقية، تغطي كامل سطح الخرز ميكروكارير (الشكل 2). تحقق حالة كونفلوينسي خطوة هامة لأنه أحادي الطبقة غير روافد من المفوضية الأوروبية على ميكروبيدس سوف يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في وقت التخثر، نظراً ميكروكارير سطح حبات بشدة المؤيدة تخثر (تخثر الوقت: 4 ± 1 دقيقة) ( 3 الشكل).
هناك نقطة هامة أخرى التي تحتاج إلى الاهتمام هو سرعة لوحة إمالة. وستعزز بسرعة عالية إمالة تخثر الدم. ويمكن ملاحظة إطالة وقت التخثر إذا كان أحادي الطبقة للمفوضية الأوروبية الحالية على سطح الخرز ميكروكارير. استخدام جالتكو/hCD46/هتبم الباكستانية المعدلة وراثيا أظهرت زيادة كبيرة في وقت التخثر مقارنة WT الباكستانية (الشكل 3). نظراً لغياب إكسينوانتيجين غال-α-1، 3-غال في الباكستانية (جالتكو) أظهرت زيادة في تخثر الوقت (± 25 دقيقة 8 لوزن الباكستانية) و 68 ± 30 دقيقة "جالتكو الباكستانية". لوحظ زيادة قوي آخر في تخثر الوقت عندما كانت موجودة على الخرز ميكروكارير الباكستانية جالتكو/hCD46/هتبم (205 ± 32 دقيقة)، مما يوحي تحوير ناجحة لتكملة (hCD46) وأنظمة تخثر الدم (هتبم). يتم تعريف نهاية التجربة عندما يتم تشكيل جلطة مرئية. التباين داخل عينات من نفس المجموعة سبب كل جملة تقلب المقايسة والجهة المانحة الدم. وكان كل تجربة 3 replicates وكل مرة مختلفة استخدمت الدم الجهات المانحة لزيادة موثوقية البيانات. لكل جهة مانحة، أجرى تحليلاً لدم (الصفيحات ومكافحة حرائق آبار النفط، وربك، وكليات التقنية العليا ومعلمات أخرى) من قبل مختبرات الرعاية الصحية الخارجية. يتم الحصول على النتائج هو موضح في الشكل 3 من تجارب مختلفة يؤديها مع المتبرعين بالدم المختلفة.
رقم 1: التمثيل التخطيطي للتحليل القائم على ميكروكارير- يتم توسيع الاتحاد الأوروبي في قوارير T175 (A) و (ب) نقل إلى قوارير غزل جنبا إلى جنب مع الخرز المغلفة بالكولاجين ميكروكارير. (ج) يتم جمع الدم الطازجة غير أنتيكواجولاتيد من متطوع صحي، (د) تمتزج الخرز ميكروكارير المغلفة بالمفوضية الأوروبية، والمحتضنة في 37 درجة مئوية. يقصد بعبارة "غير أنتيكواجولاتيد الدم" أن الدم لم تعالج بأي تخثر الدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تلطيخ الفلورة على الخرز المغلفة بالمفوضية الأوروبية ميكروكارير- حبات ميكروكارير تم استردادها والملون ل CD31 (بيكم-1) لتقييم كونفلوينسي. الأنوية كانت الملون باللون الأزرق (DAPI) و CD31 وكان الملون باللون الأحمر (Cy3). شريط الحجم: 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تخثر أوقات مختلفة ec. تم تحديد أوقات التخثر بصريا وعرف نهاية التجربة عندما لوحظ جلطة مرئية. وقد لوحظ تأثير قوي بروكواجولانت عندما تعرضت الخرز المغلفة من المفوضية الأوروبية غير ميكروكارير للدم البشري كله من غير أنتيكواجولاتيد. نظراً لغياب إكسينوانتيجين غال-α-1، 3-غال في الباكستانية (جالتكو) أظهرت زيادة في تخثر الوقت (± 25 دقيقة 8 لوزن الباكستانية) و 68 ± 30 دقيقة "جالتكو الباكستانية". ولوحظ حدوث زيادة أخرى في تخثر الوقت عندما كانت الباكستانية جالتكو/hCD46/هتبم موجودة على الخرز ميكروكارير، مما يوحي تحوير ناجحة لتكملة (hCD46) وأنظمة تخثر الدم (هتبم). وترد البيانات ك ± متوسط الانحراف المعياري. تم التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA لمقارنات متعددة مع تصحيح بونفيروني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النموذج المعروض هنا مناسبة تجلط الدم المتصلة بالدراسات يسمح تحليل جوانب مختلفة من التخثر وتفاعله مع الجماعة الأوروبية. 8 في البحوث السلالة، ونظام مفيد لاختبار التخثر خصائص مختلفة ECs الخنزير المعدلة وراثيا بعد الحضانة مع الدم البشري 9.
الخطوات الأكثر أهمية البروتوكول هي ضمان تغطية الخلية كاملة (كونفلوينسي) ميكروبيدس قبل البدء التجربة وتلك المتصلة بجمع دقيق ومناولة الدم كله غير أنتيكواجولاتيد لتجنب سابق لأوانه تنشيط الصفائح الدموية بسبب ارتفاع القص الإجهاد، والتي يمكن أن تحدث إذا كان يتم استخدام فاكوتاينيرس لجمع الدم. مع ذلك، هذا النظام لديه بعض القيود، بما في ذلك عدم وجود نظام مغلق مغلق 10 وعدم إجهاد القص الفسيولوجية التي من الأفضل تمثل الشروط في فيفو .
وعلى الرغم من هذه القيود، القائمة نموذج وصف عروض مزايا كبيرة عبر حاليا نماذج. بسبب استخدام الخرز ميكروكارير، هو زيادة السطح المفوضية الأوروبية أن نسبة حجم الدم، مما يتيح إنشاء البيئة المضادة تخثر والمضادة للالتهابات واستخدام الدم كله غير أنتيكواجولاتيد. في نماذج الثقافة مسطحة الخلية الحالية، هذا غير ممكن، والآليات التي تنطوي على تخثر الدم بسبب التنشيط المفوضية الأوروبية ولذلك غالباً ما تتطلب استخدام التجارب الحيوانية. في جزء منه، وهذا يمكن تجنبها باستخدام نموذج ميكروكارير وصف حبة.
وعلاوة على ذلك، يسمح هذا النظام لمجموعة واسعة من التطبيقات. يتواجد براعة في إمكانية اختبار مختلف العقاقير أو المركبات التي لا زرع تتصل (كرة-) فحسب بل أيضا البشرية من الأمراض. يمكن تقييم آثار المخدرات على البطانة ونظام تخثر الدم بسهولة الفلورة وإليزا وتحليل مجموعة تعليق متعدد. وقد تم ذلك سابقا في دراسة عن تأثير التعبير المحورة وراثيا من ثرومبومودولين البشرية في وضع السلالة. 11
يمكن أن تكون إمكانية إدخال تعديل الأسلوب وصف جمع الدم كله أنتيكواجولاتيد غير مباشرة في الأنابيب التي تمتلئ سابقا مع الخرز المغلفة بخلية بغية تقليل تنشيط الاتصال الجوي ودم باستخدام ماصة. استخدام خلايا بطانية الابهري البشرية (حايك) قد يكون عنصر تحكم مثيرة لاهتمام والفعل أدمجت في الخطط المستقبلية. قد يتم استخدام تغليفه الأرغون الأنابيب للحد من اتصال الدم غير أنتيكواجولاتيد مع الهواء، والذي يعرف بأن يؤدي ذلك إلى الاتصال بتفعيل تتالي التخثر. إذا كان يتم رسمها الدم بسرعة كبيرة جداً، على سبيل المثال باستخدام أنابيب فراغ فضاء مع ستوبكوكس المطاط، وإدخال الدم إلى الأنبوب في طائرة غرامة، ثم الصفائح الدموية تصبح تنشيط والتخثر سيحدث عاجلاً. لتفادي تنشيط الصفائح الدموية، استخدام الإبر إبر كبيرة قطرها (21ɢ-16ɢ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية" (سنسف، رقم المنحة 320030_156193). يشكر المؤلفون الدكتور بونوا ويرلين لتوفير الخرز ميكروكارير بيوسيلون. ونشكر أيضا الأستاذ الدكتور هانز بيتر كولر والبروفسور أندريه هايبيرلي للمساعدة في إعداد نموذج حبة ميكروكارير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit - FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2 mL in 500 mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
References
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
- Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
- Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
- Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
- Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
- Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
- Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
- Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
- Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
- Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
