Summary
我们提出了一个体外模型, 允许对整个 non-anticoagulated 血液中的凝血进行研究和分析。该系统的抗凝血依赖于健康的内皮细胞的天然抗凝作用, 内皮细胞活化会导致血栓形成。
Abstract
在体内, 内皮细胞是血液循环的自然抗凝血的关键。因此, 内皮细胞活化导致凝血。这种现象在许多临床情况下被观察, 象器官移植在存在预先 anti-donor 抗体, 包括异种移植, 并且在缺血或再灌注损伤。为了减少动物实验根据3R 标准 (减少, 替换和提炼),在体外模型研究内皮细胞活化作用对凝血是非常可取的。然而, 普通的平板系统的内皮细胞培养提供了一个表面积的比例为 1-5 厘米2的内皮每毫升的血液, 这是不足够的自然, 内皮介导的抗凝。在载体珠上培养内皮细胞可使表面积率提高到 40-160 cm2/毫升。这种增加的比例足以确保 "自然" 的全血抗凝, 从而可以避免使用抗凝剂。本文介绍了一种体外microcarrier-based 系统, 研究了猪内皮细胞的遗传修饰对全 non-anticoagulated 人血液凝固的影响。在所述的测定方法中, 原发猪主动脉内皮细胞, 无论是野生型或转基因的人 CD46 和血栓调节蛋白, 都生长在载体珠上, 然后暴露在新绘制的 non-anticoagulated 人血中。该模型可以测量和量化的细胞因子释放, 以及活化标志的补充和凝聚在血浆中。此外, 通过共聚焦显微镜对活化的内皮细胞进行成像, 并在 endothelialized 珠上进行免疫球蛋白、补体和凝血蛋白的沉积。这种化验也可以用来测试药物, 这是应该防止内皮细胞活化, 从而, 凝血。在它的潜力, 以减少动物的数量用于此类调查, 所述的化验是容易执行和一贯重现性。
Introduction
血管内皮由一单层内皮细胞 (EC) 组成, 它能使血管的腔管排成一线。在生理状态下, 静止 EC 负责维持一个抗凝和抗炎环境。1这是由 EC 表面的抗凝和抗炎蛋白的表达所介导的。例如, 由异移植器官的缺血/再灌注损伤或血管排斥引起的 EC 活化导致内皮表面从抗凝和抗炎状态转变为 pro-coagulant 和炎国家.1
为了研究内皮和凝血因子之间的奇妙和复杂的相互作用,在体外模型, 模仿尽可能密切的在体内情况是非常可取的。传统的体外凝血分析的一个共同的局限是使用抗凝血液, 使得凝血介导的作用复柠檬酸全血不能重现结果可获得新鲜 non-anticoagulated 血。2此外, 在传统的平板细胞培养系统中, 不可能利用内皮的抗凝血特性, 因为不能达到每个血液体积的足够的内皮细胞表面。该模型通过在球形载体珠表面培养 ec, 克服了这些局限性, 使 ec surface-to-blood 比 #62; 16 厘米2/毫升可以达到, 这是类似的情况下小动脉或静脉,被描述为足以使血液在 EC 表面进行 "自然" 抗凝。3,4全血可以在不添加抗凝剂的情况下使用。血液标本可在实验过程中采集, 细胞因子、凝血因子和可溶性补体活化标志物均可检测和量化。此外, 还可以通过共聚焦显微镜对补体和免疫球蛋白的沉积以及 ec 活化标记物的表达进行分析, 对 ec 包覆的载体珠进行研究。另一个有趣的应用包括测试药物, 这应该是防止内皮细胞活化, 从而, 凝血。5虽然这个模型不能完全取代动物实验, 它提供了一种方法来测试特定的功能假说,前体使用细胞, 从而减少了动物的数量, 用于基础研究的缺血/再灌注损伤或 (异) 移植。
用该模型模拟了猪主动脉内皮细胞 (PAEC) 在载体念珠上生长并与整个 non-anticoagulated 人血培养的异种移植环境。不同的转基因 PAEC, 携带了一些人类基因, 如 CD46 调节的补充系统和/或血栓调节蛋白 (hTBM) 的调节凝血系统, 分析了他们的抗凝血性能。内皮细胞活化、补体和凝血系统受到严密控制和相互连接。6因此, 重要的是要了解不同的转基因细胞在接触人体血液后的行为与黏附分子的表达和细胞因子的释放、糖的脱落以及抗凝蛋白的丧失有关。7
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Protocol
德国长白猪 (野生型养殖在当地的农舍和转基因育种研究所的分子动物繁殖和生物技术学院, 德国慕尼黑, 路德维希-马西米兰大学, 重量介于30公斤到40公斤之间, 被用于这项研究。所有的动物都被安置在标准条件下的水和食物 ad lib 。所有动物实验都是按照《英国动物法》 (科学程序) 和《 NIH 指南》对实验动物的照顾和使用以及瑞士动物保护法进行的。所有动物研究符合到达的指南。县兽医服务的动物实验委员会 (瑞士伯尔尼的小行政区) 批准了所有动物规程, 允许没有。BE70/14实验规程根据3R 原则被提炼, 并且最先进的麻醉和痛苦管理被用于减少动物的数量和减少动物的曝光在实验期间的重音和痛苦.
血液是根据瑞士司法管辖和伯尔尼大学医院的道德准则, 通过闭合系统静脉穿刺从健康人身上抽取的。词组和 #34; non-anticoagulated 血液和 #34; 意味着血液没有被抗凝治疗.
以下步骤在无菌条件下执行。熟悉碱性细胞培养无菌技术是必需的.
1. PAEC 的隔离
注意: 6 至10厘米的胸主动脉段是从3至6月的安乐死的德国长白猪获得的 (用于其他 体内 实验), 并立即转移到一个500毫升的玻璃瓶含有运输介质 (DMEM + 1% 青霉素/链霉素).
- 预涂一个6井板, 纤维连接蛋白12.5 和 #181; PBS 1x 中的 g/毫升, 并把它放在一个孵化器在37和 #176; C 为 1 h.
- 预热无菌 PBS 1x 和细胞培养基 (DMEM).
- 从传输介质中取出猪主动脉.
- 将主动脉置于聚苯乙烯板上.
- 事先轻轻地用暖 PBS 冲洗.
- 纵向切开主动脉并用针固定.
- 在内容器表面添加暖细胞培养基.
- 吸入纤维连接蛋白-细胞培养基和添加新鲜细胞培养基 (DMEM 补充 10% FBS, 1% 青霉素/链霉素和0.4% 的内皮细胞生长培养基补充剂).
- 在细胞培养基中浸泡一棉签。在内容器表面的顶端轻轻地和缓慢地在同一方向上擦拭棉毛芽.
- 将6个井板中的单元格旋转一圈.
- 对其余的油井也这样做.
- 检查显微镜下的细胞, 将6井板放在孵化箱中37和 #176; C, 5% CO 2 .
- 在第二天更改媒体, 每 2-3 天更改一次.
- 当细胞要汇合时, 处理细胞并将它们种子成 T75 烧瓶 (PAEC P1).
2。PAEC 特性
- 前涂层 8 chamberslide 与纤维连接蛋白12.5 和 #181; PBS 1x 中的 g/毫升, 并把它放在一个孵化器在37和 #176; C 为 1 h.
- 种子 5 x 10 4 细胞/井和孵化过夜在孵化器在37和 #176; C.
- 使用 pbs 清洗两次电池 + + (pbs 补充 CaCl 2 和氯化镁 2 ), 300 和 #956; L/好。
- 在室温、200和 #956 中用3.7% 甲醛固定电池10分钟; L/好.
- 使用 PBS 清洗电池3次 + + , 300 和 #956; L/好.
- 添加300和 #956; PBS 1 x-3% BSA (阻塞缓冲器), 室温下保持30分钟.
- 使用 PBS 1 x-1%BSA-0.05% 洗涤剂, 160 和 #956 中稀释的初级抗体 (抗 VE 钙黏附素, anti-CD31, anti-vWF); L/井, 室温下孵育1小时.
- 使用 PBS 洗涤3次 + + (200 和 #956; 我/好).
- 在 PBS 1 x 1%BSA-0.05% 洗涤剂、160和 #956 中应用二次抗体和 DAPI 稀释剂, 在室温下孵育1小时.
- 使用 PBS 洗涤3次 + + (200 和 #956; 我/好).
- 用甘油为基础的安装介质安装幻灯片, 并在荧光显微镜下验证内皮细胞标志物的表达.
注: 培养猪主动脉内皮细胞在 T175 烧瓶 (DMEM 低葡萄糖培养基 + 10% FBS, 1% 青霉素/链霉素和0.4% 的内皮细胞生长培养基补充剂) 直到90% 汇合到达。(播种密度 1 x 10 6 单元格, 90% 汇合大约对应于 5 x 10 6 单元格)。
3。载体珠的涂层
- 将7毫升载体珠与42毫升的胶原蛋白溶液混合在一个50毫升的管中 (100 和 #956; 在0.2% 醋酸溶液中稀释), 在室温下孵育 1 h.
- 用25毫升 pbs pH 7.4 洗涤珠两次 (添加25毫升 pbs, 与吸管混合, 并等待, 直到珠被安顿下来, 然后丢弃上清和重复), 一次与25毫升的 DMEM 介质.
- 覆盖50毫升管中的珠子, 10mL 培养基199补充 10% FBS, 1% 青霉素/链霉素, 1% l-谷氨酰胺, 0.4% 的内皮细胞生长培养基补充剂和25和 #956; 肝素 (5000-毫升) 的 l, 并允许平衡10分钟在进一步使用之前.
4。收集单元格
- 从包含 PAEC 的 T175 烧瓶中删除细胞培养基, 并添加5毫升的 PBS pH 值 7.4.
- 从 T175 烧瓶中删除 PBS.
- 添加5毫升的 Trypsin-0.05%edta 和孵育 3-4 分钟, 在37和 #176; C.
- 通过用15毫升的细胞培养基冲洗烧瓶来收集细胞, 并在50毫升的管子中转移悬浮液.
- 在室温下离心 1200 x g 的细胞8分钟, 去除多余的培养基, 在5毫升的细胞培养基中重颗粒.
5。将细胞播种到搅拌器烧瓶中
- 将20毫升的细胞培养基添加到细胞悬浮和重.
- 将20毫升细胞培养基 (w/o 细胞) 加入到500毫升的磁力搅拌器烧瓶中.
- 将单元格添加到步骤3.3 中的洗涤载体珠, 并将其与25毫升的血清吸管进行仔细混合.
- 将珠子/电池混合物转到磁纺纱瓶中.
- 冲洗50毫升管与10毫升的细胞培养基收集剩余的细胞.
- 将额外的85毫升细胞培养基添加到微调器烧瓶中, 并在37和 #176 过夜放入恒温箱中; C 在振动筛上 (100 x g, 混合间隔: 3 分钟每45分钟).
- 添加50毫升的细胞培养基 (总体积200毫升), 并继续搅拌额外的24小时, 在37和 #176; C 在一个振动筛 (100 x g, 混合间隔: 3 分钟每45分钟).
- 添加无色 RPMI 培养基 (补充 10% FBS, 1% 青霉素/链霉素, 1% l-谷氨酰胺, 0.4% 的内皮细胞生长培养基补充剂和25和 #956; l 肝素) 直到320毫升的总体积达到.
- 每48小时更换培养基: 去除100毫升的旧培养基, 加入100毫升的新鲜补充无色 RPMI.
- 将单元格的区域性培养为5到7天。时间取决于细胞包裹的珠子的汇合状态.
- 收集200和 #956; 使用吸管将细胞包裹的珠子移到聚丙烯管中.
- 3 次用600和 #956 清洗珠子; pbs 1x (添加 pbs, 倾斜管和轻轻混合, 以避免细胞脱落, 等待珠子安顿下来, 丢弃 pbs 和重复).
- 通过添加200和 #956 来固定10分钟的珠子; parapicric 酸的 L.
- 使用600和 #956 清洗3次; PBS 1x.
- 添加 DAPI 稀释在 PBS 1x 和孵化10分钟.
- 在玻璃滑梯上传送珠子, 用甘油为基础的安装介质应用片.
- 在共聚焦显微镜下可视化珠子.
7。实验过程
- 从磁性搅拌器烧瓶中取出电池包覆的珠子 (程序不必在无菌条件下进行), 用10毫升的血清学吸管将它们转移到12毫升的圆底聚丙烯管中.
- 让珠子安定下来 (大约 1-2 分钟) 并且去除多余的媒介.
- 添加更多的珠子到管, 直到每管包含整整2毫升的珠子.
- 在每根管子上加5毫升的透明 RPMI, 并使用10毫升的血清吸管进行仔细的混合.
- 让珠子沉淀下来, 去除多余的介质.
- 再重复一次洗涤过程与 RPMI 和去除所有多余的媒介.
8。非抗凝血的孵育
- 小心而缓慢地 (既不使用喷气机也不 vacutainers) 从一个健康的志愿者那里抽取血液并在9毫升的中性聚丙烯管中收集 (没有抗凝剂).
- 缓慢转移8毫升血液与10毫升血清学吸管到每一个聚丙烯管含有2毫升的细胞包覆珠 (总体积将是10毫升)。避免粗暴处理血液或珠子, 以避免过早的 EC 活化。该过程需要 1-2 min.
- 小心地倾斜血/珠混合物, 以确保相同的混合和密封的上限与石蜡膜.
- 将管子放在一个水平的倾摆台上 (仅有温和的倾斜设置) 在37和 #176 内; C 恒温箱和记录凝固时间。
- 在设置的时间间隔内, 例如 在10、20、30、50、70、90分钟后, 删除至少 1.5-2 毫升的血珠混合物, 用于血清或血浆分析.
注: 对于6时间点, 我们建议在一组细胞内有超过3复制, 因为血液取样将在不同的管中进行. - 收集血清, 让血液凝固。要收集血浆, 加入 EDTA 或柠檬酸盐到2毫升管前添加血液样本.
- 将管在冰上, 离心机在 2500 x g 为10分钟在4和 #176; c 和储存血清/血浆在80和 #176; c 直到使用.
注意: 材料的详细信息在 材料表
- 在设置的时间间隔内, 例如 在10、20、30、50、70、90分钟后, 删除至少 1.5-2 毫升的血珠混合物, 用于血清或血浆分析.
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Representative Results
在 7-10 天的文化在微调瓶 (图 1) 的细胞是汇合的, 覆盖整个表面的载体珠 (图 2)。70-100 状态的验证是一个重要的步骤, 因为 non-confluent 单层的 EC 在微将导致明显减少凝血时间, 因为载体珠的表面强烈 pro-coagulant (凝固时间: 4 ± 1 min) (图 3)。
另一个需要注意的重要问题是倾斜板的速度。高的倾斜速度会增强血液凝结。如果在载体珠的表面存在一单层 EC, 可以观察到凝固时间的延长。GalTKO/hCD46/hTBM 转基因 PAEC 的使用表明, 与 PAEC (图 3) 相比, 凝血时间明显增加。Gal-α-1,3-Gal xenoantigen 在 PAEC (GalTKO) 的缺席表明凝血时间增加 (25 ±8分钟 PAEC 重量和68±30分钟 PAEC GalTKO)。当 PAEC GalTKO/hCD46/hTBM 存在于载体珠 (205 ± 32 min) 上时, 观察到凝血时间的另一种强烈增加, 这意味着补体 (hCD46) 和凝血系统 (hTBM) 的成功调制。实验的结束是在一个可见的血块形成的时候定义的。同一组样本内的变异性是由于不同的测定-变异性和血液供体。每个实验都有3次复制, 每次使用不同的献血者来增加数据的可靠性。对于每个捐献者, 血液分析 (血小板计数, 白细胞, 红细胞, 小贩和其他参数) 由外部医疗实验室进行。在图 3中显示的结果是通过不同的献血者进行的不同实验得到的。
图 1: Microcarrier-based 分析的示意图表示法.(A) EC 在 T175 烧瓶和(B)中被扩展到旋转瓶中, 并与胶原涂层的载体珠一起转移。(C)新鲜 non-anticoagulated 血液是从一个健康的志愿者, (D)混合与 EC 涂层的载体珠, 并在37° c 孵化。"non-anticoagulated 血" 一词意味着血液没有被任何抗凝剂治疗。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: EC 涂层载体珠的免疫荧光染色.载体珠被检索和染色的 CD31 (PECAM-1), 以评估70-100。细胞核被染成蓝色 (DAPI), CD31 染成红色 (Cy3)。刻度条: 100 微米。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 不同 EC 的凝固次数.凝血时间是确定的视觉和实验结束时, 确定了一个可见的血块观察。当非 EC 包覆的载体珠暴露在整个 non-anticoagulated 人血中时, 观察到强烈的促效应。Gal-α-1,3-Gal xenoantigen 在 PAEC (GalTKO) 的缺席表明凝血时间增加 (25 ±8分钟 PAEC 重量和68±30分钟 PAEC GalTKO)。当 PAEC GalTKO/hCD46/hTBM 存在于载体念珠上时, 观察到凝血时间的进一步增加, 这意味着补体 (hCD46) 和凝血系统 (hTBM) 的成功调制。数据显示为平均±标准偏差。采用方差分析法对 Bonferroni 校正进行多次比较。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
该模型适用于凝血相关研究, 可以分析凝血的不同方面及其与 EC 的相互作用。8在异种移植的研究中, 用人血9对不同基因修饰的猪 ECs 的抗凝血性能进行检测是一个有用的系统。
该协议最关键的步骤是确保微在开始实验之前的完整的细胞覆盖率 (70-100), 以及那些关于仔细收集和处理 non-anticoagulated 全血以避免过早血小板活化由于高剪切应力, 这可能发生, 如果 vacutainers 是用来收集血液。10然而, 这个系统有一些限制, 包括没有一个循环关闭系统和缺乏生理剪应力, 这将更好地代表在体内条件。
尽管存在这些限制, 但所描述的模型比目前现有的模型具有显著的优势。由于使用载体珠, EC 表面的血容量比增加, 允许建立抗凝和抗炎环境和使用 non-anticoagulated 全血。在目前的平板细胞培养模型中, 这是不可能的, 因为 EC 活化引起的血液凝结的机制经常需要使用动物实验。在一定程度上, 这可以避免使用所描述的载体珠模型。
此外, 该系统还允许应用范围广泛。它的多功能性驻留在测试不同的药物或化合物的可能性, 这不仅涉及 (异) 移植, 但也与人类疾病。药物对内皮和凝血系统的影响可以通过免疫荧光法、ELISA 法和多重悬液阵列分析来方便地评估。这是以前做的研究中的基因表达的人血栓调节蛋白在异种移植设置的影响。11
对所述方法的一种可能的修改可以是将 non-anticoagulated 全血直接收集到以前用细胞包覆的珠子填充的管子中, 以便通过吸管减少 air-contact 和血液活化。使用人主动脉内皮细胞 (HAEC) 可能是一个有趣的控制, 并已纳入未来的计划。氩顶管可能被用来减少接触的 non-anticoagulated 血液与空气, 这是已知的导致接触活化的凝血级联。如果血液被拉得太快, 例如, 用吸尘管和橡胶三通, 在细射流中将血液引入管内, 血小板就会活化, 凝结会更快。为避免血小板活化, 使用大直径皮下注射针头 (21ɢ 16ɢ)。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了瑞士国家科学基金会 (SNSF, 格兰特 No. 320030_156193) 的支持。作者感谢 Dr. Benoît Werlen 提供 Biosilon 载体珠。我们还感谢 Prof. 和 Prof. 安德烈 Haeberli 帮助建立载体珠模型。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit - FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2 mL in 500 mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
References
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