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Medicine

Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut

doi: 10.3791/56227 Published: September 5, 2017

Summary

Wir präsentieren ein in Vitro -Modell ermöglicht die Untersuchung und Analyse der Koagulation im ganzen, nicht-Anticoagulated Blut. Antikoagulation im System hängt die natürliche antikoagulierende Wirkung des gesunden Endothelzellen und endothelialer Zellaktivierung führt zu gerinnen.

Abstract

In Vivo, sind Endothelzellen ausschlaggebend für die natürliche Antikoagulation des zirkulierenden Blutes. Endothelialer Zellaktivierung führt zu Blutgerinnung. Dieses Phänomen ist in vielen klinischen Situationen, wie Organtransplantation im Beisein von vorgeformten Anti-Spender-Antikörper, einschließlich Xenotransplantation, sowie Ischämie/Reperfusion Verletzungen beobachtet. Um Tierversuche gemäß der 3R Normen (Minderung, Ersatz und Verfeinerung), in-vitro- Modelle um die Wirkung von Endothelzellen untersuchen reduzieren wäre Aktivierung auf Blutgerinnung sehr wünschenswert. Allerdings bieten gemeinsame Flachbett Systeme der Endothelzellen Kultur ein Oberflächen-Volumen-Verhältnis von 1-5 cm2 des Endothels pro mL Blut, die für natürliche, endothelial vermittelte Antikoagulation nicht ausreicht. Kultivierung von Endothelzellen auf Microcarrier Perlen kann das Oberflächen-Volumen-Verhältnis zu 40-160 cm2/mL erhöhen. Dieses erhöhte Verhältnis ist ausreichend, um die "natürliche" Antikoagulation von Vollblut, so dass die Verwendung von Antikoagulantien vermieden werden kann. Hier ist ein in-vitro- Microcarrier-basiertes System zur Untersuchung der Auswirkungen der gentechnischen Veränderung von porcinen Endothelzellen auf Koagulation des ganzen, nicht-Antikoagulanzien Menschenblut beschrieben. In der beschriebenen Assay, primäre porcinen Aorten Endothelzellen, entweder Wildtyp (WT) oder transgenen für menschliche CD46 und Thrombomodulin, wurden auf Microcarrier Perlen gezüchtet und dann frisch gezogenen nicht-Antikoagulanzien Menschenblut ausgesetzt. Dieses Modell ermöglicht die Messung und Quantifizierung der Cytokine Freigabe sowie Aktivierung Marker der Ergänzung und Koagulation im Blutplasma. Darüber hinaus wurden Bildgebung des aktivierten Endothelzellen und Ablagerung von Immunglobulinen, Ergänzung und Koagulation Proteine an den endothelialized Perlen konfokalen Mikroskopie durchgeführt. Dieser Test kann auch verwendet werden, um Medikamente zu testen, die um Aktivierung von Endothelzellen und somit, Gerinnung zu vermeiden sollen. Auf ihr Potenzial, die Zahl der Versuchstiere für solche Untersuchungen ist der beschriebenen Test einfach durchzuführen und konsequent reproduzierbar.

Introduction

Das vaskuläre Endothel besteht aus einer Monoschicht von Endothelzellen (EG), die das Lumen der Blutgefäße auskleiden. In einen physiologischen Zustand Ruhestrom EG sind verantwortlich für die Wartung von ein gerinnungshemmendes Mittel und entzündungshemmende Umgebung. 1 dies wird durch den Ausdruck der Antigerinnungsmittel und entzündungshemmende Proteine auf der Oberfläche der EG vermittelt. Z. B. EG Aktivierung verursacht durch Ischämie/Reperfusion Verletzungen oder vaskulären Ablehnung (Xeno-) transplantierten Organe bewirkt eine Änderung der endothelial Oberfläche aus einem Antigerinnungsmittel und Anti-inflammatory State pro- Koagulans und Pro-inflammatorische Zustand. 1

Um die faszinierende und komplexe Wechselwirkungen zwischen Endothel und Koagulation Faktoren, in-vitro- Modelle zu untersuchen, die als imitieren möglichst genau die in-Vivo -Situation sind höchst wünschenswert. Eine allgemeine Einschränkung, die konventionellen in-vitro- Koagulation Assays charakterisiert ist die Verwendung von Anticoagulated Blut, wodurch die Analyse der Koagulation-vermittelten Effekte beschwerliche und sogar Recalcification citrated Vollblut nicht reproduzieren Ergebnisse mit frischen nicht-Anticoagulated Blut erhältlich. 2 Außerdem ist im traditionellen Flachbett-Zellkultursysteme es unmöglich, die gerinnungshemmenden Eigenschaften des Endothels zu nutzen, da eine ausreichende Endothelzellen Oberfläche pro Blutvolumen nicht erreicht werden kann. Das hier vorgestellte Modell überwindet diese Einschränkungen durch Kultivierung EG auf der Oberfläche der kugelförmigen Microcarrier Perlen, so dass ein EG-Oberfläche-zu-Blut-Verhältnis von > 16 cm2/mL kann erreicht werden, das ist vergleichbar mit der Situation in kleinen Arteriolen oder Venen, und die beschrieben wurde, ausreichen, um "natürliche" Gerinnungshemmung des Blutes ermöglichen durch die EG-Oberfläche. 3 , 4 Vollblut kann ohne zusätzlichen Antikoagulantien in dieser Einstellung verwendet werden. Blutproben können gesammelt werden, während das Experiment und Zytokine, Gerinnungsfaktoren und lösliche Ergänzung Aktivierungsmarker erkannt und quantifiziert werden können. Darüber hinaus können EC-beschichtete Microcarrier Perlen für Ergänzung und Immunglobulin Deposition sowie der Ausdruck von EG Aktivierungsmarker konfokalen Mikroskopie analysiert werden. Eine weitere interessante Anwendung umfasst die Prüfung von Medikamenten die um endothelialer Zellaktivierung und damit die Gerinnung zu verhindern sollen. 5 obwohl dieses Modell komplett Tierversuche ersetzen kann, bietet es eine Methode, um bestimmte funktionale Hypothesen ex Vivo mit Zellen zu testen und so reduzieren Sie die Anzahl der Versuchstiere in der Grundlagenforschung auf Ischämie/reperfusion Verletzungen oder (Xeno) Transplantation.

Das beschriebene Modell wurde verwendet, um eine Xenotransplantation in welche Aorten porcinen Endothelzellen (PAEC) sind auf die Microcarrier Perlen gezüchtet und inkubiert mit ganzen, nicht-Antikoagulanzien Menschenblut zu imitieren. Verschiedenen transgenen PAEC, mit mehreren menschlichen Genen wie CD46 für die Regulierung des Komplementsystems bzw. Thrombomodulin (hTBM) für die Regulierung des Systems der Koagulation, wurden wegen ihrer gerinnungshemmenden Eigenschaften analysiert. Endothelzellen Aktivierung, Ergänzung und Koagulation Systeme sind streng kontrolliert und miteinander verbunden. 6 es ist daher wichtig zu verstehen, wie die verschiedenen transgenen Zellen nach Exposition mit menschlichem Blut in Bezug auf Adhäsion Molekül Ausdruck und Cytokine Freigabe, Verhalten der Glycocalyx und Verlust von gerinnungshemmenden Proteine zu vergießen. 7

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Protocol

deutsche Landrasse Schweine (Wildtyp gezüchtet in einem lokalen Bauernhof und transgenen gezüchtet am Institut für molekulare Tierzucht und Biotechnologie, Ludwig-Maximilians-Universität München), mit einem Gewicht von 30 kg bis 40 kg, dienten Diese Studie. Alle Tiere wurden unter Standardbedingungen mit Wasser und Nahrung ad libitum untergebracht. Alle Tierversuche wurden nach Großbritannien Animals Act (wissenschaftliche Verfahren) und der NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren sowie das Schweizer Tierschutzgesetz durchgeführt. Alle Tierversuche sind die ARRIVE-Richtlinien einzuhalten. Die Tierversuche des kantonalen Veterinärdienstes (Kanton Bern, Schweiz) gebilligten alle tierischer Verfahren, Erlaubnis nicht. BE70/14. Experimentelle Protokolle wurden nach der 3R verfeinert und State-of-the-Art-Anästhesie und Schmerztherapie wurden verwendet, um die Anzahl der Tiere zu minimieren und reduzieren die Exposition der Tiere, Stress und Schmerzen während der Experimente.

Blut von gesunden Personen durch geschlossenes System Venenpunktion nach Schweizer Gerichtsbarkeit und Ethik-Richtlinien des Universitätsspitals Bern gezogen wurde. Der Begriff " nicht Anticoagulated Blut " bedeutet, dass das Blut nicht mit jedem Antikoagulans behandelt worden ist.

die folgenden Schritte sind unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Vertrautheit mit Grundzelle Kultur steriler Technik erforderlich ist.

1. Isolation von PAEC

Hinweis: thorakalen Aorta Segmente von 6 bis 10 cm wurden von euthanasierten deutsche Landrasse-Schweine von 3 bis 6 Monate (für andere in Vivo Experimente verwendet) und sofort erhalten übertragen in einen 500-mL-Glasflasche mit Transportmedium (DMEM + 1 % Penicillin/Streptomycin).

  1. Pre-Mantel eine 6-Well-Platte mit Fibronektin 12,5 µg/mL mit PBS-Puffer 1 X und legen Sie es in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h
  2. Vorwärmen sterile PBS 1 X und Zelle Kultur Medium (DMEM).
  3. Nehmen Sie die Schweine Aorta vom Transportmedium.
  4. Die Aorta auf eine Styropor Platte zu platzieren.
  5. Mit warmen PBS vorsichtig vorher spülen.
  6. Die Aorta Längsrichtung geschnitten und mit Nadeln fixieren.
  7. Warme Zellkulturmedium auf der Oberfläche der inneren Behälter hinzufügen.
  8. Aspirieren Fibronektin Zellkulturmedium und fügen Sie frische Zellkulturmedium (DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,4 % der Endothelial Zelle Wachstum Medium Supplement Mix ergänzt).
  9. Tauchen Sie ein Wattestäbchen in das Zellkulturmedium. Wattestäbchen auf die ganz oben auf der innere Behälter Oberfläche sanft und langsam in die gleiche Richtung Tupfer.
  10. Der Zellen in einem Brunnen der 6-Well-Platte Runde für Runde reiben.
  11. Machen Sie dasselbe für den Rest der Brunnen.
  12. Zellen unter dem Mikroskop zu überprüfen und die 6-Well-Platte in Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO 2.
  13. Das Medium am zweiten Tag verändern und ändern Sie es noch einmal alle 2-3 Tage.
  14. Zellen werden sollen konfluierende, trypsinize Zellen und säen sie in einem T75 Kolben (PAEC P1).

2. PAEC Charakterisierung

  1. Pre-Mantel ein 8-Well-Chamberslide mit Fibronektin 12,5 µg/mL mit PBS-Puffer 1 X und legen Sie es in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h
  2. 5 x 10 4 Zellen/Well Saatgut und inkubieren Sie über Nacht im Brutschrank bei 37 ° c
  3. Waschen die Zellen zweimal mit PBS ++ (PBS mit CaCl 2 und MgCl 2 ergänzt), 300 μl/Well.
  4. Zellen mit 3,7 % Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur, 200 μl/Well befestigen.
  5. Waschen Zellen 3 Mal mit PBS ++, 300 μl/Well.
  6. 300 μl PBS 1 X-3_% BSA (blockierende Puffer) hinzufügen und 30 min bei Raumtemperatur zu verlassen.
  7. Primäre Antikörper (Anti-VE-Cadherin, Anti-CD31, Anti-vWF) in PBS 1x-1%BSA-0.05% Waschmittel, 160 μl/Well verdünnt auftragen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  8. 3 Mal zu waschen mit PBS ++ (200 μl/Well).
  9. Sekundärantikörper und DAPI in PBS 1x-1%BSA-0.05% Waschmittel, 160 μl/Well, verdünnt auftragen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. 3 Mal zu waschen mit PBS ++ (200 μl/Well).
  11. Folien mit Glycerin basiert Eindeckmittel montieren und Endothelzellen Marker Ausdruck unter dem Fluoreszenzmikroskop zu überprüfen.
    Hinweis: Kultur porcinen Aorten Endothelzellen in einem T175 Kolben (DMEM niedrige Glukose Medium + 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,4 % der Endothelial Zelle Wachstum Medium Supplement Mix) bis zum Zusammenfluss von 90 % erreicht ist. (Aussaat Dichte 1 x 10 6 Zellen, 90 % Zusammenfluss entsprechen etwa 5 x 10 6 Zellen).

3. Beschichtung von Microcarrier Perlen

  1. 7 mL Microcarrier Perlen mit 42 mL Kollagen-Lösung in einem 50-mL-Tube (100 μg/mL, in eine 0,2 % ige Essigsäure Lösung verdünnt) vermischen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  2. Waschen zweimal mit 25 mL PBS pH 7.4 Perlen (25 mL PBS zugeben, mischen Sie gut mit dem Pipettieren und warten, bis die Perlen unten dann verwerfen die überstand und wiederholen Sie vereinbart sind) und einmal mit 25 mL DMEM Medium.
  3. Decken die Perlen in der 50-mL-Tube mit 10mL Medium 199 ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % L-Glutamin, 0,4 % der Endothelial Zelle Wachstum Medium Supplement Mix und 25 μL des Heparins (5000 IU/mL) und erlauben Gleichgewichtherstellung für 10 min. vor weiterem Gebrauch.

4. Sammeln von Zellen

  1. das Zellkulturmedium aus der T175 Küvette mit PAEC entfernen und Hinzufügen von 5 mL PBS pH 7.4.
  2. Entfernen PBS aus der Flasche T175.
  3. 5 mL Trypsin-0.05% EDTA und inkubieren 3-4 min bei 37 ° c
  4. Der Zellen durch Spülen der Flasche mit 15 mL Zellkulturmedium sammeln und übertragen die Suspension in einem 50-mL-Tube.
  5. Zentrifugieren Zellen bei 1.200 x g für 8 min bei Raumtemperatur, entfernen überschüssige Mittel und das Pellet in 5 mL Zellkulturmedium Aufschwemmen.

5. Aussaat von Zellen in den Rührer Kolben

  1. die Zellsuspension 20 mL Zellkulturmedium hinzu und Aufschwemmen.
  2. Fügen Sie 20 mL Zellkulturmedium (w/o-Zellen) in der Magnetrührer 500-mL-Flasche.
  3. Die Zellen die gewaschenen Microcarrier Perlen aus Schritt 3.3 hinzufügen und mit einer serologischen 25-mL-Pipette vorsichtig vermengen.
  4. Übertragen die Perlen/Zelle-Mischung in den magnetischen Spinner Kolben.
  5. Spülen die 50-mL-Tube mit 10 mL Zellkulturmedium, die verbleibenden Zellen sammeln.
  6. Fügen Sie eine zusätzliche 85 mL Zellkulturmedium in den Spinner Kolben und legen Sie sie in den Brutkasten über Nacht bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker (100 X g, mischen Intervall: 3 min alle 45 min).
  7. Fügen Sie 50 mL Zellkulturmedium (Gesamtvolumen 200 mL) und weiter rühren für weitere 24 h bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker (100 X g, mischen Intervall: 3 min alle 45 min).
  8. Add farblos RPMI Medium (ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % L-Glutamin, 0,4 % der Endothelial Zelle Wachstum Medium Supplement Mix und 25 μl Heparin) bis 320 mL Gesamtvolumen erreicht ist.
  9. Ersetzen dem Medium alle 48 h: entfernen 100 mL des alten Mediums und 100 mL frische ergänzt farblos RPMI.
  10. Kultur der Zellen für 5 bis 7 Tagen. Die Zeit hängt vom Zusammenfluss Zustand der Zelle-beschichtete Perlen.
< p Class = "JoVe_title "> 6. Überprüfung der Zusammenfluss

  1. 200 μL der Zelle-beschichtete Perlen mit einer Pipette zu sammeln und übertragen Sie sie in ein Polypropylen Röhrchen.
  2. Waschen die Perlen 3 Mal mit 600 μl PBS 1 X (hinzufügen, PBS, kippen die Rohr- und Mischung sanft zur Loslösung der Zellen zu vermeiden, warten die Perlen um niederlassen, die PBS zu verwerfen und wiederholen).
  3. Die Perlen für 10 min durch Zugabe von 200 μl der Parapicric Säure zu beheben.
  4. Wash 3 Mal mit 600 μl PBS 1 x.
  5. Fügen Sie DAPI verdünnt mit PBS-Puffer 1 X und inkubieren Sie für 10 min.
  6. Die Perlen auf einen Objektträger übertragen und anwenden ein Deckglas mit Glycerin basiert Eindeckmittel.
  7. Visualisieren die Perlen unter einem confocal Mikroskop.

7. Experimentelle Verfahren

  1. die Zelle-beschichtete Perlen aus der Magnetrührer Flasche (Verfahren müssen nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden) mit einer serologischen 10-mL-Pipette entfernen und in 12 mL Rundboden Polypropylenröhrchen überführen.
  2. Lassen Sie die Perlen (ca. 1-2 min) niederzulassen und entfernen überschüssige Mittel.
  3. Die Rohre mehr Perlen hinzufügen, bis jedes Rohr genau 2 mL Perlen enthält.
  4. Jedes Röhrchen 5 mL klar RPMI hinzu und mischen Sie sorgfältig mit einer serologischen 10-mL-Pipette.
  5. Lassen Sie die Perlen niederzulassen und entfernen überschüssige Mittel.
  6. Waschen wiederholen noch einmal mit RPMI und entfernen alle überschüssige Mittel.

8. Inkubation mit Non-Anticoagulated Blut

  1. vorsichtig und langsam (mit Jet weder Vacutainer) Blut von gesunden Freiwilligen und sammeln es in 9 mL neutral Polypropylenröhrchen (ohne Antikoagulans).
  2. Transfer langsam 8 mL Blut mit einer serologischen 10-mL-Pipette in jede der Polypropylen Röhrchen mit 2 mL der Zelle-beschichtete Perlen (das Gesamtvolumen werden 10 mL). Vermeiden Sie grobe Behandlung von Blut oder Perlen, vorzeitige EG-Aktivierung zu vermeiden. Der Eingriff dauert ca. 1-2 min.
  3. Sorgfältig kippen die Blut/Perle Mischung sorgen gleich mischen und versiegeln die Kappe mit Paraffin Film.
  4. Legen die Rohre auf eine horizontale Kipptisch (mit sanften kippbaren Einstellungen nur) in einem Inkubator 37 ° C und Rekord Gerinnung Zeiten.
    1. In festgelegten Zeitabständen, z. B. nach 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, entfernen mindestens 1,5 bis 2 mL Blut-Korn-Mischung für Serum oder Plasma Analyse.
      Hinweis: für 6 Zeitpunkten empfehlen wir mit mehr als 3 Wiederholungen innerhalb einer Gruppe von Zellen, wie die Blutentnahme in verschiedenen Röhren erfolgt.
    2. Für die Sammlung von Serum, lassen das Blut zu gerinnen. Um das Plasma zu sammeln, EDTA oder Citrat 2 mL Röhrchen vor dem Hinzufügen hinzufügen von Blutproben.
    3. Speichern die Rohre auf dem Eis, 2.500 x g für 10 min bei 4 ° C Zentrifugieren und Serum/Plasma bei 80 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
      Hinweis: Auf Materialien sind Angaben in der Tabelle der Materialien

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Representative Results

Nach 7-10 Tagen Kultur in die Spinner-Kolben (Abb. 1) wurden die Zellen konfluierende, decken die ganze Oberfläche der Microcarrier Perlen (Abbildung 2). Überprüfung des confluency Staates ist ein wichtiger Schritt, denn eine nicht-Zusammenfluss Monoschicht der EG auf die Microbeads führt zu einem deutlichen Rückgang der Gerinnungszeit, angesichts der Microcarrier Perlen Oberfläche ist stark Pro-Gerinnungsmittel (Gerinnungszeit: 4 ± 1 min) ( Abbildung 3).

Ein weiterer wichtiger Punkt der Aufmerksamkeit ist die Geschwindigkeit der kippbaren Platte. Eine kippbare Highspeed erhöhen Blutgerinnung. Eine Verlängerung der Gerinnungszeit konnte beobachtet werden, wenn eine Monolage EG wurde auf der Oberfläche der Microcarrier Perlen präsentieren. Die Verwendung von GalTKO/hCD46/hTBM transgenen PAEC zeigte einen signifikanten Anstieg in der Gerinnungszeit im Vergleich zu WT PAEC (Abbildung 3). Das Fehlen von der Gal-α-1,3-Gal-Xenoantigen auf die PAEC (GalTKO) zeigten eine Zunahme Gerinnungszeit (25 ± 8 min für PAEC WT) und 68 ± 30 min für PAEC GalTKO. Eine weitere starke Zunahme der Gerinnungszeit beobachtet als PAEC GalTKO/hCD46/hTBM auf Microcarrier Perlen vorhanden waren (205 ± 32 min), was darauf hindeutet, eine erfolgreiche Modulation der Ergänzung (hCD46) und Koagulation Systeme (hTBM). Am Ende des Experiments wird definiert, wenn eine sichtbare Gerinnsel gebildet wird. Die Variabilität innerhalb der Proben von der gleichen Gruppe ist sowohl auf inter-Assay-Variabilität und der Blutspender. Jedes Experiment hatte 3 Wiederholungen und jedes Mal ein anderes Blutspender wurde verwendet, um die Zuverlässigkeit der Daten zu erhöhen. Für jeden Spender wurde eine Blutanalyse (Thrombozytenzahl, WBC, RBC, HCT und andere Parameter) von externen medizinischen Labors durchgeführt. In Abbildung 3 dargestellten Ergebnisse sind von verschiedenen Experimenten mit verschiedenen Blutspendern.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Microcarrier basierende Assays. (A) EG werden in T175 Fläschchen erweitert und (B) in Spinner Flaschen zusammen mit Kollagen beschichtet Microcarrier Perlen überführt. (C) frische nicht-Anticoagulated Blut wird von einen gesunden Freiwilligen, (D) mit EG-beschichtete Microcarrier Perlen gemischt, und bei 37 ° c inkubiert gesammelt. Der Begriff "nicht-Anticoagulated Blut" bedeutet, dass das Blut nicht mit jedem Antikoagulans behandelt wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Immunfluoreszenz-Färbung auf EG-beschichtete Microcarrier Perlen. Microcarrier Perlen wurden abgerufen und gebeizt für CD31 (PECAM-1) um die Konfluenz zu beurteilen. Die Kerne wurden in blau (DAPI) gefärbt und CD31 war voller Flecken in rot (Cy3). Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Gerinnung mal verschiedene EG Gerinnungszeiten wurden optisch ermittelt und am Ende des Experiments wurde definiert, wenn eine sichtbare Gerinnsel beobachtet wurde. Eine starke Prokoagulans Wirkung wurde beobachtet, wenn ganze nicht-Antikoagulanzien Menschenblut nicht EG-beschichteten Microcarrier Perlen ausgesetzt waren. Das Fehlen von der Gal-α-1,3-Gal-Xenoantigen auf die PAEC (GalTKO) zeigten eine Zunahme Gerinnungszeit (25 ± 8 min für PAEC WT) und 68 ± 30 min für PAEC GalTKO. Ein weiterer Anstieg der Gerinnungszeit beobachtet als PAEC GalTKO/hCD46/hTBM waren auf Microcarrier Perlen, was darauf hindeutet, eine erfolgreiche Modulation der Ergänzung (hCD46) und Koagulation Systeme (hTBM). Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Auswertung erfolgte mit ANOVA für multiple Vergleiche mit Bonferroni Korrektur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Das hier vorgestellte Modell eignet sich für Koagulation Studien erlaubt die Analyse der verschiedenen Aspekte der Koagulation und seine Wechselwirkung mit EG. 8 in der Xenotransplantation Forschung ist es ein nützliches System die gerinnungshemmenden Eigenschaften der verschiedenen gentechnisch veränderte Schweine ECs nach Inkubation mit Menschenblut 9zu testen.

Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind die komplette Netzabdeckung (Konfluenz) von der Microbeads vor Beginn des Experiments zu gewährleisten und die Bezug auf die sorgfältige Sammlung und Behandlung des nicht-Antikoagulanzien Vollblutes verfrüht zu vermeiden Thrombozyten Aktivierung aufgrund hoher Scherbeanspruchung, die auftreten können, wenn Vacutainer verwendet werden, um das Blut zu sammeln. 10 doch dieses System hat einige Beschränkungen, einschließlich des Fehlens von einem umlaufenden geschlossenen System und das Fehlen der physiologischen Schubspannung, die lieber repräsentieren die in-Vivo -Bedingungen.

Trotz dieser Einschränkungen der beschriebenen Modell bietet wesentliche Vorteile gegenüber derzeit bestehenden Modelle. Durch den Einsatz von Microcarrier Perlen ist die EG Oberfläche Blut-Volumen-Verhältnis erhöht, so dass die Einrichtung der Antigerinnungsmittel und entzündungshemmende und Verwendung von nicht-Antikoagulanzien Vollblut. In aktuellen Flachbett-Kultur Zellmodellen ist dies nicht möglich und Mechanismen, die Blutgerinnung aufgrund EG-Aktivierung beinhalten daher oft erfordern den Einsatz von Tierversuchen. Teilweise kann dies mit dem beschriebenen Microcarrier Wulst Modell vermieden werden.

Darüber hinaus ermöglicht dieses System ein breites Spektrum an Anwendungen. Seine Vielseitigkeit befindet sich in der Möglichkeit der Prüfung, verschiedene Medikamente oder Verbindungen, die nicht nur im Zusammenhang mit (Xeno-) Transplantation, sondern auch für die menschliche Krankheiten sind. Die Auswirkungen der Medikamente auf das Endothel und das Gerinnungssystem können leicht durch Immunfluoreszenz, ELISA und Multiplex-Federung-Array-Analysen beurteilt werden. Dies war zuvor in einer Studie über die Auswirkungen von transgenen Ausdruck der menschlichen Thrombomodulin inmitten der Xenotransplantation. 11

Eine mögliche Änderung des beschriebenen Verfahrens könnte die Sammlung von nicht-Antikoagulanzien Vollblut direkt in Röhren, die zuvor mit Zelle-beschichtete Perlen gefüllt sind, um Luft-Kontakt und Blut-Aktivierung zu reduzieren, indem Sie mit der Pipette. Die Verwendung von menschlichen Aortenklappe Endothelzellen (HAEC) möglicherweise eine interessante Steuerung und Pläne für die Zukunft bereits integriert ist. Argon-Richtfest der Rohre kann verwendet werden, um den Kontakt des nicht-Anticoagulated Blut mit Luft, zu verringern, die bekannt ist, führen zur Aktivierung der Gerinnung Kaskade zu kontaktieren. Wenn das Blut zu schnell gezogen wird, zum Beispiel mit aufgesaugten Röhren mit Kautschuk Hähne und Einführung von Blut in das Rohr in einem feinen Strahl, dann Thrombozyten aktiviert werden und Koagulation wird früher auftreten. Zur Vermeidung von Thrombozyten Aktivierung verwenden Sie große Durchmesser Injektionsnadeln (21ɢ - 16ɢ).

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Studie wurde unterstützt durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF, Grant No. 320030_156193). Die Autoren danken Dr. Benoît Werlen für die Bereitstellung der Biosilon Microcarrier Perlen. Wir danken auch Prof. Hans Peter Kohler und Prof. André Haeberli für Hilfe beim Einrichten der Microcarrier Wulst Modell.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAEC Isolated from pig aorta in our Lab
Microcarrier beads (Biosilon) Thermo Fisher Scientific 160-250
Collagen I, Bovine Gibco A10644-01
DMEM Gibco 21885-025
Medium 199 Sigma M7528
RPMI Gibco 32404-014
Neutral tubes Sarstedt 02.1726.001
Polypropylene tubes Simport T406-2A
Stirrer flasks Tecnomara
Biological stirrer Brouwer MCS-104S
Rat anti CD31 R&D Systems MAB33871 Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3 Jackson Immuno Research 112-166-003 Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherin Santa Cruz sc-6458 Dilution 1:100
Rabbit anti vWF DAKO A0082 Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488 Molecular Probes A11055 Dilution 1:500
Goat anti Rabbit - FITC Southern Biotech 4050-02 Dilution 1:500
DAPI Sigma 32670-25MG-F Dilution 1 µg/mL
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
FBS Gibco 10270-106 Concentration: 10% in cell culture medium
Adapter Sarstedt 14.1205
Confocal microscope Carl Zeiss LSM 710
Image analysis software Image J Available for free at: https://imagej.net
Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix PromoCell C-39216 2 mL in 500 mL of DMEM
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Concentration: 1% in cell culture medium
L-Glutamine Gibco 25030-024 Concentration: 1% in cell culture medium
Heparinun natricum Drossa Pharm AG Stock concentration: 5000 U.I./ mL
Chamberslides Bioswisstec AG 30108
CaCl2 x 2H2O Merck 2382.0500
MgCl2 x6 H2O Merck 1.5833.1000
Tween 20 Axon Lab AG 9005-64-5
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Glycergel mounting medium Dako C0563

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References

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Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut
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Cite this Article

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).More

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).

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