Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Vurdering av antikoagulerende og anti-inflammatorisk egenskaper av endotelceller 3D cellekultur og ikke-anticoagulated fullblod

doi: 10.3791/56227 Published: September 5, 2017

Summary

Vi presenterer en i vitro modell som tillater undersøkelse og analyse av koagulering i hele, ikke-anticoagulated blod. Anticoagulation i systemet avhenger naturlig anticoagulation effekt av sunn endotelceller og endothelial celle aktivering fører til blodpropp.

Abstract

I vivo, endotelceller er avgjørende for den naturlige anticoagulation av sirkulerende blod. Følgelig fører endothelial celle aktivering til blodpropp. Dette fenomenet er observert i mange kliniske situasjoner som organtransplantasjon i nærvær av pre-formet anti-giver antistoffer, inkludert xenotransplantation, samt iskemi/reperfusion skade. For å redusere dyr eksperimentering ifølge 3R standarder (reduksjon, utskifting og forbedring), i vitro modeller å studere effekten av endothelial celle ville aktivering på blod koagulasjon være svært ettertraktet. Felles flatbed systemer endothelial celle kultur gir imidlertid en overflate-til-volum forholdet mellom 1-5 cm2 endotelet per mL blod, som ikke er tilstrekkelig for naturlige, endothelial-mediert anticoagulation. Dyrking endotelceller på microcarrier perler kan øke overflate-til-volum forholdet mellom 40-160 cm2/mL. Dette økt forholdet er tilstrekkelig for å sikre den "naturlige" anticoagulation av fullblod, slik at bruk av antikoagulanter kan unngås. Her er en i vitro microcarrier-systemet beskrevet å studere virkningene av genetisk modifisering av svin endotelceller på koagulering av hele, ikke-anticoagulated menneskeblod. I beskrevet analysen, primære svin aorta endotelceller, enten wild type (WT) eller transgene for CD46 og thrombomodulin, ble dyrket på microcarrier perler og deretter utsatt for fersk trukket ikke-anticoagulated menneskeblod. Denne modellen gir måling og kvantifisering av cytokin utgivelsen samt aktivisering markører supplement og koagulering i blod plasmaet. I tillegg ble imaging aktivert endothelial celle og deponering av immunglobuliner komplement- og koagulering proteiner på endothelialized perler utført av AC confocal mikroskopi. Denne analysen kan også brukes til å teste medisiner som skal hindre endothelial celle aktivering, og dermed koagulering. På dens potensial for å redusere antall dyr som brukes til slike undersøkelser, er beskrevet analysen enkel å utføre og konsekvent reproduserbar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vaskulære endotelet består av en monolayer av endotelceller (EC) som linje lumen av blod fartøy. I en fysiologisk tilstand, quiescent EU er ansvarlig for vedlikehold av en antikoagulerende og anti-inflammatorisk miljø. 1 dette er formidlet av uttrykk for antikoagulerende og anti-inflammatoriske proteiner på EC overflaten. For eksempel EC aktivisering skyldes iskemi/reperfusion skade eller vaskulær avvisning av (xeno-) transplantert organene resulterer i en endring av endothelial overflaten fra en antikoagulerende og anti-inflammatorisk staten Pro koagulere og pro-inflammatoriske staten. 1

For å studere fascinerende og komplekse samspillet mellom de endotel, og koagulering faktorene, i vitro modeller som etterligner som nært i vivo situasjonen er svært ettertraktet. En vanlig begrensning som preger konvensjonelle i vitro koagulering analyser er bruken av anticoagulated blod som gjør analysen av koagulering-mediert effekter krevende og selv recalcification citrerte hele blod ikke kan gjengi resultater oppnåelig med friske ikke-anticoagulated blod. 2 dessuten i tradisjonelle flat-bed celle kultur systemer er det umulig å utnytte egenskapene antikoagulerende endotelet som en tilstrekkelig endothelial celle-overflate per blodvolum ikke kan nås. Modellen presentert her overvinner disse begrensningene av dyrking EC på overflaten av sfærisk microcarrier perler, slik at en EC overflate-til-blod forholdet > 16 cm2/mL kan nås, som ligner situasjonen i små arterioler eller årer, og som ble beskrevet for å være tilstrekkelig til at "naturlig" anticoagulation blod av EC overflaten. 3 , 4 fullblod kan brukes uten ekstra antikoagulanter i denne innstillingen. Blodprøver kan samles under eksperimentet og cytokiner, koagulering faktorer og løselig supplement aktivisering markører kan oppdages og kvantifisert. Videre kan EC-belagt microcarrier perler bli analysert for utfylle og immunglobulin avsettelse som uttrykk for EF aktivisering markører av AC confocal mikroskopi. Et annet interessant program inkluderer testing av narkotika som skal hindre endothelial celle aktivering, og dermed koagulering. 5 men denne modellen ikke kan helt erstatte dyr eksperimentering, det tilbyr en metode for å teste spesifikke funksjonelle hypoteser ex vivo bruke celler og dermed redusere antall dyr som brukes i grunnleggende forskning på iskemi/reperfusion skade eller (xeno) transplantasjon.

Beskrevet modellen ble brukt til å etterligne en xenotransplantation i som svin aorta endotelceller (PAEC) er dyrket på microcarrier perler og inkubert med hele, ikke-anticoagulated menneskeblod. Forskjellige transgene PAEC, bærer flere menneskelige gener som CD46 for regulering av komplement systemet eller thrombomodulin (hTBM) for regulering av koagulasjonssystemet, ble analysert for sine antikoagulerende egenskaper. Endothelial celle aktivering, supplement og koagulering systemer tett kontrollert og sammen. 6 det er derfor viktig å forstå hvordan ulike transgene cellene oppfører seg etter eksponering for menneskelig blod vedheft molekyl uttrykk og cytokin utgivelse, utgytelsen av glycocalyx og tap av antikoagulerende proteiner. 7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

tysk Landrace griser (vill-type avlet i en lokal gård og transgene avlet på instituttet for molekylær Animal avl og bioteknologi, Ludwig-Maximilian University, München, Tyskland), veier mellom 30 kg til 40 kg, ble brukt i Denne studien. Alle dyrene ble plassert under standard betingelser med vann og mat ad lib. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med den britiske dyr Act (vitenskapelig prosedyrer) og NIH guiden for omsorg og bruk av forsøksdyr, samt sveitsiske Dyrevern loven. Alle dyrestudier overholdt ANKOMME retningslinjene. Dyr eksperimentering komiteen cantonal veterinær tjenesten (Canton av Bern, Sveits) godkjent alle dyr prosedyrer, tillatelse ikke. BE70/14. Eksperimentell protokoller var raffinert etter 3R prinsippene og state-of-the-art anestesi og smertebehandling ble brukt for å minimere antallet av dyr og redusere eksponering for dyrene stress og smerte under forsøkene.

blod ble trukket fra friske individer av lukket system venipuncture Swiss jurisdiksjon og etiske retningslinjer på Universitetssykehuset Bern. Uttrykket " ikke-anticoagulated blod " betyr at blodet ikke har blitt behandlet med noen antikoagulerende.

følgende utføres under sterile forhold. Kjennskap til grunnleggende celle kultur steril teknikk kreves.

1. isolering av PAEC

Merk: Thoracic aorta segmenter 6 til 10 cm Hentet fra euthanized tysk Landrace griser av 3 til 6 måneders alder (brukes for andre i vivo eksperimenter) og umiddelbart overført til en 500-mL glassflaske med transportmedium (DMEM + 1% penicillin/streptomycin).

  1. Pre coat en 6-vel plate med fibronectin 12,5 µg/mL i PBS 1 x og plasserer den i en inkubator på 37 ° C for 1 h.
  2. Forvarm sterilt PBS 1 x og celle kultur medium (DMEM).
  3. Ta ut svin aorta fra transportmedium.
  4. Legg aorta på en polystyren tallerken.
  5. Flukt med varm PBS forsiktig forhånd.
  6. Kutte aorta langs og fikse det med nåler.
  7. Legge til varm celle kultur medium på indre fartøyet overflaten.
  8. Sug opp fibronectin-celle kultur medium og legge frisk celle kultur medium (DMEM med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 0,4% av Endothelial celle vekst Medium Supplement Mix).
  9. Suge en bomullspinne i celle kultur medium. Vattpinne vatt bud på toppen av indre fartøyet overflaten sakte og forsiktig i samme retning.
  10. Gni cellene i en brønn av 6-vel plate runde etter runde.
  11. Gjøre det samme for resten av brønnene.
  12. Sjekk celler under microscope og plassere 6-vel platen i inkubator på 37 ° C, 5% CO 2.
  13. Endre mediet på den andre dagen og endre det igjen hver 2-3 dager.
  14. Når cellene skal være confluent, trypsinize celler og frø dem i en MT75 kolbe (PAEC P1).

2. PAEC karakterisering

  1. pre coat en 8-og chamberslide med fibronectin 12,5 µg/mL i PBS 1 x og plasserer den i en inkubator på 37 ° C for 1 h.
  2. Frø 5 x 10 4 celler/godt og ruge over natten i kuvøse på 37 ° C.
  3. Vask cellene to ganger med PBS ++ (PBS med CaCl 2 og MgCl 2), 300 μL/vel.
  4. Fikse celler med 3,7% paraformaldehyde for 10 min i romtemperatur, 200 μL/vel.
  5. Vask celler 3 ganger med PBS ++, 300 μL/vel.
  6. Legger 300 μL PBS 1 x-3_% BSA (blokkerer buffer) og la 30 min ved romtemperatur.
  7. Bruke primære antistoffer (anti-VE-cadherin, anti-CD31, anti-vWF) fortynnet i PBS 1x-1%BSA-0.05% vaskemiddel, 160 μL/godt og ruge 1t ved romtemperatur.
  8. Vask 3 ganger med PBS ++ (200 μL/vel).
  9. Bruke sekundære antistoffer og DAPI fortynnet i PBS 1x-1%BSA-0.05% vaskemiddel, 160 μL/Vel, og ruge 1t ved romtemperatur.
  10. Vask 3 ganger med PBS ++ (200 μL/vel).
  11. Montere lysbilder med glyserol basert montering medium og kontrollere endothelial celle markører uttrykk under mikroskop fluorescens.
    Merk: Kultur svin aorta endotelceller i en T175 bolle (DMEM lav glukose medium + 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 0,4% av Endothelial celle vekst Medium Supplement Mix) til 90% samløpet er nådd. (seeding tetthet 1 x 10 6 celler, 90% samløpet tilsvarer omtrent 5 x 10 6 celler).

3. Belegg av Microcarrier perler

  1. Mix 7 mL av microcarrier perler med 42 mL kollagen i en 50-mL tube (100 μg/mL, fortynnet i en 0,2% eddiksyre løsning) og Inkuber 1t ved romtemperatur.
  2. Vask perler to ganger med 25 mL PBS pH 7.4 (legge til 25 mL PBS, bland godt med Pipetter og vente til perlene er avgjort ned så kast nedbryting og gjenta) og en gang med 25 mL av DMEM medium.
  3. Dekker perlene i 50-mL tube med 10mL av medium 199 med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1% L-glutamin, 0,4% Endothelial celle vekst Medium Supplement mix og 25 μL heparin (5000 IU/mL) og tillate balanse i 10 min før videre bruk.

4. Samle celler

  1. fjerne celle kultur medium fra T175 kolbe som inneholder PAEC og legge 5 mL av PBS pH 7.4.
  2. Fjerne PBS fra T175 kolbe.
  3. Legge til 5 mL av Trypsin-0.05% EDTA og ruge i 3-4 min på 37 ° C.
  4. Samle cellene ved å skylle flasken 15 mL celle kultur medium og overføre suspensjonen i en 50-mL tube.
  5. Sentrifuge cellene på 1200 x g i 8 min ved romtemperatur Fjern overflødig medium og resuspend pellet i 5 mL av celle kultur medium.

5. Såing celler i rørestang flasken

  1. legge til 20 mL celle kultur medium celle suspensjon og resuspend.
  2. Legge til 20 mL celle kultur medium (uten celler) i 500 mL magnetisk rørestang flasken.
  3. Legge til cellene i vasket microcarrier perler fra trinn 3.3 og bland forsiktig med en 25-mL serologisk pipette.
  4. Overføre perler/mobiltelefon blandingen til magnetisk spinner kolbe.
  5. Skyll den 50-mL tuben med 10 mL celle kultur medium å samle de gjenværende cellene.
  6. Legge til en ekstra 85 mL celle kultur medium i spinner flasken og plasser den i inkubator overnatting på 37 ° C i en shaker (100 x g, blande intervall: 3 min hver 45 min).
  7. Legge til 50 mL av celle kultur medium (totalt volum 200 mL) og fortsette omrøring for ekstra 24 h på 37 ° C i en shaker (100 x g, blande intervall: 3 min hver 45 min).
  8. Legg til fargeløs RPMI medium (med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1% L-glutamin, 0,4% Endothelial celle vekst Medium Supplement mix og 25 μL Heparin) til 320 mL av totalvolumet.
  9. Erstatte mediet hver 48 h: fjerne 100 mL av gammelt medium og legge til 100 mL frisk supplert fargeløs RPMI.
  10. Kultur cellene for 5 til 7 dager. Tiden er avhengig av samløpet delstaten celle-belagt perlene.
< p class = "jove_title "> 6. Samløpet bekreftelse

  1. samle 200 μL av celle-belagt perler med en pipette og overføre dem til en polypropylen tube.
  2. Vask perlene 3 ganger med 600 μL PBS 1 x (legge til PBS, tilt rør og bland forsiktig å unngå avdeling av cellene, vent perler for å slå seg ned, forkaste PBS og gjenta).
  3. Fikse perlene i 10 min ved å legge til 200 μL av parapicric syre.
  4. Vask 3 ganger med 600 μL PBS 1 x.
  5. Legge til DAPI fortynnet i PBS 1 x og Inkuber for 10 min.
  6. Overføre perler på et glass lysbilde og bruke en dekkglassvæske ved hjelp av glyserol basert montering medium.
  7. Visualisere perlene under AC confocal mikroskop.

7. Eksperimentelle prosedyren

  1. fjerne celle-belagt perlene fra magnetisk rørestang kolbe (prosedyrer ikke har gjøres under sterile forhold) med en 10-mL serologisk pipette og overføre dem til 12 mL runde bunn polypropylen rør.
  2. Perler conditions (rundt 1-2 min) og fjerne overflødig medium.
  3. Legge til flere perler til rør til hver tube inneholder nøyaktig 2 mL av perler.
  4. Legge til 5-mL klart RPMI hver rør og bland forsiktig med en 10-mL serologisk pipette.
  5. Perler slå seg ned og fjerne overflødig medium.
  6. Gjenta vask en gang med RPMI og fjerne alle overflødig medium.

8. Inkubasjon med ikke-anticoagulated blod

  1. sakte og forsiktig (med jet verken vacutainers) trekke blod fra en sunn frivillig og samle den i 9 mL nøytral polypropylen rør (ingen antikoagulerende).
  2. Overfører sakte 8 mL blod med en 10-mL serologisk pipette til hver av polypropylen rør som inneholder 2 mL av celle-belagt perler (det totale volumet blir 10 mL). Alltid unngå uforsiktig håndtering av blod eller perler å unngå tidlig EC aktivering. Prosedyren tar 1-2 min.
  3. Nøye vippe blod/perle blandingen for å sikre lik blanding og forsegle hetten med parafin film.
  4. Legger rør på en vannrett tilting tabell (med mild tilting innstillinger bare) inne en 37 ° C inkubator og posten clotting tid.
    1. På gitte tidsintervaller, f.eks etter 10, 20, 30, 50, 70, 90 min., fjerne minst 1,5-2 mL blod-perle blanding for serum- eller analyse.
      Merk: for 6 tidspunkt foreslår vi å ha mer enn 3 replikat i én gruppe med celler, blod prøvetaking vil gjøres i forskjellige rør.
    2. For innsamling av serum, la blodet å koagulere. For å samle plasma, legge til EDTA eller citrate 2 mL rør ør blodprøver.
    3. Lagre rørene på is, sentrifuge 2500 x g i 10 min på 4 ° C og lagre serum/plasma på 80 ° C før bruk.
      Merk: Detaljer på materialer er gitt i Tabellen for materiale

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etter 7-10 dager av kultur i spinner kolbe (figur 1) var cellene confluent, som dekker hele overflaten av microcarrier perler (figur 2). Bekreftelse av confluency er et viktig skritt fordi en ikke-confluent monolayer av EC på microbeads vil føre til en markant nedgang i clotting tid, gitt microcarrier perler overflate er sterkt Pro koagulere (clotting tid: 4 ± 1 min) ( Figur 3).

Et annet viktig punkt som trenger oppmerksomhet er hastigheten av tilting plate. En høyhastighets tilting vil forbedre blodpropp. En forlengelse av er koagulasjonstid kunne observeres om en monolayer av EC var tilstede på overflaten av microcarrier perler. Bruk av GalTKO/hCD46/hTBM transgene PAEC viste en betydelig økning i clotting tid sammenlignet med WT PAEC (Figur 3). Fravær av Gal-α-1,3-Gal-xenoantigen på PAEC (GalTKO) viste en økning i clotting tid (25 ± 8 min for PAEC WT) og 68 ± 30 min for PAEC GalTKO. En sterk økning i clotting tid ble observert når PAEC GalTKO/hCD46/hTBM var til stede på microcarrier perler (205 ± 32 min), noe som antyder en vellykket modulering av både supplement (hCD46) og koagulering systemer (hTBM). Slutten av eksperimentet defineres når en synlig blodpropp er dannet. Variasjon i prøver av den samme gruppen skyldes både til analysen-variasjon og blodgiver. Hvert eksperiment hadde 3 gjentak og hver gang en annen blodgiver ble brukt til å øke påliteligheten til dataene. For hver giver, ble en blod analyse (antall blodplater, WBC, RBC, HCT og andre parametere) utført av eksterne helsetjenester laboratorier. Resultatene som vises i Figur 3 er Hentet fra forskjellige eksperimenter med ulike blodgivere.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av Microcarrier-baserte analysen. (A) EF er utvidet i T175 flasker og (B) overført til spinner flasker med kollagen-belagt microcarrier perler. (C) friske ikke-anticoagulated blod samles fra sunn frivillig, (D) blandet med EF-belagt microcarrier perler, og inkubert på 37 ° C. Uttrykket "ikke-anticoagulated blod" betyr at blodet ikke har blitt behandlet med noen antikoagulerende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Immunofluorescence flekker på EC-belagt Microcarrier perler. Microcarrier perler ble hentet og farget for CD31 (PECAM-1) for å vurdere confluency. Kjerner var farget i blått (DAPI) og CD31 var farget i rødt (Cy3). Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Clotting ganger i ulike EC. Clotting tid var bestemt visuelt og slutten av eksperimentet ble definert når en synlig blodpropp ble observert. En sterk procoagulant effekt ble observert når ikke-EU-belagt microcarrier perler ble utsatt for hele ikke-anticoagulated menneskeblod. Fravær av Gal-α-1,3-Gal-xenoantigen på PAEC (GalTKO) viste en økning i clotting tid (25 ± 8 min for PAEC WT) og 68 ± 30 min for PAEC GalTKO. En ytterligere økning i clotting tid ble observert når PAEC GalTKO/hCD46/hTBM var til stede på microcarrier perler, noe som antyder en vellykket modulering av både supplement (hCD46) og koagulering systemer (hTBM). Dataene vises i gjennomsnittlig ± standardavvik. Statistisk analyse er gjort med ANOVA for flere sammenligninger med Bonferroni korreksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Modellen presentert her er egnet for koagulering relaterte studier slik at analyse av ulike aspekter av koagulering og dets interaksjon med EC. 8 i xenotransplantation forskning, det er en nyttig system å teste antikoagulerende egenskapene til ulike genmodifiserte svin ECs etter inkubasjon med menneskeblod 9.

De viktigste trinnene av protokollen er de sikre komplett celle dekning (confluency) av microbeads før du starter eksperimentet og de gjelder forsiktig innsamling og håndtering av ikke-anticoagulated hele blodet å unngå tidlig blodplater aktivisering på grunn av høy skjæring stress, som kan oppstå hvis vacutainers brukes til å samle blod. 10 likevel dette systemet har noen begrensninger, inkludert fravær av et resirkulerende lukket system og fravær av fysiologiske skjæring stress som ville bedre representere betingelsene i vivo .

Til tross for disse begrensningene beskrevet modellen tilbyr betydelige fordeler fremfor nå eksisterende modeller. På grunn av bruk av microcarrier perler økes EC overflaten blod volumkontrollen, slik at etableringen av anti-koagulere og anti-inflammatorisk miljø og bruk av ikke-anticoagulated fullblod. I dagens flat-bed celle kultur modeller, dette er ikke mulig og mekanismer som involverer blodpropp på grunn av EC aktivisering derfor krever ofte bruk av dyr eksperimentering. Dette kan delvis unngås ved hjelp av beskrevet microcarrier perle modellen.

Videre, dette systemet tillater et bredt spekter av programmer. Allsidigheten ligger i muligheten for å teste ulike legemidler eller forbindelser som ikke bare gjelder (xeno-) transplantasjon men også til menneskelige sykdommer. Effekten av legemidler på endothelium og koagulering systemet kan lett vurderes av immunofluorescence, ELISA og multiplex suspensjon array analysen. Tidligere ble dette gjort i en studie om effekten av transgene uttrykk for menneskelige thrombomodulin i en xenotransplantation. 11

En mulig endring av metoden beskrevet kunne innsamling av ikke-anticoagulated fullblod direkte inn i rør som er fylt tidligere med celle-belagt perler for å redusere luft-kontakt og blod aktivisering ved hjelp av pipette. Bruk av menneskelige aorta endotelceller (HAEC) kan være en interessant kontroll og er allerede innarbeidet i fremtidige planer. Argon topping av rørene kan brukes til å redusere kontakt av ikke-anticoagulated blod med luften, som kan føre til kontakt aktivering av clotting kaskade. Hvis blodet er trukket for fort, for eksempel ved å bruke støvsugd rør med gummi stopcocks og innføre blod inn i røret i en fin jet, deretter blodplater bli aktivert og koagulering vil forkortes. For å unngå Platederivert aktivisering, bruk stor diameter sprøyte nåler (21ɢ - 16ɢ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av det sveitsiske National Science Foundation (SNSF, Grant No. 320030_156193). Forfatterne takker Dr. Benoît Werlen for å gi Biosilon microcarrier perler. Vi takker også Prof Hans Peter Kohler og Prof André Haeberli for hjelp med å sette opp microcarrier perle modellen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAEC Isolated from pig aorta in our Lab
Microcarrier beads (Biosilon) Thermo Fisher Scientific 160-250
Collagen I, Bovine Gibco A10644-01
DMEM Gibco 21885-025
Medium 199 Sigma M7528
RPMI Gibco 32404-014
Neutral tubes Sarstedt 02.1726.001
Polypropylene tubes Simport T406-2A
Stirrer flasks Tecnomara
Biological stirrer Brouwer MCS-104S
Rat anti CD31 R&D Systems MAB33871 Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3 Jackson Immuno Research 112-166-003 Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherin Santa Cruz sc-6458 Dilution 1:100
Rabbit anti vWF DAKO A0082 Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488 Molecular Probes A11055 Dilution 1:500
Goat anti Rabbit - FITC Southern Biotech 4050-02 Dilution 1:500
DAPI Sigma 32670-25MG-F Dilution 1 µg/mL
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
FBS Gibco 10270-106 Concentration: 10% in cell culture medium
Adapter Sarstedt 14.1205
Confocal microscope Carl Zeiss LSM 710
Image analysis software Image J Available for free at: https://imagej.net
Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix PromoCell C-39216 2 mL in 500 mL of DMEM
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Concentration: 1% in cell culture medium
L-Glutamine Gibco 25030-024 Concentration: 1% in cell culture medium
Heparinun natricum Drossa Pharm AG Stock concentration: 5000 U.I./ mL
Chamberslides Bioswisstec AG 30108
CaCl2 x 2H2O Merck 2382.0500
MgCl2 x6 H2O Merck 1.5833.1000
Tween 20 Axon Lab AG 9005-64-5
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Glycergel mounting medium Dako C0563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
Vurdering av antikoagulerende og anti-inflammatorisk egenskaper av endotelceller 3D cellekultur og ikke-anticoagulated fullblod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).More

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter