Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Bedömning av Endothelial celler med hjälp av 3D cellkultur och icke-Antikoagulerat helblod blodförtunnande och antiinflammatoriska egenskaper

doi: 10.3791/56227 Published: September 5, 2017

Summary

Vi presenterar en in vitro- modell som tillåter studiet och analysen av koagulation i hela, icke-Antikoagulerat blod. Antikoagulation i systemet beror på naturliga antikoagulationseffekt av friska endotelceller och endotelceller aktivering kommer att resultera i koagulation.

Abstract

In vivo, endotelceller är avgörande för den naturliga antikoagulation cirkulerande blod. Endotelcell aktivering leder följaktligen till koagulation. Detta fenomen observeras i många kliniska situationer såsom organtransplantationer i närvaro av förformad anti givare antikroppar, inklusive xenotransplantation, liksom i ischemi/reperfusionsskada. För att minska djurförsök enligt 3R-standarder (minskning, ersättning och förfining), in vitro- modeller att studera effekten av endotelceller vore aktiveringen på koagulation önskvärt. Vanliga flatbädd system av endotelceller kultur ger dock förhållandet yta till volym 1-5 cm2 av endotel per mL blod, vilket inte räcker för naturliga, endotel-medierad antikoagulation. Odling av endothelial celler på microcarrier pärlor kan öka ytan till volym förhållandet till 40-160cm/2ml. Detta ökade förhållande är tillräcklig för att säkerställa den ”naturliga” antikoagulation helblod, så att användning av antikoagulantia kan undvikas. Här är ett in vitro- microcarrier-baserat system beskrivs att studera effekterna av genetisk modifiering av svin endotelceller på koagulering av hela, icke-Antikoagulerat blod. I den beskrivs assay, primära svin aorta endotelceller, antingen vildtyp (WT) eller transgena för mänskliga CD46 och thrombomodulin, var odlas på microcarrier pärlor och sedan utsätts för färska ritade icke-Antikoagulerat blod. Denna modell tillåter mätning och kvantifiering av cytokinfrisättning samt aktivering markörer av komplement och koagulation i blodplasman. Dessutom utfördes imaging av aktiverade endotelceller och deposition av immunglobuliner, komplement- och koagulering proteiner på endothelialized pärlor av konfokalmikroskopi. Denna analys kan också användas för att testa läkemedel som är tänkt för att förhindra endotelceller aktivering och därmed koagulation. Ovanpå dess potential att minska antalet djur som används för sådana utredningar, är beskrivna analysen enkel att utföra och konsekvent reproducerbara.

Introduction

Den vaskulära endotelet består av en enskiktslager av endotelceller (EG) som linje lumen av blodkärl. I en fysiologiska tillstånd, quiescent EG ansvarar för underhållet av en antikoagulans och antiinflammatoriska miljö. 1 detta medieras av uttrycket av antikoagulans och anti-inflammatoriska proteiner på EG yta. Exempelvis EG aktivering orsakas av ischemi/reperfusion skada eller vaskulär avstötning av (xeno-) transplanterade organ medför en förändring av endothelial ytan från en antikoagulans och anti-inflammatoriska tillstånd till en Pro koaguleringsmedlet och pro-inflammatoriska tillstånd. 1

För att studera fascinerande och komplexa samspelet mellan de endotel och koagulation faktorerna, in vitro- modeller som efterliknar som nära som möjligt i vivo situationen är mycket önskvärda. En vanlig begränsning som kännetecknar konventionella in vitro- koagulering analyser är användningen av Antikoagulerat blod vilket gör analysen av koagulation-medierade effekter mödosam och även recalcification citrerade helblod kan inte återge resultat kan erhållas med färska icke-Antikoagulerat blod. 2 dessutom i traditionella platt-säng cell kultur system är det omöjligt att utnyttja endotelet antikoagulerande egenskaper som en tillräcklig endotelceller yta per blodvolym inte kan nås. Den modell som presenteras här övervinner dessa begränsningar av odlingsskålar EG på ytan av sfäriska microcarrier pärlor, så att en EG yta-till-blod förhållandet > 16 cm2/ml kan nås, som är liknande till situationen i små arterioler eller vener, och som beskrevs vara tillräcklig för att ”naturliga” antikoagulation av blod av EG ytan. 3 , 4 helblod kan användas utan tillsatt antikoagulantia i denna miljö. Blodprov kan tas under experimentet och cytokiner, koagulationsfaktorer och lösliga komplement aktiveringen markörer kan identifieras och kvantifieras. Dessutom kan EG-belagd microcarrier pärlor analyseras för komplement och immunglobulin nedfall samt uttrycket av EG aktiveringen markörer med konfokalmikroskopi. Ett annat intressant program inkluderar testning av narkotika som är tänkta för att förhindra endotelceller aktivering och därmed koagulation. 5 även om denna modell inte kan helt ersätta djurförsök, det erbjuder en metod för att testa specifika funktionella hypoteser ex vivo som använder celler och därmed minska antalet djur som används i grundforskning om ischemi/reperfusion skada eller (xeno) transplantation.

Den beskrivna modellen användes för att efterlikna en xenotransplantation inställning i vilka svin aorta endotelceller (Endometrial) odlas på microcarrier pärlor och inkuberas med hela, icke-Antikoagulerat blod. Olika transgena PAEC, bär flera mänskliga gener såsom CD46 för reglering av Komplementsystemet och/eller thrombomodulin (hTBM) för reglering av koagulationssystemet, analyserades för deras antikoagulerande egenskaper. Endotelcell aktivering, komplement och koagulation system kontrolleras tätt och sammankopplade. 6 det är därför viktigt att förstå hur de olika transgena cellerna beter sig efter exponering för humant blod när det gäller vidhäftning molekyl uttryck och cytokinfrisättning, avgivande av glykokalyx och förlust av antikoagulerande proteiner. 7

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tysk lantras svin (vildtyp uppvuxna i en lokal bondgård och transgena uppfödda vid Institutet för molekylär djur avel och bioteknik, Ludwig-Maximilian-universitet, München, Tyskland), som väger mellan 30 kg till 40 kg, användes i denna studie. Alla djur har varit inhysta under standart villkorar med vatten och mat ad lib. Alla djurförsök har utförts enligt lagen om U.K. djur (vetenskapliga förfaranden) och guiden NIH för vård och användning av försöksdjur, samt den schweiziska djurskyddslag. Alla djurstudier följt riktlinjerna som anländer. Utskottet djurförsök kantonala veterinärmyndighetens (cantonen av Bern, Schweiz) godkände alla djur förfaranden, tillstånd inte. BE70/14. Experimentella protokoll raffinerades enligt 3R principer och state-of-the-art anestesi och smärtlindring användes för att minimera antalet djur och minska exponering av djuren för stress och smärta under experimenten.

blod drogs från friska individer av slutna system venpunktion enligt schweizisk jurisdiktion och etik riktlinjer av Universitetssjukhuset i Bern. Frasen " icke-Antikoagulerat blod " innebär att blodet inte har behandlats med någon antikoagulant.

följande steg utförs under sterila förhållanden. Förtrogenhet med grundläggande cell kultur steril teknik krävs.

1. isolering av Endometrial

Obs: torakala aorta segment av 6 till 10 cm erhölls från euthanized tysk lantras svin av 3 till 6 månaders ålder (används för andra in-vivo-experiment) och omedelbart överförs till en 500 mL glasflaska innehållande transportmedium (DMEM + 1% penicillin/streptomycin).

  1. Pre coat en 6-well platta med Fibronektin 12,5 µg/mL i PBS 1 x och placera den i en inkubator vid 37 ° C för 1 h.
  2. Pre värma steril fosfatbuffrad Koksaltlösning 1 x och cell kultur medium (DMEM).
  3. Ta ut svin aorta från transportmedium.
  4. Placera aorta på en polystyren plattan.
  5. Spola med varmt PBS försiktigt förhand.
  6. Skär aorta längdriktningen och fixa det med nålar.
  7. Lägg till varma cellodlingsmedium på inre fartyget ytan.
  8. Aspirera Fibronektin-cellodlingsmedium och lägga till färska cellodlingsmedium (DMEM kompletteras med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin och 0,4% av Endothelial cellen tillväxt Medium tillägg Mix).
  9. Blöt en bomullstuss i cellodlingsmedium. Svabba bomull knopp på toppen av inre fartyget ytan försiktigt och långsamt i samma riktning.
  10. Gnugga cellerna i ett väl 6-well platta runda av runda.
  11. Göra detsamma för resten av brunnarna.
  12. Kontrollera celler i Mikroskop och placera 6-väl plattan i inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2.
  13. Ändra mediet på andra dagen och ändra det igen varje 2-3 dagar.
  14. När celler ska vara konfluenta, trypsinize celler och utsäde dem i en T75 kolv (Endometrial P1).

2. PAEC karakterisering

  1. pre coat en 8-väl chamberslide med Fibronektin 12,5 µg/mL i PBS 1 x och placera den i en inkubator vid 37 ° C för 1 h.
  2. Utsäde 5 x 10 4 celler per brunn och inkubera över natten i inkubatorn vid 37 ° C.
  3. Tvätta cellerna två gånger med PBS ++ (PBS kompletteras med CaCl 2 och MgCl 2), 300 μL/brunn.
  4. Fixa celler med 3,7% PARAFORMALDEHYD under 10 minuter vid rumstemperatur, 200 μL/brunn.
  5. Tvätta cellerna 3 gånger med PBS ++, 300 μL/brunn.
  6. Lägg till 300 μL av PBS 1 x-3_% BSA (blockerande buffert) och lämna 30 min i rumstemperatur.
  7. Gäller primära antikroppar (anti-VE-cadherin, anti-CD31, anti-vWF) utspätt i PBS 1x-1%BSA-0.05% rengöringsmedel, 160 μL/brunn och inkubera i 1 h i rumstemperatur.
  8. Tvätta 3 gånger med PBS ++ (200 μl per brunn).
  9. Tillämpa sekundära antikroppar och DAPI utspätt i PBS 1x-1%BSA-0.05% rengöringsmedel, 160 μL/brunn, och inkubera i 1 h i rumstemperatur.
  10. Tvätta 3 gånger med PBS ++ (200 μl per brunn).
  11. Montera bilder med glycerol baserad monteringsmedium och verifierar endotelceller markörer uttryck i fluorescens Mikroskop.
    Obs: Kultur svin aorta endothelial celler i en T175 kolv (DMEM låg glukos medium + 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin och 0,4% av Endothelial cellen tillväxt Medium tillägg Mix) tills 90% sammanflödet nås. (sådd densitet 1 x 10 6 celler, 90% sammanflödet motsvarar ungefär 5 x 10 6 celler).

3. Beläggning av Microcarrier pärlor

  1. blanda 7 mL av microcarrier pärlor med 42 mL i en 50 mL tub (100 μg/mL, utspädd i en 0,2% ättiksyralösning) kollagen och inkubera i 1 h i rumstemperatur.
  2. Tvätta pärlor två gånger med 25 mL PBS pH 7,4 (tillsätt 25 mL PBS, blanda väl med Pipettera och vänta tills pärlorna är bosatte sig sedan Kassera supernatanten och upprepa) och en gång med 25 mL DMEM medium.
  3. Täcka pärlorna i 50 mL röret med 10mL medium 199 kompletteras med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1% L-glutamin, 0,4% av Endothelial cellen tillväxt Medium tillägg Mix och 25 μL av heparin (5000 IU/mL) och tillåta Jämviktstiden i 10 min före ytterligare användning.

4. Samla celler

  1. ta bort cellodlingsmedium från T175 kolven som innehåller Endometrial och tillsätt 5 mL PBS pH 7,4.
  2. Ta bort PBS från T175 kolven.
  3. Tillsätt 5 mL av Trypsin-0.05% EDTA och Inkubera under 3-4 minuter vid 37 ° C.
  4. Samla cellerna genom att skölja kolven med 15 mL cellodlingsmedium och överföra suspensionen i en 50 mL tub.
  5. Centrifugera celler på 1,200 x g i 8 min i rumstemperatur, ta bort överflödig medium och återsuspendera pelleten i 5 mL cellodlingsmedium.

5. Seedning celler i omrörare kolven

  1. Tillsätt 20 mL cellodlingsmedium till cellsuspensionen och resuspendera.
  2. Tillsätt 20 mL cellodlingsmedium (utan celler) i 500 mL magnetomrörare kolven.
  3. Lägga till cellerna i tvättad microcarrier pärlor från steg 3.3 och blanda försiktigt med 25 mL serologiska pipett.
  4. Och överför pärlor/cell blandningen till den magnetiska spinner.
  5. Skölj 50 mL röret med 10 mL cellodlingsmedium att samla in de återstående cellerna.
  6. Lägga till en ytterligare 85 mL cellodlingsmedium i spinner kolven och placera den i inkubatorn över natten vid 37 ° C i en shaker (100 x g, blanda intervall: 3 min varje 45 min).
  7. Tillsätt 50 mL cellodlingsmedium (total volym 200 mL) och fortsätt omrörningen i ytterligare 24 timmar vid 37 ° C i en shaker (100 x g, blanda intervall: 3 min varje 45 min).
  8. Lägg till färglös RPMI medium (kompletteras med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1% L-glutamin, 0,4% av Endothelial cellen tillväxt Medium tillägg Mix och 25 μL av Heparin) tills 320 mL total volym nås.
  9. Ersätta mediet varje 48 h: avlägsna 100 mL av gamla medium och tillsätt 100 mL färsk kompletterade färglös RPMI.
  10. Odla cellerna för 5 till 7 dagar. Tiden beror på tillståndet sammanflödet av cell-belagd pärlor.
< p class = ”jove_title ”> 6. Sammanflödet verifiering

  1. samla 200 μL av cell-belagd pärlor med pipett och överföra dem till en polypropylen rör.
  2. Tvätta pärlor 3 gånger med 600 μL av PBS 1 x (lägga till PBS, lutning röret och blanda försiktigt för att undvika avlossning av cellerna, vänta pärlorna för att bosätta sig, kasta PBS och upprepa).
  3. Fixa pärlorna i 10 minuter genom att tillsätta 200 μl av parapicric syra.
  4. Tvätta 3 gånger med 600 μL av PBS 1 x.
  5. Lägg till DAPI utspätt i PBS 1 x och inkubera i 10 min.
  6. Överföra pärlorna på en glasskiva och Lägg på ett täckglas som använder glycerol baserat monteringsmedium.
  7. Visualisera pärlorna i confocal Mikroskop.

7. Experimentell förfarande

  1. ta bort cell-belagd pärlorna från magnetisk omrörare kolven (förfaranden inte behöver utföras under sterila förhållanden) med pipett 10 mL serologiska och överföra dem till 12 mL runda-botten polypropylene rören.
  2. Låt pärlorna bosätta sig (cirka 1-2 min) och ta bort överflödig medium.
  3. Lägga till fler pärlor i rören tills varje tub innehåller exakt 2 mL ställd pärlor.
  4. Tillsätt 5 mL tydlig RPMI i varje rör och blanda noga med serologiska pipett 10 mL.
  5. Låt pärlorna bosätta sig och ta bort överflödig medium.
  6. Upprepa förfarandet tvätt en gång med RPMI och ta bort allt överflödigt medium.

8. Inkubation med icke-Antikoagulerat blod

  1. försiktigt och långsamt (med varken jet eller vacutainers) dra blod från friska volontär och samla det i 9 mL neutral polypropylene rören (ingen antikoagulans).
  2. Överför långsamt 8 mL blod med en 10 mL serologiska pipett till var och en av polypropylen rör innehållande 2 mL av cell-belagd pärlor (den totala volymen blir 10 mL). Alltid undvika ovarsam hantering av blod eller pärlor för att undvika tidig EG aktivering. Proceduren tar 1-2 min.
  3. Försiktigt luta blod/pärla blandningen för att säkerställa lika blandning och försegla locket med paraffin film.
  4. Placera rören på ett horisontellt vippande bord (med endast mild vippande inställningar) inuti en 37 ° C inkubator och posten koagulering gånger.
    1. Vid inställda tidsintervall, t.ex. efter 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, ta bort minst 1,5-2 mL blod-pärla blandning för serum eller plasma analys.
      Obs: 6 tidpunkter föreslår vi att ha fler än 3 replikat inom en grupp av celler, som blod provtagning kommer att ske i olika rör.
    2. För insamling av serum, lämna blodet att koagulera. Samla in plasma, lägga till EDTA eller citrat i 2 mL rör innan du lägger till blodprov.
    3. Lagra rören på is, Centrifugera vid 2500 x g i 10 minuter vid 4 ° C och förvara serum/plasma vid 80 ° C fram till användning.
      Obs: Detaljerad material återfinns i Tabell för material

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter 7-10 dagar av kultur i spinner kolven (figur 1) var cellerna konfluenta, som täcker hela ytan av microcarrier pärlor (figur 2). Verifiering av confluency staten är ett viktigt steg eftersom en icke-konfluenta enskiktslager av EG på mikrokulor kommer att leda till en markant minskning av koagulationstiden, med tanke på microcarrier pärlor yta är starkt Pro koaguleringsmedlet (koagulering tid: 4 ± 1 min) ( Figur 3).

En annan viktig punkt som behöver uppmärksamhet är hastigheten av luta plattan. En hög vippande hastighet kommer att öka blodets koagulering. En förlängning av koagulationstiden kunde observeras om en enskiktslager av EG var närvarande på ytan av microcarrier pärlor. Användning av GalTKO/hCD46/hTBM transgena PAEC uppvisade en betydande ökning i den koagulationstid jämfört med WT PAEC (figur 3). Avsaknad av den Gal-α-1,3-Gal xenoantigen på PAEC (GalTKO) visade en ökning i koagulering tid (25 ± 8 min för Endometrial WT) och 68 ± 30 min för Endometrial GalTKO. En annan stark ökning i koagulering tid observerades när PAEC GalTKO/hCD46/hTBM var närvarande på microcarrier pärlor (205 ± 32 min), vilket tyder på en lyckad modulering av både komplement (hCD46) och koagulation system (hTBM). I slutet av experimentet definieras när en synlig propp bildas. Variationen inom prover av samma grupp beror både till inter assay-variabilitet och blodgivare. Varje experiment hade 3 replikat och varje gång en annan blodgivare användes för att öka tillförlitligheten i uppgifterna. För varje givare utfördes en blodanalys (trombocytantal, WBC, RBC, HCT och andra parametrar) av externa hälso-och laboratorier. Resultaten visas i figur 3 erhålls från olika experiment som utförs med olika blodgivare.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av Microcarrier-baserade analysens. (A) EG utvidgas i T175 kolvar och (B) överförs till spinner kolvar tillsammans med kollagen-belagd microcarrier pärlor. (C) färska icke-Antikoagulerat blod samlas från friska volontär, (D) blandas med EG-belagd microcarrier pärlor, och inkuberas vid 37 ° C. Frasen ”icke-Antikoagulerat blod” innebär att blodet inte har behandlats med någon antikoagulant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: immunofluorescens färgning på EG-belagd Microcarrier pärlor. Microcarrier pärlor var Hämtad och färgas för CD31 (PECAM-1) för att bedöma konfluens. Atomkärnor var målat i blått (DAPI) och CD31 var färgade i rött (Cy3). Skalstapeln: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: koagulering gånger i olika EG. Proceduroch bestämdes visuellt och slutet av experimentet definierades när en synlig propp observerades. En stark prokoagulanta effekt observerades när icke-EG-coated microcarrier pärlor utsattes för hela icke-Antikoagulerat blod. Avsaknad av den Gal-α-1,3-Gal xenoantigen på PAEC (GalTKO) visade en ökning i koagulering tid (25 ± 8 min för Endometrial WT) och 68 ± 30 min för Endometrial GalTKO. En ytterligare ökning av koagulering tid observerades när PAEC GalTKO/hCD46/hTBM var närvarande på microcarrier pärlor, vilket tyder på en lyckad modulering av både komplement (hCD46) och koagulation system (hTBM). Data visas som medelvärde ± standardavvikelse. Statistisk analys har gjorts med ANOVA för multipla jämförelser med Bonferroni korrigering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den modell som presenteras här är lämplig för koagulering relaterade studier möjliggör analys av olika aspekter av koagulation och dess interaktion med EG. 8 i xenotransplantation forskning, det är ett användbart system att testa olika genetiskt modifierade svin ECs antikoagulerande egenskaper efter inkubation med humanblod 9.

De viktigaste stegen i protokollet finns de att säkerställa komplett cell täckning (konfluens) av mikrokulor innan experimentet och de som rör noggrann insamling och hantering av den icke-Antikoagulerat helblod att undvika för tidig trombocytaktivering på grund av hög skjuvning stress, som kan uppstå om vacutainers används för att samla in blod. 10 dock detta system har vissa begränsningar, inklusive avsaknaden av en recirkulerande slutna system och avsaknad av fysiologiska skjuvspänning som skulle bättre representerar villkoren i vivo .

Trots dessa begränsningar, de beskrivna modellen erbjuder betydande fördelarna över för närvarande befintliga modeller. På grund av användningen av microcarrier pärlor ökas blod volymförhållandet EG ytan, möjliggör inrättandet av antikoagulantia och anti-inflammatoriska miljön och användningen av icke-Antikoagulerat helblod. I nuvarande platt-säng kultur cellmodeller, är detta inte möjligt och mekanismer som inbegriper blodpropp på grund av EG aktivering därför kräver ofta användning av djurförsök. Detta kan delvis undvikas med hjälp av beskrivs microcarrier pärla modellen.

Dessutom möjliggör detta system ett brett spektrum av applikationer. Dess mångsidighet är bosatt i möjlighet att testa olika droger eller föreningar som är inte bara relaterade till (xeno-) transplantation men också till mänskliga sjukdomar. Effekterna av drogerna på endotel och koagulationssystemet kan enkelt bedömas genom immunofluorescens, ELISA och multiplex suspension-array analys. Detta gjordes tidigare i en studie om effekten av transgena uttryck för mänskliga thrombomodulin i en xenotransplantation inställning. 11

En möjlig ändring av den beskrivna metoden kunde vara insamling av icke-Antikoagulerat helblod direkt in rören som tidigare fyllts med cell-belagd pärlor för att minska luft-kontakt och blod aktivering med hjälp av pipetten. Användningen av mänskliga aorta endotelceller (HAEC) kan vara en intressant kontroll och är redan inbyggd i framtida planer. Argon toppning av rören kan användas för att minska kontakten mellan icke-Antikoagulerat blod med luft, vilket är känt för att leda till kontakta aktivering av koagulering kaskad. Om blodet dras för snabbt, till exempel genom att använda dammsugas rören med gummi Avstängningskranar och införa blod i röret i en fin stråle, sedan trombocyter aktiveras och koagulering sker förr. Undvik trombocytaktivering, använda stor diameter injektionssprutor (21ɢ - 16ɢ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av schweiziska National Science Foundation (SNSF, Grant No. 320030_156193). Författarna vill tacka Dr Benoît Werlen för att ge Biosilon microcarrier pärlor. Vi tackar också Prof. Hans Peter Kohler och Prof. André Haeberli för hjälp med att sätta upp microcarrier pärla modellen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAEC Isolated from pig aorta in our Lab
Microcarrier beads (Biosilon) Thermo Fisher Scientific 160-250
Collagen I, Bovine Gibco A10644-01
DMEM Gibco 21885-025
Medium 199 Sigma M7528
RPMI Gibco 32404-014
Neutral tubes Sarstedt 02.1726.001
Polypropylene tubes Simport T406-2A
Stirrer flasks Tecnomara
Biological stirrer Brouwer MCS-104S
Rat anti CD31 R&D Systems MAB33871 Dilution 1:100
Goat anti-rat IgG-Cy3 Jackson Immuno Research 112-166-003 Dilution 1:500
Goat anti VE-cadherin Santa Cruz sc-6458 Dilution 1:100
Rabbit anti vWF DAKO A0082 Dilution 1:100
Dk anti Gt IgG – Alexa 488 Molecular Probes A11055 Dilution 1:500
Goat anti Rabbit - FITC Southern Biotech 4050-02 Dilution 1:500
DAPI Sigma 32670-25MG-F Dilution 1 µg/mL
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
FBS Gibco 10270-106 Concentration: 10% in cell culture medium
Adapter Sarstedt 14.1205
Confocal microscope Carl Zeiss LSM 710
Image analysis software Image J Available for free at: https://imagej.net
Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix PromoCell C-39216 2 mL in 500 mL of DMEM
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Concentration: 1% in cell culture medium
L-Glutamine Gibco 25030-024 Concentration: 1% in cell culture medium
Heparinun natricum Drossa Pharm AG Stock concentration: 5000 U.I./ mL
Chamberslides Bioswisstec AG 30108
CaCl2 x 2H2O Merck 2382.0500
MgCl2 x6 H2O Merck 1.5833.1000
Tween 20 Axon Lab AG 9005-64-5
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7030
Glycergel mounting medium Dako C0563

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
  2. Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
  3. Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
  4. Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
  5. Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
  6. Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
  7. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
  8. Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
  9. Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
  10. Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
  11. Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
Bedömning av Endothelial celler med hjälp av 3D cellkultur och icke-Antikoagulerat helblod blodförtunnande och antiinflammatoriska egenskaper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).More

Sfriso, R., Bongoni, A., Banz, Y., Klymiuk, N., Wolf, E., Rieben, R. Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood. J. Vis. Exp. (127), e56227, doi:10.3791/56227 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter