Summary
本议定书描述了 dna 聚合酶合成的修饰 dna 通过观察的变化近红外荧光标记 dna 使用凝胶电泳和凝胶显像。丙烯酰胺凝胶用于高分辨率成像分离的短核酸, 这是根据大小不同的速率迁移。
Abstract
对于任何酶, 都需要有健壮的、定量的方法来表征本地和工程酶。对于 dna 聚合, dna 合成可以用一种体外dna 合成方法进行表征, 然后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法。该方法的目的是量化合成的天然 dna 和修饰 dna (M-dna)。这些方法是特别有用的解决单核苷酸分解寡核苷酸, 使观察的个别步骤在酶寡核苷酸合成。这些方法已被用于评价的一系列生物化学和生物物理特性, 如测量的稳态速率常数的个别步骤的 dna 合成, 错误率的 dna 合成, 和 dna 结合的亲和力。通过修改后的核苷 triphosphates (NTP)、m-dna 和/或突变的 dna 聚合, 可以有效地评价基质 dna 聚合酶对的相对效用。在这里, 我们详细的分析本身, 包括必须作出的改变, 以适应非传统的底漆 dna 标记策略, 如近红外线荧光标记 dna。此外, 我们有详细的关键技术步骤, 丙烯酰胺凝胶浇注和运行, 这往往是技术上的挑战。
Introduction
dna 聚合进行准确和有效的 dna 合成, 是维持基因组完整性的关键。在不出错的情况下, 每秒合成数百个核苷酸的能力也使 DNA 聚合了分子生物学和生物技术的基本工具。然而, 这些属性也限制了 M DNA 基板的应用;一般而言, 天然 dna 聚合不能合成许多潜在的有价值的 M dna 基质, 可能是由于对使用非标准基质的高选择性压力在体内。许多小组开发了有针对性的进化方法来产生突变的 dna 聚合能够进行 M dna 合成1a,2,3,4,5;这些努力扩大了 DNA 的生物技术效用6,7,8。
为了评估突变 dna 聚合合成 M dna 的能力, 我们9,10, 其他11,12,13通常使用体外测量 dna聚合酶活性, 这是在这篇手稿中描述。在这些实验中, DNA 聚合是 co-incubated 与标记的底漆/模板复式和核苷三磷酸基板;用凝胶电泳法对产品进行评价。根据具体的实验问题, 突变的 DNA 聚合, 改良引物, 改良的模板, 或改性的核苷 triphosphates 可以使用, 使突变酶活性的系统生化评价。
从历史上看, 这些化验都依赖于5的放射性标签来跟踪 DNA 合成;最常见的是, 使用了32p 和33p。通常, 使用 T4 核苷酸激酶11实现标记。然而, 由于放射性标签的寿命有限, 成本相对较高, 安全处置, 我们组改用合成5的近红外荧光标记 DNA。使用相对低成本的近红外凝胶成像仪, 我们观察到了使用放射性标签 (未发表的结果) 之前研究的类似检测限制。我们已经成功地重现了过去的观测值9, 我们没有观察到与以前测量的速率常数 (未发布的结果) 有任何大的定量差异。
为了分析 dna 的大小, 因此, 我们依靠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法, 在毛细管电泳15问世之前为桑格测序14 。分离或移动的距离可以用作分子量的测量;大格式, 垂直聚丙烯酰胺凝胶可以实现单核苷酸的分辨率, 使定量观察的 DNA 寡核苷酸的长度不等。
总的来说, 这些实验是一种用于聚合酶表征的健壮方法。由于反应的时间敏感性, 准备和护理是必要的, 以达到重现的结果。此外, 虽然丙烯酰胺凝胶是一种非常有效的方法来测量 dna 合成, 以及许多其他的 dna 修饰反应, 单核苷酸分辨率, 它可以在技术上具有挑战性。这里的协议有望使用户能够执行这些实验, 同时避免最常见的错误。
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Protocol
1. 活动分析
注意: 有两种典型的化验方法, 通常用这里描述的方式来描述 DNA 聚合。它们的不同之处在于它们是否定性地描述了整个合成 (包括 DNA 合成的许多步骤), 或者它们是否定量地关注于个体的步骤。我们为下面的每一项都描述了必要的步骤.
注: 由于材料的装配比较复杂, 对时间敏感的实验, 我们建议所有材料都预先组装好。下面列出了该化验的所有重要成分的食谱。组件的商业供应商列在 材料表 中.
- 10x SF 缓冲配方 (10x SFB)
注: 在我们的分析中, 我们通常使用 Thermus aquaticus 的 DNA 聚合酶 I 的 N 终端截断, 通常称为史托菲尔片段 (SF) 16 , 17 。这里的食谱是 SF 3 , 13 的首选缓冲区。其他的缓冲器可以根据特定的 DNA 聚合酶来替代.
注: 10x SF 缓冲元件的最终浓度是 500 mm 三 pH 8.5, 65 mm 氯化镁 2 , 0.5 毫克/毫升 BSA, 500 毫米氯化钾, 和超纯水。测量是1毫升的 SF 缓冲, 这是足够的100-200 化验, 根据规模。缓冲区可以无限期地存储在-20 和 #176; C。- 结合0.5 毫升的1米, 65 和 #181; 1 m 氯化镁 2 , 50 和 #181; l 10 毫克/毫升 BSA, 0.0373 克氯化钾 (s) 在1.5 毫升管。添加385和 #181; L 超纯水, 达到1毫升的最终体积.
- 1x 存储缓冲区食谱 (1x SB)
注意: 1x 缓冲组件的最终浓度是 50 mm 三 pH 7.5, 1 毫米的, 0.6 毫米的 EDTA, 和50% 的甘油。该食谱使20毫升的 1x SB。- 将 0.012 g 的100和 #181; 0.5 米 EDTA, 并填充50毫升锥管40毫升的100毫米三 (pH 7.5), 使2xSB。由涡流混合.
- 将10毫升的2x 人转移到一个新的50毫升圆锥管和稀释甘油通过增加10毫升甘油到新的圆锥.
- 淬火缓冲橙 (QBO) 食谱
注: 使用放射性标签时, 用户通常会采用溴蓝和/或二甲苯蓝作为电泳染色的跟踪染料。然而, 这些染料会在近红外区域弱荧光, 干扰 DNA 信号。因此, 我们使用橙 G 在他们的地方, 所有的反应, 包含样本。虽然我们发现橙色 g 适合跟踪凝胶加载, 我们发现橙 g 是不太一致的染料, 跟踪电泳进展;因此, 我们在不含样品的凝胶的外部车道上运行含有溴蓝色的空车道, 以跟踪凝胶的进展。- 结合950和 #181; 95% 甲酰胺与25和 #181 的 l, 0.5 米 EDTA, 25 和 #181; 我超纯水。加入1勺橙 G 染料 (〜10毫克)。由涡流混合.
注意: 甲酰胺是有毒的;穿戴个人防护用品 (PPE), 如手套、眼镜和实验室大衣, 并作为危险废物处理.
- 结合950和 #181; 95% 甲酰胺与25和 #181 的 l, 0.5 米 EDTA, 25 和 #181; 我超纯水。加入1勺橙 G 染料 (〜10毫克)。由涡流混合.
2。分析运行
- 总体活动的定性描述
注: 对于这种检测, 我们通常保持恒定浓度的国家和变化的时间。目标是评估蛋白质的整体特征, 而不是衡量任何个体的步骤。为了准备一个反应, 相等的容量两个分开的组分, 复式混合 (描述在步 2.1.1) 和 dNTP 混合 (描述在步 2.1.2), 将分开地准备, 然后结合给最后的容量49和 #181;添加1和 #181; L 50x 酶将引发反应。可采取可变时间点;通常, 我们在0、5、15和60分钟淬火。- 制备 DNA 双面混合器
注意: 复式组合由 10x SF 缓冲器、底漆寡核苷酸、模板寡核苷酸和超纯水组成。每个反应增加的总体积为25和 #181; l. 1 和 #181; 在实验开始之前, 酶的 l 将被添加到主混合中.
注: 对于我们的化验, 我们通常使用一个 45-滨海模板和一个18或23滨海底漆。虽然可以使用一些不同的长度, 我们倾向于使用这个长度, 因为产品 (从18核苷酸到45核苷酸) 是很容易解决的单核苷酸水平使用所描述的凝胶电泳协议。随着寡核苷酸产品长度的增加, 在单核苷酸分辨率下解决产品可能具有挑战性.
注: 在我们的实验中, 我们使用5和 #39; 近红外荧光染料标签上的底漆上, 以观察底漆的产品。我们购买定制合成寡核苷酸轴承这一修改;但是, 可以使用任意数量的 post-synthetic 标记策略来合并此标签。该模板寡核苷酸没有标记, 所以它没有观察使用凝胶成像仪。对于这两种寡核苷酸, 我们存储的寡核苷酸在100和 #181; M 在10毫米三 (pH 8), 1 毫米 EDTA.
注意: 因为我们只观察底漆, 所以使用两倍的模板来确保所有的底漆 (正在观察的 DNA 物种) 退火到模板。最后的复式浓度在这个反应是 40 nM.
注: 近红外荧光染料往往有点光敏;在可能的情况下, 我们用箔覆盖底漆 (和任何含有底漆的溶液)。这包括聚丙烯酰胺凝胶在运行.
注: 下面是一个代表性的例子, 合成2和 #39; F M-DNA。- 稀释底漆1和模板 1 (参见 材料表 的顺序) 到1和 #181; 我每个都在超纯水中.
- 对于每个化验反应, 在单独的管, 结合5和 #181; 10x SF 缓冲器, 2 和 #181; 1 和 #181; m 引物 1, 4 和 #181; 1 和 #181; m 模板 1, 13 和 #181; 与热循环兼容的超纯水管.
- 使用以下程序在 thermocycler 中退火双工:98 和 #176; c 为2分钟、70和 #176; c 为 5 min、50和 #176; c 为 5 min、40和 #176; c 为5分钟, 在25和 #176 处举行; c。具体程序可能会因底漆/模板复式的退火温度而异。通常情况下, 我们更喜欢在退火温度下至少包含一个5分钟的步骤, 然后在温度为 5-10 度以下的另一步5分钟.
- 准备 2x dNTP 混合物
注意: 根据实验, 可以使用可变的 dNTPs 和浓度的 dNTPs。通常, 我们使用 50-200 和 #181; M 在反应。- 准备一个25和 #181; 一个包含100和 #181 的解决方案, 每个2和 #39 的 M; F-NTP。将 M-国家存储在 100 mM
- 准备50x 蛋白稀释
注: 对于长期贮存, 酶应保持在-20 和 #176; C 在1xSB。当除去-20 和 #176; C 冷冻, 酶应保持在冰在所有时间之前, 除了主混合。酶稀释应每天从集中的库存新鲜。浓缩酶的库存应返回到-20 和 #176; C 冷冻后立即使用.
注意: 因为我们主要评估突变的 DNA 聚合, 我们只使用已经在实验室中表达和纯化的酶, 使用已建立的方法 9 , 10 。对于商业购买的聚合, 用户应该警惕不同蛋白质的最佳缓冲, 以及它们与此处描述的缓冲区的兼容性.
注意: 每项实验的酶浓度会有所不同。在这里, 我们展示了一个代表性的例子2和 #39; F DNA 合成。- 制作 10 nM 酶溶液, 稀释1和 #181; L 酶 int1x. 某人做50x 最后的酵素集中。50x 溶液的浓度应为 500 nM。例如, 如果股票酶浓度是50和 #181; M, 添加1和 #181; l 储存酵素到99和 #181; l 1x 某人
注: 由于酶通常储存在50% 甘油, 溶液是相当粘性的。即使使用高度准确的管, 我们不建议移小于0.5 和 #181; 考虑到在酶稀释过程中准确度和精密度的重要性.
- 制作 10 nM 酶溶液, 稀释1和 #181; L 酶 int1x. 某人做50x 最后的酵素集中。50x 溶液的浓度应为 500 nM。例如, 如果股票酶浓度是50和 #181; M, 添加1和 #181; l 储存酵素到99和 #181; l 1x 某人
- 检测的初始化
- 将干燥槽的温度设置为50和 #176; C.
- 添加24和 #181; 退火双相混合 (参见步骤 2.1.1) 到25和 #181; l 2x dNTPs (参见步骤 2.1.2).
- 删除9.8 和 #181; 步骤2.1.4.2 中的混合物的 l, 添加到20和 #181; l QBO (参见1.3 节的食谱)。这分是 #34; 没有酵素和 #34; 控制, 并且应该获得为每次奔跑.
- 添加0.8 和 #181; L 50x 酶 (见步骤 2.1.3.1) 到复式/dNTP 混合。吸管向上和向下与大体积微彻底混合.
- 在5、15和60分钟后, 通过删除10和 #181; 每个反应溶液的 l, 并加入含有20和 #181 的离心管; l QBO (在1.3 节中描述).
- 淬火后, 反应可以在4和 #176 下无限期地存储在铝箔上; c 或-20 #176; c.
注: 对于 M-DNA 合成的各个步骤的定量表征, 可以运行一个非常相似的方法来定量获得蔑-氏参数。这种检测方法使用所有相同的材料。蔑氏参数可测量 dNTP;在这种情况下, 最重要的区别是, 而不是增加复式混合到 dNTP 混合, 它增加了双相混合与酶的一系列 2x dNTP 解决方案。同样, 蔑氏参数可以测量 DNA 双相。为了满足使用蔑-氏方程所需的假设, 必须满足特定条件。这些条件, 以及分析的基本力学, 在前面的方法文章 11 中得到了很好的解释.
- 制备 DNA 双面混合器
3。凝胶电泳
注意: 由于浇注凝胶是时间敏感的, 所有材料都预先装配好。下面列出了该化验的所有重要成分的食谱;供应商在 材料表 中列出.
- 为20% 丙烯酰胺凝胶准备丙烯酰胺.
注: 该配方使 1 L 的丙烯酰胺混合物;这个溶液的大约120毫升使用每凝胶。将此解决方案存储在室温下长达一年的铝箔.
注意: 聚丙烯酰胺是神经毒素。在所有的凝胶浇注过程中, 穿戴手套和实验外套是很重要的。如果聚丙烯酰胺得到手套, 立即更换手套。如果不聚合丙烯酰胺, 将受污染的材料放在一个标记的聚丙烯酰胺废物袋中.
注: 本议定书采用了40% 丙烯酰胺, 含38.67% 丙烯酰胺和1.33% 双丙烯酰胺, 用于单体交比29:1 的预混。- 重17克预混粉末。重六分开的部分 70 g 尿素 (共计 420 g).
注: 尿素必须加入部分。我们发现最好把它分成六部分. - 在搅拌板上设置一个2升塑料烧杯。在烧杯中加入一根大的搅拌棒。搅拌时用箔盖住烧杯以防飞溅.
- 在烧杯中加入500毫升的40% 丙烯酰胺溶液。确保解决方案是激动人心的.
- 添加以前的 weighed-out。添加一分尿素。允许解决方案混合。尿素溶解缓慢, 可能出现朦胧和白色后, 最初添加。在接下来的一个小时内, 慢慢地将剩余的尿素等分到混合物中。让溶液混合, 直到它是完全透明和无色.
注: 通常情况下, 允许这一夜轰动。如果溶液仍未溶解, 则加入小等分水, 等待尿素溶解. - 添加尿素将增加体积接近 1 l. 加水增加体积到刚好1升.
- 存储在 1 L 有色玻璃瓶或用铝箔覆盖玻璃瓶.
- 重17克预混粉末。重六分开的部分 70 g 尿素 (共计 420 g).
- 浇注丙烯酰胺凝胶.
注意: 在处理玻璃板时, 要小心避免玻璃板和任何坚硬表面之间的接触。这是特别重要的, 因为粗暴的处理可能导致小裂缝的玻璃;这些裂缝可能不可见, 直到凝胶运行, 这发生在较高的温度。我们使用软木环来防止这种不必要的接触。- 清洗板
- 获取两个 33 cm x 42 cm 凝胶板, 一个缺口和一个缺口板。将盘子放在单独的软木环上.
- 用肥皂和水彻底冲洗盘子。确保没有留下肥皂条纹或凝胶斑点.
- 请注意板珠的哪一面少了水。这边是凝胶面.
注: 如果凝胶在板的另一侧运行, 它可能会使凝胶转移具有挑战性.
- 干板
- 使用纸巾擦干每个盘子的两张脸.
- 使用精致的任务雨刷来干燥剩余区域。特别注意板的边缘, 胶带将被应用.
- 用70% 的乙醇冲洗玻璃板, 并用任务雨刷擦拭.
- 确保没有纸巾纤维或水滴。这些会在浇注凝胶时产生气泡.
- 添加间隔符
- 获取 0.75 mm 间隔符。用戴手套的手指在 DI 水下, 用戴手套的手指轻轻地弄湿垫片.
- 沿缺口板的长边放置垫片。清理所有溅在盘子上的水。确保垫片与玻璃板对齐, 而不是挂在边缘.
- 密封胶
- 戴上干手套。用精致的任务雨刷再次擦干玻璃的边缘.
- 将缺口板顶部与缺口板对齐, 然后慢慢向下, 以使板彼此相互压。再次检查以确保所有板的边缘都对齐.
- 使用凝胶胶带, 将胶带放在除顶部以外的所有边缘。确保磁带被均匀地对齐并且密封牢固。磁带可以在一个运动中应用, 或者每一方都可以单独完成。用剃刀把带子的两端切下来.
- 在凝胶底部添加一层附加的磁带。胶带越紧, 浇注时凝胶就越不容易漏出.
- 用白色夹子夹住玻璃三明治的侧面。向每边添加3剪辑, 将4剪辑放到底部.
- 浇注凝胶
- 通过溶解0.3 克过硫酸铵和在超纯水中稀释3毫升, 使3毫升的10% 过硫酸铵溶液 (APS).
注: 每凝胶需要1.2 毫升 APS。在制作完后管的日期。APS 解决方案到期2周, 应保持在4和 #176; C. - 传输125和 #181;tetramethylethylenediamine (TEMED) 到一个单独的离心管.
注: TEMED 有毒;穿戴防护用品, 如手套、眼镜、工作服等. - 获取一个喷瓶, 并删除尖漏斗。测量出125毫升的水在一个毕业的气缸, 并添加到瓶子。用永久性的记号标记瓶子外面的水位。把水扔掉。这个修改过的喷瓶可以被无限期地重复使用, 适当的清洗 (见下).
- 在洗涤槽旁边设置瓶塞环, 这样就有一个放置凝胶的地方。把盘子三明治放在这里。把软木塞放在水槽里, 这样就可以在凝胶被浇的时候放上盘子。凝胶将被倒入玻璃板三明治的一个角度, 所以底部将休息在软木塞, 而顶端将休息在水槽的边缘。确保在这些区域下面有垫子, 以防聚丙烯酰胺的脱落.
- 将 ap 解决方案和 TEMED 解决方案放在水槽的另一侧, 用空的喷瓶。将井梳与所需数量的水井放在水槽一侧, 用盘子。在附近放4夹子.
注意: 过程中的下一步是非常时间敏感的。准备好通过这些步骤快速移动。有有限的时间来得到的混合物之间的板块之前, 它聚合。所有组件 (micropipettes 预设, 以纠正体积, 解决方案, 玻璃板) 是精心安排, 以尽快倒入凝胶。如果需要较慢的聚合, APS 和 TEMED 浓度可以减半;然而, 这将需要较长的聚合时间. - 将20% 丙烯酰胺凝胶溶液倒入喷瓶中至标记点。在有标记的线上再倒一些凝胶溶液, 这样在小泄漏的情况下就有足够的解决方案。这是大约120毫升的凝胶溶液.
- 添加120和 #181; l TEMED 和600和 #181; l APS 的聚丙烯酰胺凝胶溶液在喷水壶的同时。在聚丙烯酰胺凝胶溶液中快速添加600和 #181;
- 快速盖上喷瓶和涡流。把盘子三明治放在水槽里.
- 开始浇注。这应该只需要1-2 分钟, 以避免聚合。缓慢, 但稳步, 增加压力的喷瓶, 使凝胶溶液出来均匀。如果解决方案开始从喷瓶不规则飞溅, 释放压力, 使瓶子变得充气, 并恢复浇筑。观察, 以确保凝胶解决方案覆盖所有领域, 它不会从任何一方泄漏。为了消除气泡, 改变板的角度。气泡会在顶部弹出, 如果角度较陡, 则会运行得更快。继续浇注, 直到溶液到达缺口区域的顶端, 并略微溢出缺口边缘。清除所有气泡.
注: 如果板夹层泄漏, 或没有足够的凝胶溶液和解决方案没有达到顶部的板, 凝胶不能使用。等待, 直到凝胶已聚合, 并据此清洗. - 将井梳添加到板三明治中。把4夹在梳子上按下, 并允许均匀分布的井.
- 将喷瓶中的剩余凝胶溶液迅速处理成标记的聚丙烯酰胺废料。用 DI 水冲洗 2 #160; 3 次, 通过喷嘴喷出.
注意: 重要的是要迅速执行这一清洗, 以防止聚丙烯酰胺堵塞在喷瓶。如果在喷嘴内发生少量的聚合, 下一凝胶就会被浇得太慢而不能成功。如果发生聚合, 则丢弃喷瓶.
当凝胶正在聚合时,
- 通过溶解0.3 克过硫酸铵和在超纯水中稀释3毫升, 使3毫升的10% 过硫酸铵溶液 (APS).
- 清洗板
- 运行丙烯酰胺凝胶
- , 使1x 运行缓冲。将17克的预混固体分解为1升的超纯水。摇动缓冲器直至全部溶解.
- 卸下板夹三明治中的所有活页夹.
- 使用剃须刀切割磁带, 并从所有的板三明治边缘取出胶带.
- 清除玻璃表面的所有聚合凝胶。使用剃刀沿边缘刮掉剩余的凝胶。用纸巾和水擦拭盘子, 尽可能去除尽可能多的聚丙烯酰胺残渣。过量的丙烯酰胺和/或胶带通常会在凝胶电泳过程中燃烧.
- 通过将其均匀地推到两侧来移除井梳.
- 用剃刀把多余的凝胶沿板三明治的顶部切掉。沿板的缺口边缘切片.
- 使用注射器和 DI 水冲洗水井, 清除井中的杂物。确保每一个井都能充满水, 并不会被过量的聚合凝胶堵塞.
- 将板夹层放入装置中, 使较长的板向外朝向, 缺口空间朝向内.
- 添加剪辑, 以夹住板夹三明治和铝板与设备。添加到板的外部, 以促进甚至运行.
- 添加缓冲区以覆盖基槽, 刚好足以覆盖顶部的井。缓冲区可以过滤和重复使用约5凝胶.
- 热板20分钟运行的凝胶电泳在 50 W.
- 预热盘子后, 清理水井。在浴缸中使用注射器和缓冲液, 将剩余的缓冲盐从油井中喷出。这样做几次, 以确保干净的水井。如果井不干净, 乐队将磨损和图像不会被解释。虽然这可能会耗费时间, 但我们发现获取良好数据是必需的.
- 对两侧的最外面的车道, 吸管5和 #181; L 95% 甲酰胺与溴蓝色。这是相同的解决方案, QBO, 但与溴蓝代替橙 G。这将提供一个视觉上, 在哪里切割凝胶成像, 以及有多远的 DNA 已经运行.
- 对于每个要分析的样本 (在2.1.1 节中生成), 添加3和 #181; L 到凝胶的单井。在装载所有样品之后, 等待1分钟样品解决.
- 将顶部和底部的塑料浴盖上。把电线连接到仪器上。红色表示正电荷, 所以它应该在底部, 以便 DNA 向下运行.
- 将电线连接到电源, 并设置为 50-55 w 运行凝胶约3小时或直到溴蓝色染料前面已经运行至少2/3 下凝胶.
- 成像凝胶
注: 这种凝胶非常薄, 很难处理。必须非常小心, 以防止撕裂和失去整个凝胶.
注: 根据 DNA 标签, 它可能需要使用不同的凝胶仪。该协议使用近红外荧光染料和样品的成像是在凝胶成像仪上进行的 (参见 材料表 )。该协议是专门为该成像仪写的。- 当溴蓝色染料前端已运行至少2/3 下的凝胶 (〜28厘米), 凝胶可以停止关闭电源。从装置上取下凝胶, 放在软木环上.
- 用一个小楔板分离器分隔板。将分离器放在凹槽的内侧角上, 将其拉出。慎用, 切勿过度用力;如果施加太大的压力, 缺口可能会破裂.
- 一旦在板块之间的吸力释放, 小心地抬起顶部板, 并确定哪个板块的凝胶是。如果凝胶粘在底板上, 则将顶部板拉出并放置在软木环上。如果在顶部板上的凝胶被解除, 移动缓慢, 凝胶可能回落到底部板。如果凝胶不下落, 再慢慢地移动并且拉扯胶凝体的剩余的部分从底部板材, 并且安置顶板与胶凝体在一个分开的黄柏圆环.
- 一旦板块分离, 请看染料在凝胶上的位置, 并从凝胶的顶部和底部去除多余的凝胶。通常, 用我们的构造, 使用18或23核苷酸底漆和45核苷酸模板, 没有 DNA 之间的溴蓝色染料前和底部的凝胶。从染料垂直切割到凝胶的顶端。染料和凝胶边缘之间的空隙也没有 DNA。最后, 在凝胶上的井距下面切几英寸。在凝胶的顶端没有核酸.
注: 将凝胶切割成尽可能小的尺寸, 使其更容易传送到成像设备上。如果凝胶太大, 它更容易在转移过程中撕裂。当我们经常修剪凝胶在成像之前, 我们建议使用极端小心, 当修剪相关数据可能丢失, 如果关心不采取。要检查删除的部分是否包含其他数据, 我们通常会对该凝胶的切除部分进行额外扫描, 以确保没有数据丢失. - 将凝胶涂上水以防止干燥.
- 清洗成像图表面。使用任务雨刷, 用水和乙醇擦拭表面。在凝胶将被放置的表面添加一层薄薄的水.
- 将所需的凝胶部分转移到 li 林的湿表面.
- 通过将气泡从凝胶中轻轻地按压出来, 并用雨刷擦拭, 来消除空气泡。使用小心, 因为它是非常容易撕裂的凝胶通过推动气泡太硬.
- 根据制造商和 #39 的协议对凝胶进行图像处理。使用可用软件对该凝胶进行分析.
- 当凝胶被成像时, 清除多余的丙烯酰胺凝胶、洗涤板, 并过滤所要重复使用的缓冲液的工作空间.
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Representative Results
一个成功的聚丙烯酰胺凝胶分析的总体活动的定性描述 (在2.1 节,图 1) 和稳态动力学 (说明在说明中的 2.1,图 2) 显示。还显示了不成功的聚丙烯酰胺凝胶分析 (图 3)。
请注意, 没有商业可用的梯子或分子标记使用。有时, 我们将使用已知的聚合酶-基质结合物来创建分子标记;然而, 重要的是要注意, 不同的修饰核苷酸有非常不同的电泳迁移, 使比较的相同长度, 但不同的核苷酸结构不适当的寡核苷酸。
图 1: 成功的聚丙烯酰胺凝胶分析的例子整体活动的定性描述.请注意, 各个频带是定义良好和定期的。带代表不同长度的寡核苷酸;这种凝胶可以方便地比较聚合。没有酵素控制车道用 "-" 表明。活动由产品的长度和被标记的底漆的部分判断被转换成更大的产品。从这个分析中, E6 和 E5 是最活跃的。E3 和 E2 在活动中近似相等, 但少于 E6 或 E5, E4 和 E1 是活性最低的酶。
图 2: 使用稳态动力学定量分析成功的凝胶的例子.请注意, 乐队是很好的解决和明确定义。为了测量寡核苷酸合成过程中各个步骤的稳态速率常数, 用不同数量的三磷酸核苷 (在本例中为桩) 孵育酶;请注意, 只有 n 和 (n+1) 产品是合成的, 从而能够量化奇异事件。
图 3: 用于整体活动的不成功凝胶的示例.在处理过程中, 凝胶被撕裂, 导致了带内可见的间隙。请注意, 凝胶带不规则形状, 使量化和分析困难。
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Discussion
在这里, 我们描述了一种测定 dna 聚合酶介导的 M dna 的合成。利用近红外标记的 DNA 引物, 利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳解决不同大小的寡核苷酸, 可以获得核苷酸的单核苷酸分辨力, 从而实现对合成的精确测量。这些方法可以用来测量酶的整体活性 (2.1 节) 或测量单个步骤的蔑氏参数 (注意以下步骤 2.1)。我们的实验室最近使用这些来表征以前进化的酶9以及合理设计的酶10。
我们在这里所描述的分析不同于以前的方法使用放射性 DNA 标签。从历史上看, 放射性已被用来跟踪 DNA 合成由于高灵敏度, 可以获得使用放射性磷标签11,18。不幸的是, 昂贵的处置费用以及放射性标签的货架寿命有限, 可以使放射性标签的使用望而却步。在这里, 我们描述了使用近红外线荧光标记的 DNA, 这并不遭受这些缺点。值得注意的是, 与近红外荧光染料, 我们看到类似的检测限制放射性标记的 DNA (未发表的结果)。然而, 由于荧光染料在可见光范围内, 我们无法观察到类似的检测限制 (未发表的结果)。虽然我们的小组通常使用商业制备的 DNA 轴承近红外荧光, 这些染料是兼容的一些已建立的合成 5 ' 修改化学试剂, 可用于安装这些标签。
近红外荧光染料也有好处, 有多种商业可用的颜色, 这可以使更复杂的实验, 监测合成的两个标记的寡核苷酸在一个单一的实验。与放射性标签, 这些类型的多组分实验是不容易执行。这可能会使一些更复杂的实验, 特别是正交复制实验。
这种方法, 以及任何使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法, 主要是受技术挑战, 执行电泳, 这些实验的低吞吐量, 以及有限的大小范围, 可观察到单核苷酸分辨率。我们希望这一详细的协议能够让小组克服这些化验的技术挑战。值得注意的是, 虽然检测的吞吐量是有限的, 但使用近红外荧光标签确实增加了吞吐量, 因为它不要求用户开发放射。然而, 凝胶仍然需要大约4-6 小时来设置和运行, 限制了每天可以运行的实验次数。有限的范围是由聚丙烯酰胺的电泳能力造成的。实际上, 这些限制意味着这些分析最适合需要单核苷酸分辨率的重点研究问题。
最近,高通量 dna 测序19已被越来越多地用作表征 dna 聚合2021的方法。这些分析是值得注意的显著增加的吞吐量, 这使得更广泛的问题集中在序列偏差和错误谱。重要的是, 虽然高通量测序可以使许多并行实验, 它可能是挑战的解释单核苷酸基础上。这为使用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的酶检测提供了一个令人振奋的机会, 以填补高通量测序中的空白, 确保本文所描述的方法在今后的许多年内都是相关的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了科学进步研究公司 (科特雷尔学院学者奖 #22548) 和三生物技术 (ResearchReward 赠款 #G139) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33x42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
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