Analyse d’activité de l’ADN polymérase utilisant l’ADN marqué Fluorescent proche infrarouge visualisée par électrophorèse sur Gel d’Acrylamide

Summary

Ce protocole décrit la caractérisation de la synthèse de l’ADN polymérase d’ADN modifié grâce à l’observation des changements à l’ADN fluorescent étiqueté proche infrarouge à l’aide de l’électrophorèse sur gel et gel de l’imagerie. Gels d’acrylamide sont utilisés pour l’imagerie haute résolution de la séparation des acides nucléiques courts, qui migrent à des vitesses différentes selon la taille.

Abstract

Pour n’importe quel enzyme, méthodes quantitatives robustes sont tenus pour la caractérisation des indigènes et ingénieries des enzymes. Pour les ADN polymérases, synthèse de l’ADN peut être caractérisée à l’aide d’un essai in vitro ADN synthèse avec suivi par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le but de ce test est de quantifier la synthèse de l’ADN naturel et mis à jour l’ADN (ADN-M). Ces approches sont particulièrement utiles pour résoudre les oligonucléotides avec résolution de nucléotide, permettant l’observation des différentes étapes au cours de la synthèse d’oligonucléotide enzymatique. Ces méthodes ont été appliquées à l’évaluation d’un tableau des propriétés biochimiques et biophysiques, comme la mesure des constantes de vitesse de l’équilibre des différentes étapes de la synthèse de l’ADN, le taux d’erreur de la synthèse de l’ADN et l’affinité de liaison de l’ADN. En utilisant modifié composants y compris, mais non limité à, mis à jour le nucléosides triphosphates (NTP), M-ADN et/ou mutants polymérases d’ADN, l’utilité relative de substrat-ADN polymérase paires peuvent être évalués de manière efficace. Ici, nous détaillons le test lui-même, y compris les changements qui doivent être faits pour accommoder les ADN apprêt non traditionnels, étiquetage des stratégies telles que la proche-infrarouge fluorescent étiquetée ADN. En outre, nous avons détaillé les étapes techniques cruciales pour gel d’acrylamide coulée et en cours d’exécution, qui peut souvent être techniquement difficiles.

Introduction

ADN polymérases effectuent la synthèse d’ADN précise et efficace et sont essentiels pour préserver l’intégrité du génome. La capacité de synthétiser des centaines de nucléotides par seconde sans faire d’erreurs fait également des outils essentiels de polymérases d’ADN en biologie moléculaire et biotechnologie. Toutefois, ces propriétés limitent également les demandes pour les substrats de l’ADN monocaténaire ; de manière générale, polymérases d’ADN naturels ne peut pas synthétiser plusieurs substrats de M-ADN potentiellement intéressants, probablement à la haute pression sélective contre l’utilisation des substrats non standard en vivo. De nombreux groupes ont développé des approches d’évolution dirigée pour générer des polymérases d’ADN mutants capables de M-ADN synthèse^1a,2,3,4,5; ces efforts sont multipliés l’utilitaire biotechnologique de l’ADN^6,7,8.

Pour évaluer la capacité du mutant ADN polymérases de synthétiser l’ADN monocaténaire, nous avons^9,10et autres^11,12,13 utilisent généralement des mesures in vitro de l’ADN activité polymérase, qui sont décrites dans ce manuscrit. Dans ces expériences, les ADN polymérases sont couvés conjointement avec un apprêt/modèle duplex étiqueté et substrats de nucléoside triphosphate ; les produits sont évalués par électrophorèse sur gel. Selon la question expérimentale spécifique, mutant ADN polymérases, amorces modifiés, modèles modifiés ou mis à jour le nucléosides triphosphates peuvent être utilisé, ce qui permet une évaluation biochimique systématique de l’activité de l’enzyme mutante.

Historiquement, ces tests sont sont appuyés sur un marqueur radioactif de 5' pour suivre la synthèse de l’ADN ; plus couramment, ³²P et ³³P ont été utilisées ; en règle générale, l’étiquetage est réalisé en utilisant T4 polynucléotide kinase¹¹. Toutefois, en raison de la durée de vie et le coût relativement élevé des étiquettes radioactifs et de leur élimination en toute sécurité, notre groupe utilise à la place un fluorophore synthétique 5' du proche infrarouge étiqueté d’ADN. À l’aide d’un imageur de coût relativement faible gel de proche-infrarouge, nous avons observé des limites de détection similaires à des études antérieures à l’aide d’étiquettes radioactives (résultats non publiés). Nous avons reproduit avec succès passé observations⁹, et nous n’avons pas observé de toute grande différence quantitative avec des constantes de vitesse précédemment mesurée (résultats non publiés).

Pour analyser la taille de l’ADN et par conséquent, l’étendue de la synthèse de l’ADN, nous nous appuyons sur des méthodes d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide développés à l’origine de séquençage Sanger¹⁴ avant l’avènement de l’électrophorèse capillaire¹⁵. La distance de séparation ou de mobilité peut être utilisée comme une mesure de poids moléculaire ; grand format, des gels de polyacrylamide verticales peut atteindre résolution nucléotide, permettant l’observation quantitative des oligonucléotides d’ADN de différentes longueurs.

Collectivement, ces expériences sont une méthode robuste pour la caractérisation de la polymérase. En raison du temps la nature sensible des réactions, préparation et soins est nécessaire pour obtenir des résultats reproductibles. En outre, tandis que le gel d’acrylamide est un moyen très efficace de mesurer la synthèse de l’ADN, ainsi que nombreux autres ADN modificateurs réactions, avec résolution de nucléotides, il peut être techniquement difficile. Le protocole ici permettra je l’espère aux utilisateurs d’effectuer ces expériences tout en évitant les erreurs les plus communes.

Protocol

1. dosage de l’activité

Remarque : il existe deux types de typiques des dosages qui tournent souvent pour caractériser les polymérases d’ADN en utilisant les méthodes décrites ici. Ils diffèrent si ils caractérisent qualitativement la synthèse globale (qui englobe les nombreuses étapes de la synthèse de l’ADN) ou si elles se concentrent quantitativement sur différentes étapes. Nous décrivons ci-dessous les étapes nécessaires pour chacune d'entre elles.
Remarque : L’assemblage de matières étant relativement complexe, pour des expériences sensibles de temps, nous recommandons que tous les matériaux sont assemblés au préalable. Les recettes de tous les composants critiques du dosage sont répertoriées ci-dessous. Les fournisseurs commerciaux pour les composants répertoriés dans la Table des matières.

1. 10 x recette SF tampon (10 x SFB)
   Remarque : dans nos tests, nous utilisons généralement la troncature N-terminale de l’ADN polymérase I Thermus aquaticus, communément appelé Stoffel fragment (SF) ^{16 , 17}. La recette ici est le tampon préféré pour SF ^{3 , 13}. Autres tampons peuvent être remplacés selon l’ADN polymérase spécifique.
   Remarque : La concentration finale de 10 x composants de tampons de SF sont 500 mM Tris pH 8,5, 65 mM MgCl ₂, 0,5 mg/mL de BSA, 500 mM KCl (s) et l’eau ultrapure. Les mesures sont pour 1 mL de tampon de SF, ce qui est suffisant pour des dosages de 100-200, selon leur ampleur. La mémoire tampon peut être conservé indéfiniment à-20 ° C. Tube de Tris, 65 µL de 1 M du MgCl ₂, 50 µL de BSA 10 mg/mL et 0,0373 g de KCl (s) en un 1,5 mL
   1. moissonneuses 0,5 mL de 1 M. Ajouter 385 µL d’eau ultrapure pour atteindre un volume final de 1 mL.
2. recette de stockage tampon 1 x (1 x SB)
   Remarque : la concentration finale de 1 x composants de tampons sont 50 mM Tris pH 7.5, 1 millimètre DTT, 0,6 mM EDTA et 50 % de glycérol. La recette donne 20 mL de 1 x SB.
   1. Combiner 0,012 g TNT, 100 µL de 0,5 M EDTA et remplir un tube conique de 50 mL avec 40 mL de 100 mM Tris (pH 7.5) pour faire des 2xSB. Mix au vortex.
   2. Transférer 10 mL de 2 x SB à nouveau 50 mL conique tube et diluer avec du glycérol en ajoutant 10 mL de glycérol à la nouvelle conique.
3. Recette de tampon orange (oqb) trempe
   Remarque : lorsqu’on utilise des étiquettes radioactifs, utilisateurs souvent emploiera bleu de bromophénol et/ou xylène cyanol comme un colorant de repérage pour le progrès de l’électrophorèse. Toutefois, ces colorants seront faiblement fluorescence dans la région du proche infrarouge, interférer avec le signal de l’ADN. Ainsi, nous utilisons Orange G à leur place pour toutes les réactions qui contiennent des échantillons. Alors que nous avons trouvé G Orange approprié pour le suivi de gel de chargement, nous avons trouvé Orange G moins compatible comme un colorant qui suit l’évolution de l’électrophorèse ; ainsi, nous courons voies vides contenant bromophénol bleu sur les voies extérieures du gel qui ne contiennent pas d’échantillon afin de suivre la progression du gel.
   1. Combiner 950 µL de 95 % formamide avec 25 µL d’EDTA 0,5 M et 25 µL d’eau ultrapure. Ajouter 1 cuillère de G de colorant orange (~ 10 mg). Mix au vortex.
      ATTENTION : Le Formamide est toxique ; porter l’équipement de protection individuelle (EPI) tels que gants, lunettes et blouse de laboratoire et jeter parmi les déchets dangereux.

2. Course de dosage

1. caractérisation Qualitative de l’activité globale
   Remarque : pour ce test, nous avons généralement maintenir une concentration constante de M-PNT et varient de temps. L’objectif est d’évaluer les caractéristiques générales de la protéine plutôt qu’à mesurer toute étape individuelle. Pour préparer une réaction, un volume égal de deux parties distinctes, le mix duplex (décrit à l’étape 2.1.1) et le mélange dNTP (décrit à l’étape 2.1.2), sera préparé séparément et ensuite combinés pour donner le volume final de 49 µL. L’ajout d’enzyme de 50 x 1 µL entamera ensuite la réaction. Points dans le temps variable peuvent être prises ; en général, nous étancher à 0, 5, 15 et 60 min.
   1. Préparation de l’ADN duplex mix
      Remarque : le mix duplex est composé de 10 x tampon SF, oligonucléotide amorce, oligonucléotide de modèle et l’eau ultrapure. Volume total ajouté à chaque réaction est 25 µL. 1 µL d’enzyme sera ajouté au mélange maître qui précède immédiatement le début de l’expérience.
      NOTE : Pour nos tests, nous utilisent généralement un modèle 45-mer et une amorce de 18-mer ou mer-23. Un certain nombre de différentes longueurs peut être utilisés, nous avons tendance à utiliser cette longueur parce que les produits (allant de 18 nucléotides à 45 nucléotides) sont faciles à résoudre sur un niveau de nucléotide en utilisant les protocoles d’électrophorèse sur gel de décrit. Comme oligonucléotide produits augmentent de longueur, il peut être difficile de résoudre les produits en résolution de nucléotide.
      NOTE : Dans nos expériences, nous utilisons un 5 ' étiquette de colorant fluorescent proche infrarouge sur le brin d’apprêt pour observer les produits d’apprêt. Nous achetons des oligonucléotides synthétisés personnalisés portant cette modification ; Cependant, cette étiquette peut être incorporée à l’aide de n’importe quel nombre de stratégies de marquage après synthétiques. L’oligonucléotide de modèle n’est pas étiquetée, et donc il n’est pas observée à l’aide de l’imageur de gel. Pour les deux oligonucléotides, nous stockons les oligonucléotides à 100 µM en 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
      NOTE : Parce que nous observons seulement l’apprêt, un excès de double du modèle sert à s’assurer que tous les apprêts (l’espèce de l’ADN qui est observée) sont recuits au modèle. La concentration finale en duplex dans cette réaction est de 40 nM.
      Remarque : Les colorants fluorescents proche infrarouge sont souvent sensibles à la lumière un peu ; Lorsque cela est possible, nous couvrons l’amorce (et toute solution contenant l’amorce) avec du papier. Cela inclut le gel de polyacrylamide pendant son exécution.
      Remarque : Voici un exemple représentatif de la synthèse de 2 ' F M-ADN.
      1. Diluer amorce 1 et modèle 1 (voir la Table des matières pour la séquence) à 1 µM de chaque dans de l’eau ultrapure.
      2. Pour chaque réaction de dosage, dans des tubes distincts, mélanger 5 µL de 10 x tampon SF, 2 µL d’apprêt µM 1 1, 4 µL de 1µm modèle 1 et 13 µL d’eau ultrapure à tubes compatibles avec un thermocycleur.
      3. Recuire le duplex dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant : 98 ° C pendant 2 min, 70 ° C pendant 5 min, 50 ° C pendant 5 min, 40 ° C pendant 5 min, tenir à 25 ° C. Le programme spécifique peut varier selon la température de recuit de l’apprêt/modèle recto verso. En règle générale, nous préférons d’inclure au moins une étape de 5 min à la température de recuit et puis une autre étape de 5 min à une température de 5 à 10 degrés en dessous de la température de recuit.
   2. Préparation du mélange de x dNTP 2
      Remarque : selon l’expérience, il est possible d’utiliser des dNTPs variable et les concentrations des dNTPs. En général, nous utilisons 50-200 µM dans la réaction.
      1. Préparer une solution de 25 µL contenant 100 µM de chaque 2 ' F-NTP. Stocker le M-PNT à 100 mM.
   3. Préparation de 50 x dilution de protéine
      Remarque : stockage de longue durée, enzymes doivent être conservés à-20 ° C en 1xSB. Lorsque retirés du congélateur-20 ° C, les enzymes doivent être conservés sur la glace en tout temps avant l’addition au mélange maître. Les dilutions enzyme se référera fraîches en provenance du stock concentré chaque jour. Le stock d’enzyme concentrée doit être retourné à la congélation de-20 ° C immédiatement après utilisation.
      NOTE : Parce que nous évaluons surtout mutants polymérases d’ADN, nous utilisons uniquement les enzymes qui ont été exprimées et purifiées dans notre laboratoire à l’aide de méthodes reconnues ^{9 , 10}. Pour polymérases achetés dans le commerce, les utilisateurs doivent se méfier de tampons optimales pour différentes protéines et leur compatibilité avec les tampons décrit ci-après.
      Remarque : Concentrations de l’Enzyme varie pour chaque expérience. Ici, nous montrons un exemple représentatif pour 2 ' synthèse de l’ADN-F.
      1. Pour faire une solution d’enzyme 10 nM, diluer 1 µL d’enzyme into 1 x SB faire une concentration d’enzyme final 50 x. La concentration de la solution 50 x devrait être de 500 nM. Par exemple, si la concentration de l’enzyme stock 50 µM, ajoutez 1 enzyme stock µL à 99 µL 1 x SB.
         Remarque : Étant donné que l’enzyme est généralement stocké dans 50 % de glycérol, la solution est assez visqueuse. Même si à l’aide de pipettes très précis, nous ne recommandons pas pipetage inférieure à 0,5 µL, compte tenu de l’importance de l’exactitude et la précision au cours de la dilution d’enzyme.
   4. Ouverture de dosage
      1. régler la température d’un bain sec à 50 ° C.
      2. Ajouter 24 µL du recuit duplex mélanger (voir étape 2.1.1) à 25 µL de 2 x dNTPs (Voir l’étape 2.1.2).
      3. Supprimer 9,8 µL du mélange dans étape 2.1.4.2 et ajouter 20 µL de QBO (voir la section 1.3 pour la recette). Cette partie aliquote sert un " aucune enzyme " contrôle et doit être obtenue pour chaque série.
      4. Ajouter 0,8 µL d’enzyme x 50 (voir étape 2.1.3.1) au mélange duplex/dNTP. Pipette de haut en bas avec une micropipette de grand volume pour bien mélanger.
      5. Après 5, 15 et 60 min, étancher la réaction en retirant 10 µL de chaque solution de réaction et en ajoutant dans un tube de microcentrifuge contenant 20 µL QBO (décrit à la section 1.3).
      6. Une fois trempé, les réactions peuvent être stockées sous film indéfiniment à 4 ° C ou -20 ° C.
         Remarque : Pour la caractérisation quantitative des différentes étapes de la synthèse de l’ADN monocaténaire, un dosage très similaire peut être exécuté pour obtenir quantitativement les paramètres de Michaelis-Menten. Ce test utilise tous les matériaux mêmes. Paramètres de Michaelis-Menten peuvent être mesurées pour le dNTP ; dans ce cas, la différence la plus importante est que, plutôt que d’ajoutant le mix duplex à Mélange dNTP, il ajoute le mélange recto verso avec l’enzyme à une série de solutions de x dNTP 2. De même, les paramètres de Michaelis-Menten peuvent être mesurées pour DNA bicaténaire. Certaines conditions doivent être remplies pour satisfaire les hypothèses nécessaires à l’utilisation de l’équation de Michaelis-Menten. Ces conditions et les mécanismes de base de l’analyse, sont bien expliqués dans un précédent article de méthodes ¹¹.

3. Électrophorèse sur gel

Remarque : verser le gel étant temps sensible, tous les matériaux sont assemblés au préalable. Les recettes de tous les composants critiques du dosage sont énumérés ci-dessous ; fournisseurs sont énumérés dans la Table des matières.

1. Préparation de l’acrylamide pour 20 % d’acrylamide gel.
   NOTE : Cette recette donne 1 L de mélange acrylamide ; environ 120 mL de cette solution est utilisée par gel. Conserver cette solution à température ambiante sous film pour aller jusqu'à un an.
   ATTENTION : Le Polyacrylamide est neurotoxique. Il est important de porter des gants et une blouse de laboratoire pendant toutes les étapes du coulage de gel. Polyacrylamide obtient sur les gants, remplacer immédiatement les gants. Si l’acrylamide n’est pas polymérisée, placer les matériaux contaminés dans un sac à déchets étiquetés polyacrylamide.
   NOTE : Prémélangée 40 % d’acrylamide contenant 38,67 % d’acrylamide et 1,33 % bis-acrylamide pour un monomère ratio réticulant de 29 : 1 a été utilisé dans le présent protocole.
   1. Pèsent 17 g de poudre TBE prémélangée. Peser les six parties distinctes de 70 g d’urée (total de 420 g).
      Remarque : L’urée doit être ajoutée en portions. Nous estimons qu’il est préférable de diviser en six portions.
   2. Mis en place un bécher en plastique 2 L sur une plaque de remuer. Ajouter un seul grand agitateur dans le bécher. Couvrir le bécher d’aluminium lorsque le mélange pour éviter les éclaboussures.
   3. Ajouter 500 mL de solution à 40 % d’acrylamide dans le bécher. Assurez-vous que la solution est remuant.
   4. Ajouter préalablement pesé sur TBE. Ajouter une aliquote de l’urée. Laisser la solution se mélanger. L’urée se dissout lentement et peut sembler flou et blanc lors de l’addition initiale. Ajouter lentement les aliquotes restantes d’urée dans le mélange pendant l’heure suivante. Laissez la solution mélanger jusqu'à ce qu’il est complètement transparent et incolore.
      Remarque : En général, autorise cela remuer du jour au lendemain. Si la solution n’est toujours pas dissoute, ajouter des petites parties aliquotes d’eau et attendez que l’urée dissoudre.
   5. L’addition d’urée augmentera le volume de près de 1 L. ajouter l’eau pour augmenter le volume à exactement 1 L.
   6. Store dans une bouteille de verre teinté de 1 L ou de la couverture de la bouteille en verre avec feuille d’aluminium.
2. Coulage de gel d’acrylamide.
   Remarque : Lorsque vous manipulez les plaques de verre, veillez à éviter tout contact entre les plaques de verre et toute surface dure. Ceci est particulièrement important en ce qu’une manipulation brusque peut provoquer de petites fissures dans le verre ; Ces fissures peuvent ne pas apparaître jusqu'à ce que le gel est en marche, qui se produit à une température plus élevée. Nous utilisons des bagues en liège pour prévenir ce contact indésirable.
   1. Clean plaques plaques de gel
      1. acquérir deux 33 x 42 cm, une encoche et une plaque encochée. Placer les plaques sur bagues en liège distinct.
      2. Plaques de rincer abondamment à l’eau et du savon. Assurez-vous qu’il n’y a pas de stries de savon ou gel taches laissées.
      3. Prenez note de quel côté des perles plaque moins d’eau. Ce côté est le gel face.
         Remarque : Si le gel est exécuté sur l’autre côté de la plaque, il peut faire le transfert de gel stimulant.
   2. Sécher les plaques
      1. utiliser des serviettes en papier pour sécher les deux faces de chaque plaque.
      2. Essuie-glaces de tâche délicate utilisation pour sécher les zones restantes. Accorder une attention particulière aux bords des plaques où s’appliqueront bande.
      3. Rincer les plaques de verre avec environ 70 % éthanol et essuyer à balai tâche.
      4. Assurez-vous qu’il n’y a aucun fibres de serviette de papier ou des gouttelettes d’eau. Ils peuvent entraîner des bulles lorsque vous versez le gel.
   3. Ajouter des cales d’espacement
      1. acquérir les entretoises de 0,75 mm. Exécuter des doigts gantés sous l’eau distillée et mouiller doucement les entretoises avec doigts gantés.
      Plaque
      2. entretoises Place le long des bords longitudinaux de l’encoche. Nettoyer l’eau qui est éclaboussée sur le reste des plaques. S’assurer que les entretoises sont alignés avec la plaque de verre et ne pas accroché sur le bord.
   4. Joint gel
      1. Mettez des gants secs. Sécher les bords du verre avec essuie-glaces délicate.
      2. Alignez la plaque encochée haut au-dessus de la plaque à encoche et lentement plue bas pour presser les plaques l’une sur l’autre. Vérifiez à nouveau pour s’assurer que les bords de toutes les plaques sont alignés.
      3. Bande d’à l’aide de gel, placer la bande dans l’ensemble de tous les bords à l’exception de la partie supérieure. Assurez-vous que le ruban est aligné uniformément et scellé hermétiquement. Ruban adhésif peut être appliqué en un seul mouvement, ou chaque côté peut être faite individuellement. Couper les extrémités de la bande avec un rasoir.
      4. Ajouter une couche de ruban vers le bas du gel. Le plus serré le tape, moins le gel fuira lorsqu’on verse.
      5. Clip les côtés du verre sandwich avec les pinces blanches. Ajouter 3 agrafes de chaque côté et 4 clips vers le bas.
   5. Verser le gel
      1. faire 3 mL de solution de persulfate d’ammonium 10 % (APS) en dissolvant le persulfate d’ammonium 0,3 g et diluer jusqu'à 3 mL dans de l’eau ultrapure.
         NOTE : 1,2 mL d’APS est nécessaire par gel. Après ce qui en fait la date le tube. Solution APS expire dans 2 semaines et doit être maintenue à 4 ° C.
      2. Transférer 125 µL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans un tube de microcentrifuge distinct.
         Remarque : Le TEMED est toxique ; porter les EPI tel que des gants, lunettes et lab enduire toute manipulation de.
      3. Acquérir un vaporisateur et supprimer l’entonnoir pointu. Mesurer 125 mL d’eau dans une éprouvette graduée et l’ajouter à la bouteille. Marquez le niveau d’eau à l’extérieur de la bouteille avec un marqueur permanent. Jeter l’eau. Cette mis à jour le vaporisateur peut être réutilisé indéfiniment avec un nettoyage correct (voir ci-dessous).
      4. Mis en place les anneaux bouchonnées près de l’évier donc il y a un endroit pour mettre le gel une fois qu’il est versé. Placez ici le "sandwich" de la plaque. Mettre un bouchon dans l’évier, donc il y a un endroit pour s’asseoir les plaques tandis que le gel est versé. Le gel sera versé dans le sandwich de plaque de verre selon un angle, donc bas reposera sur le Liège, tandis que la partie supérieure se reposera sur le bord de l’évier. Assurez-vous qu’il y a tampons sous ces zones en cas de polyacrylamide verse OFF
      Solution de
      5. Place APS et TEMED de l’autre côté de l’évier, avec le vide vaporisateur. Placez le peigne bien avec le nombre désiré de puits sur le côté de l’évier avec les plaques. Mettre 4 pinces à proximité.
         Remarque : La prochaine étape de la procédure est très sensible de temps. Soyez prêt à se déplacer rapidement à travers ces étapes. Il y a une quantité limitée de temps pour obtenir le mélange entre les plaques avant il polymérise. Tous les composants (micropipettes préréglées à volume correct, les solutions, les plaques de verre) sont soigneusement disposés à verser le gel aussi rapidement que possible. Si une polymérisation plus lente est souhaitée, les concentrations APS et TEMED peuvent être réduite de moitié ; Cependant, cela nécessitera un plus long temps de polymérisation.
      6. Verser la solution de gel de 20 % d’acrylamide dans le vaporisateur à ce repère. Verser la solution de gel un peu plus au-dessus de la ligne marquée, donc il y a suffisamment de solution dans le cas de petites fuites. Il s’agit d’environ 120 mL de solution de gel.
      7. Ajouter 120 µL de TEMED et 600 µL d’APS à la solution de gel de polyacrylamide dans le vaporisateur en même temps. Ajouter rapidement un supplémentaire de 600 µL de APS à la solution de gel de polyacrylamide.
      8. Cap rapidement le vaporisateur et tourbillon. Placez le "sandwich" de l’assiette dans l’évier.
      9. Commencer à couler. Cela ne devrait prendre 1-2 min afin d’éviter la polymérisation. Lentement, mais sûrement, augmenter la pression pour le vaporisateur pour la solution de gel sort uniformément. Si la solution commence éclaboussures irrégulièrement de la bouteille de squirt, libérer la pression afin que la bouteille devient gonflée et reprendre la coulée. Regarder pour s’assurer que la solution de gel est couvrant tous les domaines, et il ne coule pas de l’un des côtés. Pour enlever les bulles d’air, changer l’angle des plaques. Les bulles seront affiche en haut et il ira plus vite si l’angle est plus raide. Continuer de verser jusqu'à ce que la solution a atteint le sommet de la zone crantée et déborde légèrement le bord cranté. Enlever toutes les bulles d’air.
         Remarque : Si le sandwich plaque fuit, ou il n’y a pas assez solution de gel et la solution n’atteint pas le haut des plaques, le gel ne peut pas être utilisé. Attendez que le gel a polymérisé et nettoyer en conséquence.
      10. S’ajoute le peigne bien le "sandwich" de la plaque. Placer 4 pinces sur le peigne à enfoncer et à permettre une répartition égale des puits.
      11. Disposer rapidement de la solution de gel restant dans le vaporisateur en déchets de polyacrylamide étiquetées. Rincer dehors le vaporisateur avec DI l’eau 2 ou 3 fois, par le biais de la buse de squirt.
          Remarque : Il est important d’effectuer ce nettoyage rapidement pour empêcher l’obstruction dans le vaporisateur de polyacrylamide. En cas de même une petite quantité de polymérisation dans la buse, le prochain gel sera versé trop lentement et pas avec succès. Jeter le vaporisateur en cas de polymérisation.
3. En cours d’exécution le gel d’acrylamide
   1. tandis que le gel est être polymérisée, faire 1 x TBE tampon en cours d’exécution. Dissoudre le 17 g de solide prémélangée TBE dans 1 L d’eau ultrapure. Secouez tampon jusqu'à ce que tous TBE est dissoute.
   2. Enlever tous les clips de liant le sandwich plaque.
   3. Utiliser un rasoir pour couper le ruban adhésif et enlever le ruban sur tous les bords du sandwich plaque.
   4. Clean off tout le gel polymérisé de toutes surfaces vitrées. Utilisez un rasoir le long des bords pour gratter le gel restant. Essuyer les plaques avec du papier absorbant et de l’eau pour enlever les résidus de polyacrylamide autant que possible. Acrylamide excès et/ou ruban peut souvent brûler au cours de l’électrophorèse sur gel.
   5. Supprimer le peigne bien en le poussant uniformément sur les deux côtés.
   6. Utiliser un rasoir pour couper l’excès gel le long du dessus du sandwich plaque. Tranche le long du bord cranté de la plaque.
   7. Utiliser une seringue et l’eau distillée pour rincer les puits et enlever les débris dans les puits. Assurez-vous que chaque puits peut être rempli d’eau et n’est pas bloqué par excès de gel polymérisé.
   8. Placer le "sandwich" de la plaque dans l’appareil, de sorte que la plaque plus longue est dirigé vers l’extérieur et l’espace entaillé est vers l’intérieur.
   9. Ajout de clips à clipser la plaque de sandwich et aluminium avec les appareils. Ajouter à l’extérieur de la plaque pour promouvoir encore en cours d’exécution.
   Tampon TBE ajouter de
   10. pour couvrir les encoches de base et juste assez pour couvrir les puits en haut. Tampon TBE peut être filtré et réutilisé pour environ 5 gels.
   11. Assiettes chaudes pendant 20 min en exécutant l’électrophorèse de gel à 50 w.
   12. Après le réchauffement des plaques, nettoyer les puits. Utiliser une seringue et le tampon TBE dans les bains à injecter les sels tampons restants provenant des puits. Faire ce plusieurs fois afin d’assurer la propres puits. Si les puits ne sont pas propres, les bandes seront effilocher et l’image ne sera pas interprétable. Bien que cela peut prendre du temps, nous avons jugé indispensable à l’obtention de bonnes données.
   13. Vers la voie ultrapériphérique des deux côtés, ajouter 5 µL de 95 % formamide avec bleu de bromophénol. Il s’agit de la même solution que QBO, mais avec bromophénol bleu à la place de Orange G. Cela vous donnera un visuel sur l’endroit où couper le gel pour l’imagerie et dans quelle mesure l’ADN a exécuté.
   14. Pour chaque échantillon à analyser (générées dans la section 2.1.1), ajouter 3 µL dans un seul puits du gel. Après le chargement de tous les échantillons, attendre 1 min pour les échantillons de régler.
   15. Put caps sur le haut et le bas des baignoires en plastique. Attacher les fils à l’appareil. Le rouge indique la charge électrique positive, il devrait être en bas pour que l’ADN fonctionne vers le bas.
   16. Fils d’attacher à une puissance source, puis affectez-lui exécuter W. 50-55 le gel pendant environ 3 h ou jusqu'à ce que le bromophénol avant teinture bleue a exécuté au moins 2/3 vers le bas le gel.
4. Imaging le gel
   Remarque : ce gel est extrêmement mince et peut être difficile à gérer. Grande prudence doit être prise pour éviter déchirant et perte du gel tout.
   Remarque : selon l’étiquette de l’ADN, il peut nécessiter l’utilisation de gel de différents appareils d’imagerie. Ce protocole utilise des colorants fluorescents proche infrarouge et l’imagerie des échantillons a été réalisée sur un imageur de gel (voir Table des matières). Le protocole est écrit spécifiquement pour cet imageur.
   1. Lorsque l’avant du colorant bleu de bromophénol a exécuté au moins 2/3 vers le bas le gel (~ 28 cm), le gel peut être arrêté par mise hors tension. Retirer le gel de l’appareil et le déposer sur bagues en liège.
   2. Séparer les plaques avec un séparateur de plaque petit coin. Positionne la réglette à l’intérieur angle des encoches à tirer vers le haut. Soyez prudent et ne pas utiliser une force excessive ; les encoches peuvent se casser si trop de pression est appliquée.
   3. Une fois aspiration entre les plaques sont libérés, retirez la plaque supérieure soigneusement et déterminer quelle plaque le gel est sur. Si le gel colle sur la plaque inférieure, retirer la plaque supérieure et placer sur l’anneau en liège. Si le gel est sur la plaque supérieure étant levée, se déplacent lentement et le gel peut se replier à la plaque inférieure. Si le gel ne tombe pas, encore une fois se déplacer lentement tirer la partie restante du gel de la plaque de fond et placer la plaque supérieure avec le gel sur une plaque de Liège distinct.
   4. Une fois que les plaques sont séparées, voir où le colorant est sur le gel et retirer excès gel de haut et en bas du gel. En règle générale, avec nos constructions, en utilisant soit une amorce de nucléotide 18 ou 23 et un modèle de 45 nucléotides, il y a aucun ADN entre le front de colorant bleu de bromophénol et le bas du gel. Couper verticalement de la teinture à la partie supérieure du gel. Les espaces entre le colorant et les bords du gel n’ont également aucun ADN. Enfin, couper quelques pouces au-dessous de l’espace bien sur le gel. Il n’y a aucun acide nucléique tout en haut du gel.
      Remarque : Le gel dans la plus petite possible de la taille de coupe rend beaucoup plus facile à transférer sur l’appareil d’imagerie. Si le gel est trop grand, il est plus vulnérable aux déchirant lors du transfert. Tandis que nous avons souvent couper le gel avant l’imagerie, nous recommandons l’extrême prudence lors du taillage comme données pertinentes peuvent être perdues si on ne prend pas soin. Pour vérifier si supprimé certaines parties contiennent des données supplémentaires, nous allons souvent effectuer une analyse supplémentaire des parties du gel pour s’assurer qu’aucune donnée ont été perdues à l’excisées.
   5. Manteau le gel avec de l’eau pour éviter le dessèchement.
   6. Nettoyer la surface de l’imageur. À l’aide d’essuie-glaces de tâche, essuyer la surface avec l’eau et l’éthanol. Ajoutez une fine couche d’eau sur la surface où sera placé le gel.
   7. Transférer la partie voulue de gel à la surface mouillée de la Li-Cor.
   8. Remove air bulles par doucement en appuyant sur eux à partir du gel et essuyer avec un chiffon de la tâche. Soyez prudent car il est très facile d’extraire le gel en poussant les bulles d’air trop dur.
   9. Image du gel selon le fabricant ' protocoles de s. Analyser le gel à l’aide de logiciels disponibles pour l’imageur.
   10. Alors que le gel est étant imagé, nettoyer l’espace de travail en enlevant le gel d’acrylamide excès, vaisselle et filtrage le tampon TBE pour être réutilisée.

Representative Results

Une analyse sur gel de polyacrylamide réussie d’une caractérisation qualitative de l’activité globale (décrit dans la section 2.1, Figure 1) et de la cinétique de stationnaire (décrit dans la note à la fin de l’article 2.1, Figure 2) sont indiqués. Une analyse de l’échec sur gel de polyacrylamide est aussi indiquée (Figure 3).

Notez qu’aucune échelle disponible dans le commerce ou un marqueur moléculaire n’est utilisé. Occasionnellement, nous utiliserons une combinaison connue polymérase-substrat pour créer un marqueur moléculaire ; Cependant, il est important de noter que les différents nucléotides modifiés ont des mobilités électrophorétiques très différentes, en comparaison des oligonucléotides de la même longueur mais les différents nucléotides structure inappropriée.

Figure 1 : exemple d’analyse de gel de polyacrylamide réussie d’une caractérisation qualitative de l’activité globale. Notez que les bandes individuelles sont bien définis et réguliers. Les bandes représentent des oligonucléotides de différente longueur ; Ce gel permet une comparaison facile entre les polymérases. La voie de contrôle aucune enzyme n’est indiquée avec un «- ». L’activité est jugée par deux la longueur des produits et la portion de l’amorce marquée qui est converti en gros produits. De cette analyse, E6 et E5 sont les plus actifs. E3 et E2 sont approximativement égaux en activité, mais moins de E6 ou E5, et E4 et E1 sont les enzymes moins actives.

Figure 2 : exemple de gel réussie pour l’analyse quantitative à l’aide d’état d’équilibre cinétique. Notez que les bandes sont bien réglés et bien définis. Pour mesurer les constantes de vitesse de l’équilibre des différentes étapes de la synthèse d’oligonucléotides, une enzyme est incubée avec des quantités variables de nucléoside triphosphate (dans ce cas, dCTP) ; Notez que seules le n et (n + 1) produits sont synthétisés permettant la quantification de l’évènement singulier.

Figure 3 : exemple d’un gel sans succès pour l’activité globale. Le gel a été déchiré lors de la manipulation, résultant des lacunes visibles dans les bandes. Notez que les bandes de gel sont de forme irrégulière, ce qui rend difficile la quantification et l’analyse.

Discussion

Ici, nous avons décrit un test afin de caractériser la synthèse induite par l’ADN polymérase d’ADN monocaténaire. En utilisant des amorces ADN marqués de proche infrarouge et à électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant pour résoudre des oligonucléotides de différente tailles, nous pouvons obtenir résolution de nucléotide sur oligonucléotides, permettant une mesure précise de la synthèse. Ces approches peuvent servir à mesurer soit l’activité globale de l’enzyme (section 2.1) ou pour mesurer les paramètres de Michaelis-Menten des étapes individuelles (note qui suit étape 2.1). Notre laboratoire a récemment utilisé ces deux caractérisent les enzymes précédemment évolué⁹ ainsi que conçu rationnellement les enzymes¹⁰.

Nos tests décrits ici diffèrent des méthodes préalables à leur utilisation d’une étiquette d’ADN non radioactif. Historiquement, la radioactivité a été utilisée pour suivre la synthèse de l’ADN grâce à la haute sensibilité qui peut être obtenue à l’aide d’étiquettes de phosphore radioactif^11,18. Malheureusement, le coût élevé d’élimination ainsi que la durée de vie limitée des étiquettes radioactives peut faire l’utilisation d’étiquettes radioactives prohibitif. Nous décrivons ici l’utilisation du proche infrarouge fluorophore étiqueté d’ADN, qui ne souffre pas de ces inconvénients. Notamment, avec les colorants fluorescents proche-infrarouge, nous voyons les limites de détection similaires à l’ADN marqué radioactivement (résultats non publiés). Cependant, avec les colorants fluorescents dans le domaine du visible, nous n’étions pas en mesure d’observer les limites de détection similaires (résultats non publiés). Alors que notre groupe utilise généralement préparé commercialement ADN portant des fluorophores proche-infrarouge, ces colorants sont compatibles avec un certain nombre des chimies de modification établis post-synthèse 5' qui peut être utilisé pour installer ces étiquettes.

Proche infrarouge colorants fluorescents sont aussi avantageux qu’il y a plusieurs couleurs disponibles dans le commerce, qui peuvent permettre à des expériences plus complexes qui contrôlent la synthèse des deux oligonucléotides marqués dans une seule expérience. Avec des étiquettes radioactifs, ces types d’expériences à plusieurs composantes ne sont pas facilement exécutées. Cela permettra sans doute un certain nombre d’expériences plus complexes, en particulier pour des expériences de réplication orthogonale.

Ce test et n’importe quel dosage à l’aide de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturation, est principalement limitée par le défi technique de l’exécution de l’électrophorèse, le faible débit de ces expériences, ainsi que les gammes de taille réduite qui sont observables à résolution de nucléotide. Nous espérons que ce protocole détaillé permet à des groupes de surmonter les difficultés techniques de ces tests. Notamment, bien que le débit de l’essai est limité, l’utilisation d’étiquettes fluorescentes proche infrarouge augmente le débit, car il ne nécessite pas l’utilisateur de développer une autoradiogramme. Toutefois, le gel dure environ 4 à 6 h pour configurer et exécuter, en limitant le nombre d’expériences qui peuvent être exécutées par jour. La série limitée est causée par les capacités électrophorétiques de polyacrylamide. Pratiquement parlant, ces restrictions signifient que ces tests sont les meilleurs pour des questions de recherche ciblés qui nécessitent une résolution de nucléotide.

Récemment, un débit élevé de séquençage ADN¹⁹ a été utilisé plus en plus comme une méthode de caractérisation des ADN polymérases^20,21. Ces tests sont remarquables par leur débit considérablement accrue, qui permet à des questions plus larges, axées sur les préjugés de la séquence et les spectres de l’erreur. Ce qui est important, alors que le séquençage à haut débit permettent à de nombreuses expériences parallèles, il peut être difficile à interpréter de manière simple nucléotide. Ceci fournit une excellente occasion pour les tests d’enzyme employant l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide à combler les lacunes du séquençage à haut débit, veiller à ce que les méthodes décrites dans cet article sont pertinentes pour les années à venir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris HCl	Promega	H5123
Tris Base	Promega	H5131
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
Acetylated BSA	Promega	PR-R3961
KCl	Sigma	P4504
Dithiothreitol (i.e. DTT)	Research Products International	D11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution)	Sigma	03690-100mL
Glycerol	Sigma	G5516
Formamide	Acros	AC42374-5000
Orange G	Sigma Aldrich	O3756
Bromophenol blue	Fisher Scientific	50-701-6973
dNTPs	Fisher Scientific	FERR0191
M-dNTPs (riboNTPs)	Fisher Scientific	45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (all other modified NTPs)	TriLink Biotechnologies	assorted
primer 1	IDT DNA / TriLink Biotechnologies	Custom Syntheses	We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
template 1	IDT DNA / TriLink Biotechnologies	Custom Syntheses	We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
Acrylamide	Research Products International	A11405	38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide
Tris/Borate/EDTA (TBE) solid	Research Products International	T22020
Urea ultrapure	Research Products International	U20200
Gel tape	CBS Scientific	GT-72-10
Large white spring clamp polypropylene	CBS Scientific	GPC-0001
Ammonium persulfate (APS)	Fisher Scientific	BP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Fisher Scientific	BP15020
0.75 mm spacers	CBS Scientific	SGS-20-0740A
33x42 Notched Glass Plate Set	CBS Scientific	SGP33-040A
Wedge plate separator	CBS Scientific	WPS-100
Comb for gel electrophoresis	CBS Scientific	SG33-0734
Gel electrophoresis rig	CBS Scientific	SG-400-33
ultrapure water			we use a Milli-Q system from Millipore
DNA polymerases			we prepare these in our laboratory using published protocols.