Summary
Dit protocol beschrijft de karakterisatie van de polymerase van DNA synthese van gemodificeerd DNA door middel van observatie van wijzigingen in het nabij-infraroodspectrum fluorescently geëtiketteerde DNA met behulp van de Elektroforese van het gel en gel beeldvorming. Acrylamide gels worden gebruikt voor hoge resolutie beeldvorming van de scheiding van korte nucleic zuren, die op verschillende tarieven afhankelijk van grootte migreren.
Abstract
Voor elk enzym zijn robuuste, kwantitatieve methoden vereist voor de karakterisering van zowel inheemse als gemanipuleerde enzymen. Voor de polymerase van DNA, kan DNA-synthese worden gekarakteriseerd met behulp van een in vitro DNA synthese assay gevolgd door polyacrylamide gelelektroforese. Het doel van deze test is te kwantificeren synthese van zowel natuurlijke DNA en gemodificeerd DNA (M-DNA). Deze methoden zijn vooral handig voor het oplossen van oligonucleotides met één nucleotide resolutie, zodat de waarneming van afzonderlijke stappen tijdens enzymatische oligonucleotide synthese. Deze methoden zijn toegepast op de evaluatie van een serie van biochemische en biofysische eigenschappen zoals het meten van de stationaire toestand snelheidsconstanten van afzonderlijke stappen van de DNA-herstelsynthese, de foutmarge van de synthese van DNA en DNA bindende affiniteit. Bewerkt met behulp van componenten met inbegrip van, maar niet beperkt tot, gemodificeerde nucleoside trifosfaat (NTP), M-DNA en/of mutant polymerase van DNA, de relatieve nut van substraat-DNA-polymerase paren effectief kunnen worden geëvalueerd. Hier, detail we de bepaling zelf, met inbegrip van de wijzigingen die moeten worden verricht voor niet-traditionele primer DNA labeling strategieën zoals nabij-infrarood fluorescently label DNA. Bovendien, we beschikken over gedetailleerde essentiële technische stappen voor acrylamide gel gieten en uitgevoerd, die vaak kan technisch uitdagende.
Introduction
De polymerase van DNA uitvoeren van nauwkeurige en efficiënte DNA-synthese en zijn essentieel voor het behoud van de integriteit van het genoom. De mogelijkheid voor het synthetiseren van honderden nucleotiden per seconde zonder fouten maakt ook DNA polymerase essentiële gereedschappen in de moleculaire biologie en biotechnologie. Echter, deze eigenschappen beperken ook de toepassingen voor M-DNA substraten; in het algemeen, kunnen niet natuurlijke polymerase van DNA synthetiseren veel potentieel waardevolle M-DNA substraten, waarschijnlijk wegens naar de hoge selectieve druk tegen het gebruik van niet-standaard substraten in vivo. Vele groepen hebben ontwikkeld gerichte evolutie benaderingen voor het genereren van mutant DNA-polymerase staat M-DNA synthese1a,2,3,4,5; deze inspanningen hebben uitgebreid de biotechnologische nut van DNA6,7,8.
Voor de evaluatie van het vermogen van mutant DNA-polymerase te synthetiseren M-DNA, wij9,10, e.a.11,12,13 gebruiken meestal metingen in vitro van DNA polymeraseactiviteit, die worden beschreven in dit manuscript. In deze experimenten zijn de polymerase van DNA mede bebroede met een gelabelde primer/sjabloon dubbelzijdig en nucleoside trifosfaat substraten; de producten worden geëvalueerd door gelelektroforese. Afhankelijk van de specifieke vraag van de experimentele, mutant DNA-polymerase, gemodificeerde inleidingen, kunnen gewijzigde sjablonen of gemodificeerde nucleoside trifosfaat worden gebruikt, zodat de systematische biochemische evaluatie van de mutant enzymactiviteit.
Historisch, hebben deze tests vertrouwd op een 5' radioactieve-etiket voor het bijhouden van DNA-synthese; meestal, 32P en 33P gebruikt zijn; typisch, de etikettering wordt gerealiseerd via T4 polynucleotide kinase11. Echter, als gevolg van de beperkte levensduur en de relatief hoge kosten van radioactieve labels en hun veilige verwijdering, onze groep in plaats daarvan gebruikt een nabij-infrarood fluorophore synthetische 5' label van DNA. Met behulp van een relatief lage kosten nabij-infrarood gel imager, hebben we waargenomen soortgelijke detectiegrenzen om voorafgaande studies met radioactieve labels (niet-gepubliceerde resultaten). Wij hebben met succes gereproduceerd verleden opmerkingen9, en we hebben niet gezien eventuele grote kwantitatieve verschillen met de eerder gemeten snelheidsconstanten (niet-gepubliceerde resultaten).
Voor het analyseren van de grootte van DNA, en dus de omvang van de DNA-herstelsynthese, vertrouwen wij op polyacrylamide-gel elektroforese methoden oorspronkelijk ontwikkeld voor Sanger sequencing14 vóór de komst van capillaire elektroforese15. De afstand van de scheiding of mobiliteit kan worden gebruikt als een meting met molecuulgewicht; groot formaat, verticale polyacrylamide gels kunnen één nucleotide resolutie, inschakelen van kwantitatieve observatie van DNA oligonucleotides van verschillende lengtes bereiken.
Deze experimenten zijn collectief, een robuuste methode voor de karakterisering van de polymerase. Vanwege de tijd is gevoelige aard van de reacties, de voorbereiding en de zorg nodig om reproduceerbare resultaten. Verder, terwijl de acrylamide gel is een zeer effectieve manier om te meten van de DNA synthese, evenals vele andere DNA wijzigen reacties, met de resolutie van één nucleotide, kan het technisch uitdagende. Het protocol hier zal hopelijk kunnen gebruikers deze experimenten uitvoeren terwijl het vermijden van de meest voorkomende fouten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. activiteit Assay
Opmerking: er zijn twee typische soorten tests die vaak worden uitgevoerd om het karakteriseren van de polymerase van DNA die met behulp van de beschreven methoden hier. Ze verschillen in of ze kwalitatief karakteriseren algemene synthese (die vele stappen van DNA-synthese) of of zij kwantitatief gericht op individuele stappen. We beschrijven de nodige stappen voor elk van deze onderstaande.
Opmerking: Omdat de vergadering van materialen vrij complex voor tijd gevoelige experimenten zijn, raden we aan dat alle materialen vooraf worden geassembleerd. Hieronder staan de recepten van alle kritieke onderdelen van de test. Commerciële leveranciers voor onderdelen staan in de Tabel of Materials.
- 10 x recept van de Buffer van de SF (10 x SFB)
Opmerking: In onze tests, gebruiken we meestal het N-terminaal afkappen van de polymerase van DNA fragment I van aquaticus aquaticus, kortweg Stoffel (SF) 16 , 17. Het recept hier is de gewenste buffer voor SF 3 , 13. Andere buffers kunnen worden vervangen afhankelijk van de specifieke DNA-polymerase.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van de 10 x SF buffer componenten zijn 500 mM Tris pH 8,5, 65 mM MgCl 2, 0, 5 mg/mL BSA, 500 mM KCl (s), en ultrazuiver water. Metingen zijn voor 1 mL van SF buffer die voldoende is voor het testen van de 100-200, afhankelijk van de omvang. De buffer kan worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij-20 ° C.- Combineren 0,5 mL 1 M Tris, 65 µL van 1 M MgCl 2, 50 µL van 10 mg/mL BSA en 0.0373 g van KCl (s) in een 1,5 mL tube. Voeg 385 µL ultrazuiver water tot een eindvolume van 1 mL.
- 1 x recept van de Buffer van de opslag (1 x SB)
Opmerking: de uiteindelijke concentratie van de 1 x buffer componenten zijn 50 mM Tris pH 7.5, 1 mM DTT, 0.6 mM EDTA en 50% glycerol. Het recept is 20 mL 1 x SB.- 0.012 g DTT, 100 µL van het EDTA 0.5 M, combineren en vul een conische tube van 50 mL met 40 mL 100 mM Tris (pH 7.5) te maken 2xSB. Meng door vortexing.
- Pipetteer 10 mL van 2 x SB naar een nieuwe 50 mL conische buis en Verdun met glycerol door het toevoegen van 10 mL glycerol aan de nieuwe conische.
- Recept van de buffer oranje (QBO) van de Quenching
Opmerking: wanneer radioactieve labels worden gebruikt, gebruikers zullen vaak dienst bromophenol blauwe en/of xyleen cyanol als een tracking kleurstof voor elektroforese vooruitgang. Echter, deze kleurstoffen zwak fluoresceren in het nabij-infraroodspectrum regio, bemoeien met de DNA-signaal. Zo gebruiken we oranje G in plaats daarvan voor alle reacties die monsters bevatten. Terwijl we oranje G geschikt voor het bijhouden van gel laden hebben gevonden, hebben we gevonden oranje G minder consequent als een kleurstof die elektroforese vooruitgang sporen; dus lopen we lege rijstroken met bromophenol blauw op de externe rijstroken van de gel die geen monster bevatten om de voortgang van de gel.- Combineren 950 µL van 95% formamide met 25 µL van het EDTA 0.5 M en 25 µL ultrazuiver water. Voeg 1 bolletje van Oranje G kleurstof (~ 10 mg). Meng door vortexing.
Let op: Formamide is giftig; Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) zoals handschoenen, brillen en laboratoriumjas, en beschikken over als gevaarlijk afval.
- Combineren 950 µL van 95% formamide met 25 µL van het EDTA 0.5 M en 25 µL ultrazuiver water. Voeg 1 bolletje van Oranje G kleurstof (~ 10 mg). Meng door vortexing.
2. Assay Run
- kwalitatieve karakterisering van totale activiteit
Opmerking: voor deze test, we meestal handhaven constante concentratie van M-NTPs en variëren van tijd. Het doel is om te evalueren van de algemene kenmerken van de proteïne in plaats van voor het meten van elke individuele stap. Ter voorbereiding van een reactie, zal een gelijk volume van twee afzonderlijke onderdelen, de duplex mix (beschreven in stap 2.1.1) en de dNTP mix (beschreven in stap 2.1.2), worden afzonderlijk bereid en vervolgens gecombineerd om het uiteindelijke volume van 49 µL. De toevoeging van 1 µL 50 x enzym zal dan de reactie aangaan. Variabele punten kunnen worden genomen; typisch, doven we op 0, 5, 15 en 60 min.- Voorbereiding van DNA dubbelzijdig mix
Opmerking: de duplex mix bestaat uit 10 x SF buffer, primer oligonucleotide sjabloon oligonucleotide en ultrazuiver water. Totale volume toegevoegd aan elke reactie is 25 µL. 1 µL van enzym zal worden toegevoegd aan de basispagina mix onmiddellijk voorafgaand aan de opening van het experiment.
Opmerking: Voor onze tests, typisch gebruiken we een 45-mer-sjabloon en een 18-mer of 23-mer primer. Terwijl een aantal verschillende lengtes kan worden gebruikt, hebben we de neiging om te gebruiken zo lang omdat de producten (variërend van 18 nucleotiden aan 45 nucleotiden) gemakkelijk worden opgelost op een niveau van één nucleotide met behulp van de protocollen van de Elektroforese van het gel van de beschreven. Zoals oligonucleotide producten in de lengte stijgen, het kan problematisch zijn om te lossen van de producten op de resolutie van één nucleotide.
Opmerking: In onze experimenten, gebruiken wij een 5 ' nabij-infrarood fluorescente kleurstof etiket op het onderdeel van de primer te observeren de primer-producten. Wij kopen aangepaste samengestelde oligonucleotides, rekening houdend met deze wijziging; echter kan dit label worden opgenomen met behulp van een willekeurig aantal post synthetische labeling strategieën. De sjabloon oligonucleotide niet heet en dus is het niet waargenomen met behulp van de gel imager. Voor beide oligonucleotides, slaan we de oligonucleotides op 100 µM in 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
Opmerking: Omdat we alleen de primer observeren zijn, een twee-voudige overmaat van sjabloon wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat alle inleidingen (de DNA-soorten die is nageleefd) aan de sjabloon worden gegloeid. De duplex eindconcentratie in deze reactie is 40 nM.
Opmerking: Nabij-infrarood fluorescente kleurstoffen zijn vaak enigszins lichtgevoelig; indien mogelijk, bedek wij de primer (en geen oplossing met de primer) met folie. Dit omvat het polyacrylamidegel terwijl het draait.
Opmerking: Hieronder is een representatief voorbeeld van de synthese van 2 ' F M-DNA.- Primer 1 en sjabloon 1 verdunnen (Zie Tabel van materialen voor sequence) tot 1 µM in ultrazuiver water.
- Voor elke test reactie, in afzonderlijke buizen, combineren 5 µL van 10 x SF buffer, 2 µL 1 µM primer 1, 4 µL van 1 µM sjabloon 1 en 13 µL van ultrazuiver water in buizen compatibel met een thermische cycler.
- Anneal de duplex in een thermocycler met behulp van het volgende programma: 98 ° C gedurende 2 minuten, 70 ° C gedurende 5 min, 50 ° C gedurende 5 minuten, 40 ° C gedurende 5 min, houd bij 25 ° C. Het specifieke programma kan variëren afhankelijk van de onthardende temperatuur van de primer/sjabloon dubbelzijdig. Meestal wij verkiezen te omvatten ten minste één 5 min stap bij de onthardende temperatuur, en dan nog eens 5-min bij een temperatuur van 5-10 graden onder de onthardende temperatuur.
- Voorbereiding van 2 x dNTP mengsel
Opmerking: afhankelijk van het experiment, is het mogelijk om variabele dNTPs en concentraties van dNTPs te gebruiken. Meestal gebruiken we 50-200 µM in de reactie.- Voorbereiden een 25 µL oplossing met 100 µM van elk 2 ' F-NTP. Opslaan van de M-NTPs op 100 mM.
- Voorbereiding van 50 x eiwit verdunning
Opmerking: voor lange termijn opslag, enzymen dient te worden bewaard bij-20 ° C in 1xSB. Wanneer verwijderd uit de diepvries van-20 ° C, moeten enzymen worden gehouden op het ijs te allen tijde vóór toevoeging aan de master mix. Enzym verdunningen dienstig is vers van de geconcentreerde voorraad elke dag. De geconcentreerde enzym voorraad onmiddellijk na gebruik aan de vriezer van-20 ° C moet worden teruggegeven.
Opmerking: Omdat wij voornamelijk mutant DNA-polymerase worden geëvalueerd, we alleen gebruik enzymen die zijn geuit en gezuiverd in ons laboratorium met behulp van gevestigde methoden 9 , 10. Voor commercieel aangeschafte polymerase, gebruikers moeten op hun hoede voor optimale buffers voor verschillende eiwitten en de verenigbaarheid ervan met de hierin beschreven buffers.
Opmerking: De concentraties van het enzym zal verschillen voor elk experiment. Hier, laten we zien een representatief voorbeeld voor 2 ' F-DNA-herstelsynthese.- Te maken van een 10 nM enzym oplossing, verdund 1 µL van enzym into 1 x SB te maken van een concentratie van 50 x laatste enzym. De concentratie van de oplossing van 50 x moet 500 nM. Bijvoorbeeld, als de voorraad enzym concentratie 50 µM is, 1 µL voorraad enzym toevoegen aan 99 µL 1 x SB.
Opmerking: Aangezien het enzym meestal op 50% glycerol opgeslagen wordt, de oplossing is vrij viskeus. Zelfs als zeer nauwkeurige pipetten gebruikt, niet aangeraden pipetteren van minder dan 0,5 µL, gezien het belang van nauwkeurigheid en precisie tijdens enzym verdunning.
- Te maken van een 10 nM enzym oplossing, verdund 1 µL van enzym into 1 x SB te maken van een concentratie van 50 x laatste enzym. De concentratie van de oplossing van 50 x moet 500 nM. Bijvoorbeeld, als de voorraad enzym concentratie 50 µM is, 1 µL voorraad enzym toevoegen aan 99 µL 1 x SB.
- Inleiding van assay
- de temperatuur van een droge Bad instelt op 50 ° C.
- Toevoegen 24 µL van de ontharde duplex mix (zie stap 2.1.1) tot 25 µL van 2 x dNTPs (zie stap 2.1.2).
- Verwijderen 9,8 µL van het mengsel in stap 2.1.4.2 en toevoegen aan 20 µL van QBO (zie punt 1.3 voor recept). Deze hoeveelheid fungeert als een " geen enzym " controleren en moet worden verkregen voor elke run.
- Voeg 0.8 µL van 50 x enzym (zie stap 2.1.3.1) aan de duplex/dNTP mix. Pipetteer op en neer met een groot volume-micropipet te grondig mengen.
- Na 5, 15 en 60 min, doven de reactie door 10 µL van elke reactie-oplossing verwijderen en het toevoegen aan een microcentrifuge-buis met 20 µL QBO (beschreven in punt 1.3).
- Zodra uitgeblust, reacties kunnen worden opgeslagen onder folie voor onbepaalde tijd bij 4 ° C of -20 ° C.
Opmerking: Voor kwantitatieve karakterisering van individuele stappen van M-DNA-herstelsynthese, een zeer vergelijkbare test kan worden uitgevoerd voor kwantitatief Michaelis-Menten parameters. Deze test gebruikt alle van dezelfde materialen. Michaelis-Menten parameters kunnen worden gemeten voor de dNTP; in dit geval het belangrijkste verschil is dat, in plaats van de duplex mix aan dNTP mix toe te voegen, voegt de duplex mix met enzym aan een serie van 2 x dNTP oplossingen. Michaelis-Menten parameters kunnen ook worden gemeten voor DNA duplex. Specifieke voorwaarden moeten worden voldaan om te voldoen aan de aannames die nodig zijn om de Michaelis-Menten-vergelijking gebruiken. Deze voorwaarden en de fundamentele werking van de bepaling, worden goed uitgelegd in een vorige methoden artikel 11.
- Voorbereiding van DNA dubbelzijdig mix
3. Elektroforese van het gel
Opmerking: omdat de gel gieten tijdgevoelig is, alle materialen zijn vooraf gemonteerd. De recepten van alle cruciale componenten van de bepaling staan hieronder; leveranciers worden weergegeven in de Tabel of Materials.
- Acrylamide voorbereiden 20% acrylamide gel.
Opmerking: Dit recept maakt 1 L van acrylamide mengsel; ongeveer 120 mL van deze oplossing wordt gebruikt per gel. Bewaar deze oplossing bij kamertemperatuur onder folie voor maximaal één jaar.
Let op: Polyacrylamide is neurotoxisch. Het is belangrijk om het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas tijdens alle stappen van het gel gieten. Als polyacrylamide op de handschoenen krijgt, de handschoenen direct vervangen. Als acrylamide is niet polymeervorm, plaats de verontreinigde materialen in een afval zak van gelabelde polyacrylamide.
Opmerking: Voorgemengde 40% acrylamide met 38.67% acrylamide en 1,33% BIB-acrylamide voor een monomeer cross-linker/ratio van 29:1 werd gebruikt in dit protocol.- Weeg 17 g voorgemengde TBE poeder. Wegen van zes afzonderlijke gedeelten van 70 g ureum (totaal van 420 g).
Opmerking: De ureum moet worden toegevoegd in porties. Wij vinden dat het beste om het verdeeld in zes gedeelten. - Instellen in een plastic bekerglas van 2 L op een bord roer. Voeg een enkele grote roeren staaf aan het bekerglas. Dek het bekerglas af met folie als vermenging te voorkomen van spatten.
- Voeg toe 500 mL van 40% acrylamide-oplossing in het bekerglas. Zorg ervoor dat de oplossing is roeren.
- Toevoegen eerder woog-out FSME. Voeg een aliquoot gedeelte van het ureum. Toestaan oplossing te mengen. Ureum langzaam oplost en lijkt wazig en wit op de eerste toevoeging. Voeg langzaam de resterende aliquots van ureum in het mengsel over het komende uur worden uitgezonden. Laat de oplossing mengen totdat het is volslagen duidelijk en kleurloze.
Opmerking: Laten meestal 's nachts roer. Als de oplossing nog niet opgelost is, kleine porties water toevoegen en wacht tot de ureum te ontbinden. - De toevoeging van ureum verhoogt het volume dicht bij 1 L. Add water het volume op precies 1 L.
- Op te slaan in een 1 L getint glas fles of dekking de glazen fles met aluminiumfolie.
- Weeg 17 g voorgemengde TBE poeder. Wegen van zes afzonderlijke gedeelten van 70 g ureum (totaal van 420 g).
- Gieten van acrylamide gel.
Opmerking: Bij de behandeling van glasplaten, voorzichtig om contact tussen de glazen platen en een hard oppervlak te voorkomen. Dit is vooral belangrijk in dat stootje leiden kleine scheuren in het glas tot kan; deze scheuren mogelijk niet zichtbaar totdat de gel wordt uitgevoerd, die optreedt bij een hogere temperatuur. We gebruiken kurk ringen om te voorkomen dat deze ongewenste contactpersoon.- Clean platen
- ophaal twee 33 x 42 cm gel platen, één gekerfd en één unnotched plaat. Platen op aparte kurk ringen plaatsen.
- Rinse platen grondig met water en zeep. Zorg ervoor dat er zijn geen zeep strepen of gel vlekken achtergelaten.
- Noteer welke kant van de plaat kralen minder water. Deze kant is de gel kant geconfronteerd.
Opmerking: Als de gel wordt uitgevoerd aan de andere kant van de plaat, het mogelijk maken de gel-overdracht uitdagende.
- Droge platen
- Gebruik papieren handdoeken drogen van beide gezichten van elke plaat.
- De ruitenwissers van de delicate taak van het gebruik om te drogen van de overige gebieden. Bijzondere aandacht besteden aan de randen van platen waar tape aangerekend.
- Spoel de glasplaten met ~ 70% ethanol, en veeg met taak ruitenwissers.
- Zorg ervoor dat er geen handdoek papiervezels of water druppels. Deze bellen kunnen veroorzaken wanneer de gel gieten.
- Voeg spacers
- verwerven van 0,75 mm afstandhouders. Uitvoeren van gehandschoende vingers onder DI water en zachtjes nat de afstandhouders met gehandschoende vingers.
- Plaats spacers langs de lange randen van de ingekeepte plaat. Clean-up al het water dat het op de rest van de platen is gespat. Zorg ervoor dat spacers zijn afgestemd op de glasplaat en niet over de rand hangen.
- Zegel gel
- droge handschoenen zetten. Drogen de randen van het glas weer met delicate taak ruitenwissers.
- De unnotched plaat top boven de ingekeepte plaat, en langzaam lager in te drukken de platen tegen elkaar uitlijnen Selectievakje opnieuw om er zeker van te zijn dat de randen van alle platen zijn uitgelijnd.
- Gebruiken gel tape, plaats de tape over alle randen behalve de top. Zorg ervoor dat de tape is gelijkmatig uitgelijnd en strak verzegeld. Tape kan worden toegepast in één beweging, of elke zijde kan afzonderlijk worden gedaan. Snij de uiteinden van de tape met een scheermes.
- Toevoegen een extra laag van tape naar de onderkant van de gel. Hoe dichter de tape, hoe kleiner de kans de gel zal lekken wanneer gieten.
- Clip de zijkanten van de glas-sandwich met de witte klemmen. 3 clips aan weerskanten en 4 clips toevoegen aan de onderkant.
- Gieten de gel
- 3 mL 10% ammoniumnitraat persulfate oplossing (APS) maken door ontbinding van 0,3 g ammonium persulfate en verdunnen tot 3 mL in ultrazuiver water.
Opmerking: 1,2 mL van APS is per gel nodig. De buis na het maken van het heden. APS oplossing verloopt in 2 weken, en dient te worden bewaard bij 4 ° C. - Breng 125 µL van tetramethylethylenediamine (TEMED) tot een koker van afzonderlijke microcentrifuge.
Opmerking: TEMED is giftig; dragen van PPE zoals handschoenen, brillen en lab jas wanneer behandeling. - Verwerven een spuit fles en verwijder de trechter gepunte. Afmeten van 125 mL water in een gegradueerde cilinder en toevoegen aan de fles. Markeer het waterniveau aan de buitenkant van de fles met een permanent marker. Gooi het water. Deze gewijzigde spuit fles opnieuw kan worden gebruikt voor onbepaalde tijd met goede reiniging (zie hieronder).
- Instellen de kurk ringen naast de gootsteen, dus er een plek om te zetten van de gel is, zodra het wordt gegoten. Plaats hier de sandwich plaat. Zet een kurk in de gootsteen, zodat er een plek om te zitten van de platen is op, terwijl de gel is wordt gegoten. De gel zal worden gegoten in de sandwich plaat glas onder een hoek, zodat de bodem rusten op de kurk, zal terwijl de top op de rand van de gootsteen rusten zal. Zorg ervoor dat er pads onder deze gebieden in het geval dat polyacrylamide giet af De oplossing van de
- plaats APS en TEMED oplossing aan de andere kant van de gootsteen, met de lege spuit fles. Plaats de goed kam met het gewenste aantal putten aan de zijkant van de gootsteen met de platen. 4 klemmen in de buurt zetten.
Opmerking: De volgende stap in de procedure is zeer tijdgevoelig. Wees bereid om snel doorlopen van deze stappen. Er is een beperkte hoeveelheid tijd om het mengsel tussen de platen voordat het polymerizes. Alle onderdelen (micropipetten vooraf ingesteld op het juiste volume, oplossingen, glasplaten) zijn zorgvuldig gerangschikt om te gieten de gel zo snel mogelijk. Als er een langzamere polymerisatie gewenst is, APS en TEMED concentraties worden gehalveerd; Dit, echter, vergt een langere tijd van de polymerisatie. - Giet de 20% acrylamide gel oplossing in de fles spuiten op het gemarkeerde punt. Giet een beetje meer gel oplossing boven de duidelijke lijn, dus er genoeg oplossing in het geval van kleine lekken is. Dit is ongeveer 120 mL gel oplossing.
- Toevoegen 120 µL van TEMED en 600 µL van APS aan de oplossing van het polyacrylamidegel in de fles spuiten op hetzelfde moment. Een extra 600 µL van APS snel toe te voegen aan de oplossing van het polyacrylamidegel.
- Snel GLB de spuit fles en swirl. Plaats de sandwich plaat in de gootsteen.
- Beginnen gieten. Dit duurt slechts 1-2 min teneinde polymerisatie. Langzaam maar gestaag, toevoegen druk aan de fles spuiten zodat de gel oplossing gelijkmatig uit komt. Als de oplossing spatten onregelmatig uit de fles spuit begint, laat de druk dus de fles wordt opgeblazen en hervatten gieten. Horloge om ervoor te zorgen de gel-oplossing is die alle terreinen bestrijkt, en het lekt niet uit een van de zijkanten. Om luchtbellen te verwijderen, wijzigt u de hoek van de platen. De bubbles verschijnt bovenaan, en sneller wordt uitgevoerd als de hoek steiler is. Blijven gieten totdat de oplossing de bovenkant van het ingekeepte gebied heeft bereikt, en is enigszins overvolle de ingekeepte rand. Verwijder alle luchtbellen.
Opmerking: Als de sandwich plaat lekt, of er is niet genoeg gel-oplossing en de oplossing niet bereikt de top van de platen, de gel kan niet worden gebruikt. Wacht totdat de gel heeft polymeervorm en schoon dienovereenkomstig.
De goed kam toevoegen - aan de sandwich plaat. Plaats 4 klemmen op de kam om indrukken en zorgen voor gelijkmatige verdeling van de putten.
- Snel beschikken over de resterende gel-oplossing in de fles spuiten in gelabelde polyacrylamide afval. Spoel uit de fles spuit met DI water 2 - 3 keer, via de spuit-mondstuk.
Opmerking: Het is belangrijk om te voeren deze reiniging snel om te voorkomen dat polyacrylamide verstopping in de fles spuiten. Als zelfs een kleine hoeveelheid polymerisatie binnen het mondstuk optreedt, zal de volgende gel te langzaam en niet succesvol worden gegoten. Spuit fles negeren als polymerisatie optreedt.
- 3 mL 10% ammoniumnitraat persulfate oplossing (APS) maken door ontbinding van 0,3 g ammonium persulfate en verdunnen tot 3 mL in ultrazuiver water.
- Clean platen
- Runnen de acrylamide gel
- terwijl gel is wordt polymeervorm, 1 x TBE lopende buffer te maken. Los 17 g voorgemengde TBE solide in 1 L ultrazuiver water. Buffer schudden tot alle FSME is opgelost.
- Alle bindmiddel clips verwijderen uit de plaat sandwich.
- Gebruik van een scheermes te snijden van de tape en tape verwijderen van alle van de randen van de plaat sandwich.
- Clean uit alle de gepolymeriseerde gel uit het glas oppervlakken. Gebruik een scheermes langs de randen Schraap resterende gel. Veeg de platen met papieren handdoeken en water zo veel polyacrylamide residu mogelijk verwijderen. Overtollige acrylamide en/of band kan vaak branden tijdens gelelektroforese.
- Verwijderen van de goed kam door te duwen het gelijkmatig aan beide zijden.
- Gebruik een scheermes met het stopzetten van de overtollige gel langs de bovenkant van de plaat sandwich. Segment langs de ingekeepte rand van de plaat.
- Gebruiken een spuit en DI-water te spoelen van de putten en verwijderen van puin in de putjes. Zorg ervoor dat elk putje kan gevuld worden met water, en niet wordt geblokkeerd door overtollige gepolymeriseerde gel.
- Plaatst de sandwich plaat op het apparaat, zodat de langere plaat naar buiten kampt, en de ingekeepte ruimte is naar binnen gericht.
- Toevoegen clips aan de illustraties van de plaat sandwich en aluminium plaat samen met het apparaat. Toevoegen aan de buitenkant van de plaat om zelfs uitgevoerd.
- Toevoegen TBE buffer ter dekking van de basis inkepingen en net genoeg ter dekking van de putten aan de bovenkant. FSME buffer kan worden gefilterd en hergebruikt voor ongeveer 5 gels.
- Warme platen voor 20 min door het uitvoeren van de Elektroforese van het gel op 50 W.
- Na de opwarming van de platen, schoon de putten. Gebruik een spuit en de TBE-buffer in de Baden te spuiten de resterende buffer zouten uit de putten. Doe dit meerdere keren om schone wells. Als de putten niet schoon, zal de bands zullen rafelen en de afbeelding niet interpreteerbaar. Hoewel dit tijdrovend zijn kan, hebben we het noodzakelijk voor het verkrijgen van goede gegevens gevonden.
- Aan de buitenste rijstrook aan beide zijden, Pipetteer 5 µL van 95% formamide met bromophenol blauw. Dit is dezelfde oplossing als QBO, maar met bromophenol blauw in plaats van Oranje G. Dit zorgt voor een visueel over waar te snijden de gel voor beeldvorming, en hoe ver beneden het DNA heeft uitvoeren.
- Voor elk monster te worden geanalyseerd (gegenereerd in punt 2.1.1), 3 µL toevoegen aan een enkel putje van de gel. Wacht na het laden van alle monsters, 1 min. voor monsters om af te wikkelen.
- Put caps op zowel de boven- en onderkant kunststof Baden. Bevestig de draden aan het apparaat. Rood geeft aan dat de positieve elektrische lading, dus het moet aan de onderkant, zodat het DNA naar beneden loopt.
- Bijvoegen draden tot een bepaalde macht bron en ingesteld op 50-55 W. Run de gel voor ongeveer 3 h of tot de bromophenol blauwe kleurstof voorzijde heeft uitgevoerd ten minste 2/3 van de gel.
- De gel imaging
Opmerking: deze gel is extreem dun en kan moeilijk te behandelen. Grote voorzichtigheid moet worden genomen ter voorkoming van rippen en verlies van de hele gel.
Opmerking: afhankelijk van het DNA-label, het wellicht met behulp van verschillende gel imagers. Dit protocol maakt gebruik van nabij-infrarood fluorescente kleurstoffen en beeldvorming van monsters werd uitgevoerd op een gel imager (Zie Tabel van materialen). Het protocol is speciaal geschreven voor dat imager.- Als de bromophenol blauwe kleurstof voorzijde heeft uitvoert ten minste 2/3 van de gel (~ 28 cm), de gel kan worden gestopt door het uitschakelen van de macht. Verwijderen van de gel uit het apparaat en plaats op cork ringen.
- Scheiden de platen met een kleine wig-plaat scheidingsteken. Plaatst u het scheidingsteken aan de binnenkant hoek van de inkepingen aan het optrekken. Wees voorzichtig en gebruik niet buitensporig geweld; de inkepingen kunnen breken als te veel druk is uitgeoefend.
- Zodra afzuiging tussen de platen zijn vrijgegeven, zorgvuldig til de bovenplaat en bepalen welke plaat de gel is op. Als de gel op de bodemplaat stokken, bovenplaat Trek en plaats op cork ring. De gel is op de bovenste plaat wordt opgeheven, beweeg langzaam als de gel kan terugvallen op de bodemplaat. Als de gel niet valt, weer langzaam trek van het resterende deel van de gel van de bodemplaat en plaats de bovenste plaat met de gel op een aparte kurk ring.
- Zodra de platen worden gescheiden, zien waar de kleurstof is op de gel en verwijder overtollige gel van de boven- en onderkant van de gel. Met onze constructies, is met een 18 of 23 nucleotide primer en een 45 nucleotide-sjabloon, er meestal geen DNA tussen de bromophenol blauwe kleurstof voorkant en de onderkant van de gel. Afgesneden verticaal van de kleurstof naar de top van de gel. De ruimten tussen de kleurstof en de randen van de gel hebben ook geen DNA. Tot slot, snijd een paar duim onder de goed witruimte op de gel. Er zijn geen nucleïnezuren op de top van de gel.
Opmerking: Snijden van de gel in de kleinste mogelijke grootte maakt het aanzienlijk makkelijker om te dragen op het beeldapparaat. Als de gel te groot is, is het gevoeliger voor rippen tijdens de overdracht. Terwijl wij vaak de gel vóór imaging bijsnijden, raden we uiterste voorzichtigheid bij het trimmen zoals relevante gegevens kunnen verloren gaan als niet gezorgd is. Om te controleren of verwijderd gedeelten aanvullende gegevens bevatten, presteren we vaak een extra scan van de verwijderde delen van de gel om ervoor te zorgen dat er geen gegevens verloren waren. - Jas van de gel met water om te voorkomen dat uitdrogen.
- Reinigen van het oppervlak van de imager. Met behulp van taak ruitenwissers, veeg beneden het oppervlak met water en ethanol. Toevoegen van een dun laagje water aan het oppervlak waar de gel wordt geplaatst.
- Het gewenste gedeelte van de gel op het natte oppervlak van de Li-Cor. Transfer
- Verwijderen air bubbles door zachtjes te drukken hen uit uit de gel, en afvegen met de Wisser van een taak. Ga voorzichtig te werk als het heel gemakkelijk om te rippen van de gel door de luchtbellen te hard duwen.
- Image de gel volgens de fabrikant ' s protocollen. Analyseren van de gel gebruik van beschikbare software voor de imager.
- Terwijl de gel is een image wordt gemaakt, de werkomgeving schoon door het verwijderen van overtollige acrylamide gel, wassen van platen en filteren de TBE buffer opnieuw kunnen worden aangewend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een analyse van de succesvolle polyacrylamidegel van een kwalitatieve karakterisering van totale activiteit (beschreven in punt 2.1, Figuur 1) en steady-state kinetiek (beschreven in de notitie bij sluiting van onderafdeling 2.1, Figuur 2) worden weergegeven. Een mislukte polyacrylamidegel analyse blijkt ook (Figuur 3).
Merk op dat er geen commercieel beschikbare ladder of moleculaire marker is gebruikt. Af en toe, zullen wij een combinatie van bekende polymerase-substraat gebruiken om het maken van een moleculaire marker; het is echter belangrijk op te merken dat verschillende gemodificeerde nucleotiden zeer verschillende elektroforetische mobiliteiten hebben, waardoor vergelijking van oligonucleotides met dezelfde lengte maar met een verschillende structuur van de nucleotide ongepast.
Afbeelding 1: voorbeeld van succesvolle polyacrylamidegel analyse van een kwalitatieve karakterisering van totale activiteit. Merk op dat de individuele bands welomschreven en regelmatig zijn. De bands vertegenwoordigen oligonucleotides van verschillende lengte; Deze gel maakt eenvoudige vergelijking tussen polymerase. De controle geen enzym baan wordt aangegeven met een "-". Activiteit wordt beoordeeld door zowel de lengte van de producten en het gedeelte van de gelabelde primer die wordt geconverteerd naar grotere producten. Uit deze analyse zijn E6 en E5 het meest actief. E3 en E2 zijn ongeveer gelijk in activiteit, maar minder dan E6 of E5 en E4 en E1 zijn de minst actieve enzymen.
Figuur 2: voorbeeld van succesvolle gel voor kwantitatieve analyse met behulp van de steady-state kinetiek. Merk op dat de banden zijn goed opgelost en goed gedefinieerd. Voor het meten van stationaire snelheidsconstanten van individuele stappen in oligonucleotide synthese, is een enzym geïncubeerd met wisselende hoeveelheden nucleoside trifosfaat (in dit geval, dCTP); Merk op dat alleen de n en (n + 1) producten worden gesynthetiseerd inschakelen van kwantificering van het enkelvoud evenement.
Figuur 3: voorbeeld van een mislukte gel voor totale activiteit. De gel was verscheurd tijdens de behandeling, wat resulteert in zichtbaar hiaten in bands. Merk op dat de gel bands onregelmatig gevormde zijn, kwantificering en analyse bemoeilijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier, hebben wij beschreven een bepaling om het karakteriseren van de polymerase van DNA-gemedieerde synthese van M-DNA. Met behulp nabij-infrarood gelabelde inleidingen van DNA, en denatureren polyacrylamide gelelektroforese op te lossen van verschillend formaat oligonucleotides, kunnen we één nucleotide resolutie over oligonucleotides, waardoor nauwkeurige meting van synthese. Deze benaderingen kunnen worden gebruikt om te meten of de totale activiteit van het enzym (sectie 2.1) of voor het meten van de parameters van de Michaelis-Menten van afzonderlijke stappen (Let op volgende stap 2.1). Onze lab heeft onlangs gebruikt deze aan beide eerder ontwikkelde enzymen9 karakteriseren, alsmede rationeel ontworpen enzymen10.
Onze testen hier beschreven verschillen van voorafgaande methoden in hun gebruik van een niet-radioactieve DNA-label. Radioactiviteit is historisch, gebruikt voor het bijhouden van de synthese van DNA toe te schrijven aan de hoge gevoeligheid, die kan worden verkregen met behulp van radioactief fosfor etiketten11,18. Helaas, de hoge kosten van de vervreemding en de beperkte houdbaarheid van radioactieve labels kunnen gebruik maken van radioactieve labels onbetaalbaar. Hier beschrijven we het gebruik van nabij-infrarood fluorophore het label van DNA, die geen van deze nadelen Last. Met name met de nabij-infrarood fluorescente kleurstoffen zien we soortgelijke detectiegrenzen aan radioactief gelabelde DNA (niet-gepubliceerde resultaten). Met fluorescente kleurstoffen in het zichtbare bereik waren we echter niet kunnen vaststellen van soortgelijke detectiegrenzen (niet-gepubliceerde resultaten). Terwijl onze fractie meestal commercieel bereid DNA nabij-infrarood fluorophores rekening houdend met gebruikt, zijn deze kleurstoffen compatibel met een aantal gevestigde na synthese 5' wijziging chemicaliën die kunnen worden gebruikt voor het installeren van deze labels.
Nabij-infrarood fluorescente kleurstoffen zijn ook voordelig in dat er meerdere verkrijgbare kleuren, waardoor complexere experimenten opstelt die toezicht houden op synthese van twee gelabelde oligonucleotides in een enkele experiment kunnen. Met radioactieve labels, zijn deze soorten multicomponent experimenten niet gemakkelijk uitgevoerd. Dit zal waarschijnlijk een aantal complexere experimenten opstelt, met name voor orthogonale replicatie experimenten mogelijk.
Deze bepaling, en een kwantitatieve analyse met behulp van denatureren polyacrylamide gelelektroforese, wordt vooral beperkt door de technische uitdaging van het uitvoeren van de elektroforese, de lage doorvoer van deze experimenten, alsmede de beperkte omvang bereiken die waarneembaar op de resolutie van één nucleotide. Wij hopen dat dit gedetailleerde protocol mogelijk maakt groepen om de technische uitdagingen van deze tests te overwinnen. Met name, terwijl de doorvoer van de bepaling is beperken, verhoogt het gebruik van het nabij-infraroodspectrum fluorescerende etiketten de doorvoer, aangezien het niet vereist de gebruiker om te ontwikkelen een autoradiograph. De gel neemt echter nog ongeveer 4-6 h instellen en uitvoeren, beperking van het aantal experimenten die per dag kunnen worden uitgevoerd. Het beperkte bereik wordt veroorzaakt door de elektroforetische mogelijkheden van polyacrylamide. Praktisch gesproken, deze beperkingen betekenen dat deze tests zijn het beste voor gerichte onderzoeksvragen waarvoor één nucleotide resolutie.
Onlangs, heeft hoge doorvoer DNA sequencing19 steeds is gebruikt als een methode voor het karakteriseren van de DNA polymerase20,21. Deze testen zijn opmerkelijk voor hun dramatisch toegenomen doorvoer, waarmee ruimere vragen gericht op volgorde vooroordelen en fout spectra. Nog belangrijker is, terwijl de hoge doorvoer sequencing kunnen veel parallelle experimenten, kan het lastig zijn om te interpreteren op basis van één nucleotide. Dit biedt een fantastische kans voor enzym assays polyacrylamide gelelektroforese in dienst te vullen de leemten in de hoge doorvoer sequencing, ervoor te zorgen dat de in dit artikel beschreven methoden relevant voor vele jaren te komen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Research Corporation voor wetenschappelijke vooruitgang (Cottrell College Scholar Award #22548) en TriLink biotechnologie (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33x42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
