Summary
Denne protokollen beskriver karakterisering av DNA polymerase syntese av endrede DNA gjennom observasjon av endringer i nær-infrarøde fluorescently merket DNA bruker gel gelelektroforese og gel bildebehandling. Akrylamid gels brukes for høy oppløsning bildebehandling for separasjon av kort nucleic syrer, som migrerer til forskjellige priser avhengig av størrelse.
Abstract
For noen enzym kreves robust, kvantitative metoder for karakterisering av både native og utviklet enzymer. For DNA polymerases, kan DNA-syntese karakteriseres ved hjelp i vitro DNA syntese analysen etterfulgt av polyakrylamid gel geleelektroforese. Målet med denne analysen er å tallfeste syntese av både naturlige DNA og endret DNA (M-DNA). Disse metodene er særlig nyttig for å løse oligonucleotides med single nukleotid oppløsning, aktivere observasjon av individuelle trinnene under enzymatisk oligonucleotide syntese. Disse metodene er brukt til evalueringen av en rekke biokjemiske og Biofysiske egenskaper som måling av stabil rente konstantene i enkelttrinn i DNA-syntese, feilrate DNA-syntese og DNA forpliktende tilhørighet. Ved hjelp av endret komponenter, inkludert, men ikke begrenset til, endret nukleosid triphosphates (NTP), M-DNA og/eller mutant DNA polymerases, relativ nytten av underlaget-DNA polymerase par effektivt kan evalueres. Her detalj vi analysen, inkludert endringene som må gjøres for å imøtekomme utradisjonell primer DNA merking strategier som nær-infrarøde fluorescently merket DNA. I tillegg har vi detaljerte avgjørende tekniske tiltak for akrylamid gel helle og kjører, som ofte kan være teknisk utfordrende.
Introduction
DNA polymerases utføre nøyaktige og effektive DNA-syntese og er avgjørende for å opprettholde genomet integritet. Muligheten til å syntetisere hundrevis av nukleotider per sekund uten feil gjør også DNA polymerases viktige verktøy i molekylærbiologi og bioteknologi. Men begrense disse egenskapene også programmene for M-DNA underlag; Generelt naturlig DNA polymerases kan ikke syntetisere mange potensielt verdifulle M-DNA underlag, sannsynligvis skyldes høy selektivt press mot å bruke ikke-standard underlag i vivo. Mange grupper har utviklet regissert utvikling tilnærminger for å generere mutant DNA polymerases kan M-DNA syntese1,2,3,4,5; Dette arbeidet har utvidet bioteknologisk nytten av DNA6,7,8.
Å vurdere muligheten av mutant DNA polymerases å syntetisere M-DNA, vi9,10, og andre11,12,13 bruker vanligvis i vitro målinger av DNA polymerase aktivitet, som er beskrevet i dette manuskriptet. Disse eksperimentene er DNA polymerases co inkubert med merket primer/malen dobbeltsidig og nukleosid trifosfat underlag; produktene er evaluert av gel geleelektroforese. Avhengig av den spesifikke eksperimentelle spørsmål, mutant DNA polymerases, endret primere, kan endret maler eller modifisert nukleosid triphosphates brukes, aktivere systematisk biokjemiske evalueringen av mutant enzymaktiviteten.
Historisk har disse analyser stolt på en 5' radioaktivt etikett spore DNA-syntese; oftest har 32P og 33P blitt brukt; vanligvis er merking oppnådd ved hjelp av T4 polynucleotide kinase11. Men på grunn av begrenset levetid og relativt høye kostnader av radioaktivt etiketter og deres fjerning bruker vår gruppe i stedet en syntetisk 5' nær infrarød fluorophore merket DNA. Bruker en relativt lav kostnad nær infrarød gel imager, har vi observert lignende oppdagelsen grenser for tidligere studier med radioaktive etiketter (upubliserte resultater). Vi har vellykket reprodusert forbi observasjoner9, og vi har ikke observert noen store kvantitative forskjell med tidligere målt rate konstanter (upubliserte resultater).
Analysere størrelsen på DNA, og dermed omfanget av DNA-syntese, stole vi på polyakrylamid gel geleelektroforese metodene opprinnelig utviklet for Sanger sekvensering14 før kapillært geleelektroforese15. Avstand av separasjon eller mobilitet kan brukes som et mål på molekylvekt; stort format, loddrett polyakrylamid gels kan oppnå single nukleotid oppløsning, aktivere kvantitative observasjon av DNA oligonucleotides av varierende lengde.
Samlet er disse eksperimentene en robust metode for polymerase karakterisering. På grunn av tiden er følsomme natur reaksjoner, forberedelse og omsorg nødvendig for å oppnå reproduserbar resultater. Videre, mens akrylamid gel er en effektiv måte å måle DNA-syntese, samt mange andre DNA endring reaksjoner, med single nukleotid oppløsning, kan det være teknisk utfordrende. Protokollen her vil forhåpentligvis gi brukere utføre disse eksperimentene og unngå de vanligste feilene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. aktivitet analysen
Merk: det finnes to vanlige typer analyser som kjøres ofte for å karakterisere DNA polymerases bruke metodene som er beskrevet her. De forskjellige om preger de kvalitativt samlede syntese (omfatter mange skritt av DNA-syntese) eller om de kvantitativt fokusere på individuelle trinnene. Vi beskriver fremgangsmåten for hver av disse under.
Merk: Ettersom montering av materialer er relativt komplekse, for tiden følsom eksperimenter, anbefaler vi at alle materialer er samlet på forhånd. Oppskrifter på alle kritiske komponenter til analysen er listet nedenfor. Kommersielle leverandører for komponentene er oppført i Tabellen for materiale.
- 10 x SF Buffer oppskrift (10 x SFB)
Merk: I våre analyser, vi vanligvis bruker N-terminal trunkering av DNA polymerase fragmenter I Thermus aquaticus, kjent som Stoffel (SF) 16 , 17. Oppskriften her er foretrukket bufferen for SF 3 , 13. Andre buffere kan erstattes avhengig av den spesifikke DNA polymerase.
Merk: Den siste konsentrasjonen av 10 x SF buffer komponenter er 500 mM Tris pH 8.5, 65 mM MgCl 2, 0,5 mg/mL BSA, 500 mM KCl (s), og ultrapure vann. Målingene er for 1 mL av SF buffer, som er tilstrekkelig for 100-200 analyser, avhengig av skalaen. Bufferen kan lagres på ubestemt tid på 20 ° C.- Kombinerer 0,5 mL 1 M Tris, 65 µL av 1 M MgCl 2, 50 µL av 10 mg/mL BSA, og 0.0373 g KCl (s) i en 1,5 mL tube. Legge til 385 µL ultrapure vann for å nå et endelig antall 1 mL.
- 1 x lagring Buffer oppskrift (1 x SB)
Merk: siste konsentrasjonen av 1 x buffer komponenter er 50 mM Tris pH 7.5, 1 mM DTT, 0.6 mM EDTA og 50% glyserol. Oppskriften gjør 20 mL 1 x SB.- Kombinerer 0.012 g DTT, 100 µL av 0,5 M EDTA, og fyll en 50 mL konisk tube med 40 mL 100 mM Tris (pH 7.5) å gjøre 2xSB. Blanding av vortexing.
- Overfør 10 mL av 2 x SB en ny 50 mL konisk rør og fortynn med glyserol ved å legge 10 mL glyserol til den nye konisk.
- Quenching buffer oransje (QBO) oppskrift
Merk: Når radioaktivt etiketter brukes, brukere vil ofte ansette bromophenol blå og/eller xylen cyanol som en sporing farge for geleelektroforese fremgang. Men disse fargestoffer vil i svakt fluoresce i nær-infrarøde regionen, forstyrre DNA signalet. Derfor bruker vi Orange G i stedet for alle reaksjoner som inneholder eksempler. Mens vi har funnet Orange G å være egnet for sporing gel lasting, har vi funnet Orange G være mindre konsekvente som et fargestoff som sporer geleelektroforese fremdrift; Derfor kjører vi tom baner som inneholder bromophenol blå på de eksterne banene av gel som ikke inneholder utvalg for å spore gel.- Kombinerer 950 µL av 95% formamide med 25 µL av 0,5 M EDTA, og 25 µL ultrapure vann. Legg 1 scoop av oransje G fargestoff (~ 10 mg). Blanding av vortexing.
FORSIKTIG: Formamide er giftig; Bruk personlig verneutstyr (PVU) som hansker, briller og Laboratoriefrakk og kast som spesialavfall.
- Kombinerer 950 µL av 95% formamide med 25 µL av 0,5 M EDTA, og 25 µL ultrapure vann. Legg 1 scoop av oransje G fargestoff (~ 10 mg). Blanding av vortexing.
2. Analysen kjøre
- kvalitativ karakteristikk av totale aktiviteten
Merk: For denne analysen, vi vanligvis opprettholde konstant konsentrasjonen av M-NTPs og variere tid. Målet er å vurdere den generelle kjennetegn ved protein, i stedet for å måle noen trinn. For å forberede en reaksjon, vil en like volum av to separate komponenter, dobbeltsidig mix (beskrevet i trinn 2.1.1) og dNTP mix (beskrevet i trinn 2.1.2), være forberedt separat, og deretter kombineres for å gi det siste bindet 49 µL. Tillegg av 1 µL 50 x enzym deretter starte reaksjonen. Variabel tidspunkt kan tas; vanligvis slukke vi på 0, 5, 15 og 60 min.- Forberedelse av DNA dobbeltsidig blanding
Merk: duplex mix består av 10 x SF buffer, primer oligonucleotide, mal oligonucleotide og ultrapure vann. Totalvolum lagt til hver reaksjon er 25 µL. 1 µL av enzym legges til master mix forut for initiering av eksperimentet.
Merk: For våre analyser, vi vanligvis bruker en 45-mer og en 18-mer eller 23-mer primer. Mens en rekke forskjellige lengder kan brukes, pleier vi å bruke denne lengden fordi produkter (alt fra 18 nukleotider til 45 nukleotider) lett løses på single nukleotid nivå ved hjelp av beskrevet gel geleelektroforese protokoller. Som oligonucleotide produkter øker i lengde, det kan være utfordrende for å løse produktene single nukleotid oppløsning.
Merk: I våre eksperimenter, bruker vi en 5 ' nær infrarød fluorescerende fargestoff etiketten på primer strand å observere primer produktene. Vi kjøper egendefinerte syntetisk oligonucleotides bærer denne endringen; men kan denne etiketten innlemmes vilkårlig antall nye syntetiske merking strategier. Mal-oligonucleotide er ikke merket, og så det ikke observert bruker gel imager. For begge oligonucleotides, vi lagrer oligonucleotides på 100 µM i 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
Merk: Fordi vi observerer bare primer, brukes en todelt overskudd av malen slik at alle primere (DNA-arter som blir observert) er herdet i malen. Siste dobbeltsidig konsentrasjonen i denne reaksjonen er 40 nM.
Merk: Nær infrarød fluorescerende fargestoffer er ofte noe lysfølsom; Når vi dekker primer (og en løsning som inneholder primer) med folie. Dette inkluderer polyakrylamid gel mens den kjører.
Merk: Nedenfor er et representativt eksempel på syntese av 2 ' F M-DNA.- Fortynne primer 1 og mal 1 (se Tabell for materiale for forløp) til 1 µM hver i ultrapure vann.
- For hver analysen reaksjon, i separate rør, kombinere 5 µL av 10 x SF buffer, 2 µL av 1 µM primer 1, 4 µL av 1 µM mal 1 og 13 µL ultrapure vann i rør kompatibel med en termisk cycler.
- Anneal duplex i en thermocycler med følgende program: 98 ° C i 2 minutter, 70 ° C i 5 minutter, 50 ° C i 5 min, 40 ° C i 5 min, holde på 25 ° C. Bestemte programmet kan variere etter annealing temperaturen på primer/malen dobbeltsidig. Vanligvis vi foretrekker å ta minst en 5 min trinn ved annealing temperatur, og en 5-min ved en temperatur 5-10 grader under annealing temperaturen.
- Utarbeidelse av 2 x dNTP blanding
Merk: avhengig av eksperimentet, er det mulig å bruke variabelen dNTPs og konsentrasjonen av dNTPs. Vi bruker vanligvis 50-200 µM i reaksjonen.- Forberede en 25 µL løsning som inneholder 100 µM hver 2 ' F-NTP. Lagre M-NTPs på 100 mM.
- Utarbeidelse av 50 x protein fortynning
Merk: For langtidslagring, enzymer bør holdes på 20 ° C i 1xSB. Når fjernet fra 20 ° C fryseren, bør enzymer holdes på is til enhver tid før tillegg til master mix. Enzym fortynninger bør gjøres frisk fra konsentrert lager hver dag. Konsentrert enzym aksjen skal returneres til 20 ° C fryseren straks etter bruk.
Merk: Fordi vi evaluere primært mutant DNA polymerases, vi bare bruke enzymer som er uttrykt og renset i vårt laboratorium med etablerte metoder 9 , 10. Kjøpt kommersielt polymerases, brukere bør være forsiktig med optimal bufferne for ulike proteiner og deres kompatibilitet med bufferne beskrevet heri.
Merk: Enzym konsentrasjonene varierer for hvert eksperiment. Her viser vi et representativt eksempel 2 ' F-DNA-syntese.- å lage en 10 nM enzym løsning, fortynne 1 µL av enzym into 1 x SB å gjøre en 50 x siste enzym konsentrasjon. Konsentrasjonen av 50 x løsningen skal være 500 nM. For eksempel hvis lager enzym konsentrasjonen er 50 µM, Legg 1 µL lager enzymet til 99 µL 1 x SB.
Merk: Siden enzymet er vanligvis lagret i 50% glyserol, løsningen er ganske tyktflytende. Selv om bruker svært nøyaktig Pipetter, anbefaler vi ikke pipettering mindre enn 0,5 µL, vurderer betydningen av nøyaktighet og presisjon under enzym fortynning.
- å lage en 10 nM enzym løsning, fortynne 1 µL av enzym into 1 x SB å gjøre en 50 x siste enzym konsentrasjon. Konsentrasjonen av 50 x løsningen skal være 500 nM. For eksempel hvis lager enzym konsentrasjonen er 50 µM, Legg 1 µL lager enzymet til 99 µL 1 x SB.
- Initiering av analysen
- satt temperaturen på et tørt bad til 50 ° C.
- Legge til 24 µL av glødet duplex blande (se trinn 2.1.1) til 25 µL av 2 x dNTPs (se trinn 2.1.2).
- Fjerne 9.8 µL av blandingen i trinn 2.1.4.2 og legge til 20 µL av QBO (se avsnitt 1.3 for oppskriften). Denne aliquot fungerer som en " ingen enzymet " kontroll og kan skaffes for hver kjøring.
- Legge til 0,8 µL av 50 x enzym (se trinn 2.1.3.1) til dupleks/dNTP mix. Pipetter opp og ned med stort volum brønnene grundig blande.
- Etter 5, 15 og 60 min, slukke reaksjonen ved å fjerne 10 µL av hver reaksjon-løsning og legge til et microcentrifuge rør som inneholder 20 µL QBO (beskrevet i delen 1.3).
- Når slukket, reaksjoner kan lagres under folie på ubestemt tid på 4 ° C eller -20 ° C.
Merk: For kvantitative karakterisering av enkelttrinn i M-DNA-syntese, en svært lik analysen kan kjøres kvantitativt hente Michaelis-Menten parametere. Denne analysen bruker alle det samme materialet. Michaelis-Menten parametere kan måles for dNTP; i dette tilfellet den viktigste forskjellen er at i stedet legge dobbeltsidig blandingen til dNTP blanding, det legger dobbeltsidig blandingen med enzymet til en rekke 2 x dNTP løsninger. Tilsvarende kan Michaelis-Menten parametere måles for DNA tosidig. Bestemte betingelser må være oppfylt for å tilfredsstille forutsetningene for å bruke Michaelis-Menten ligningen. Disse forholdene og grunnleggende mekanikken i analysen, er godt forklart i en tidligere metoder artikkel 11.
- Forberedelse av DNA dobbeltsidig blanding
3. Gel geleelektroforese
Merk: helle gel er tidsavhengig, alle materialer er samlet på forhånd. Oppskrifter på alle kritiske komponenter til analysen er oppført nedenfor. leverandører er oppført i Tabellen for materiale.
- Forbereder akrylamid 20% akrylamid gel.
Merk: Denne oppskriften gir 1 L akrylamid blanding; ca 120 mL løsningen brukes per gel. Lagre denne løsningen ved romtemperatur under folie for opptil ett år.
FORSIKTIG: Polyakrylamid er nevrotoksiske. Det er viktig å bruke hansker og en labfrakk i alle trinnene i gel pouring. Hvis polyakrylamid får på hansker, erstatte hansker umiddelbart. Hvis akrylamid ikke er polymerized, setter forurenset materialet i en merket polyakrylamid avfall bag.
Merk: Ferdigblandet 40% akrylamid som inneholder 38.67% akrylamid og 1,33% bis-akrylamid for en monomer kryss-linker forhold av 29:1 ble brukt i denne protokollen.- Veier 17 g ferdigblandet TBE pulver. Veie seks separate deler av 70 g av urea (totalt 420 g).
Merk: Urea må legges i deler. Vi finner det best å dele den inn i seks deler. - Satt opp en 2 L plast kanne på en rør-plate. Legge til en enkelt stor gripende stang begeret. Dekke begeret med folie når blanding for å hindre spruting.
- Legge til 500 mL 40% akrylamid løsning i kanne. Kontroller at løsningen er røring.
- Legg til tidligere veide ut TBE. Legge til en aliquot av urea. Tillate løsning å blande. Urea oppløser sakte og vises disig og hvit på første tillegg. Sakte legge de resterende dele urea i blandingen over den neste timen. La løsningen bland til det er helt klart og fargeløs.
Merk: Vanligvis Tillat dette å røre over natten. Hvis løsningen ikke er fortsatt oppløst, legger lite dele vann og vente på urea å oppløse. - Tillegg av urea vil øke volumet nær 1 L. legge til vann for å øke volumet til nøyaktig 1 L.
- Butikk i en 1 L farget glassflaske eller dekke glassflaske med aluminiumsfolie.
- Veier 17 g ferdigblandet TBE pulver. Veie seks separate deler av 70 g av urea (totalt 420 g).
- Strømmer av akrylamid gel.
Merk: Ved håndtering av glassplater, være forsiktig for å unngå kontakt mellom glassplater og noen hard overflate. Dette er spesielt viktig at uforsiktig håndtering kan forårsake små sprekker i glasset; disse sprekk kan ikke være synlige før gel kjører som oppstår på en høyere temperatur. Vi bruker cork ringer for å forhindre denne uønsket kontakt.- Clean plater
- anskaffe to 33 cm x 42 cm gel plater, ett hakk og en unnotched plate. Plassere plater på separate cork ringer.
- Plater skyll grundig med såpe og vann. Kontroller at det er ingen såpe striper eller gel flekker igjen.
- Noter hvilken side av platen perler mindre vann. Denne siden er gel mot siden.
Merk: Hvis gel kjøres på den andre siden av tallerkenen, kan det være gel overføring utfordrende.
- Tørr plater
- bruke papirhåndklær tørke både ansikter av hver plate.
- Bruk delikate oppgaven vindusviskere tørke gjenværende områdene. Vær spesielt oppmerksom på kantene av plater der tape brukes.
- Skyll glassplater med ~ 70% etanol, og tørk med oppgaven vindusviskere.
- Kontroller at det er ingen papirfibre håndkle eller vanndråper. Disse kan forårsake bobler når helle gel.
- Legge avstandsklosser
- kjøpe 0,75 mm avstandsstykker. Kjøre hansker fingrene under DI vann og forsiktig våt avstandsstykkene med hansker fingre.
- Sted avstandsstykker langs langsiden av det hakk plate. Rydde opp alle vann det er sprutet på resten av platene. Kontroller at avstandsstykker justeres med glassplaten og ikke henger over kanten.
- Forsegle gel
- satt på tørr hansker. Tørr kantene av glasset igjen med delikate oppgaven vindusviskere.
- Justerer unnotched platen topp over hakk plate, og sakte lavere ned å trykke platene mot hverandre. Avmerkingsboksen igjen for å være sikker på at kantene på alle platene er justert.
- Bruke gel tape, plassere tape på alle kanter bortsett fra toppen. Kontroller er justert jevnt og forseglet tett. Båndet kan brukes i én bevegelse, eller hver side kan gjøres individuelt. Skjær endene av båndet med en barberhøvel.
- Legge til et ekstra lag av tape til bunnen av gel. Gel vil lekke strammere tape, jo mindre sannsynlig og helle.
- Klipp sidene av glasset sandwich med de hvite klemmer. Legge til 3 klipp på hver side og 4 klipp nederst.
- Helle gel
- gjøre 3 mL 10% ammonium persulfate løsning (APS) ved oppløsning 0,3 g ammonium persulfate og fortynne opptil 3 mL i ultrapure vann.
Merk: 1,2 mL APS er nødvendig per gel. Dato røret etter den. APS løsning utløper i 2 uker, og bør holdes på 4 ° C. - Overføre 125 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) til en separat microcentrifuge tube.
Merk: TEMED er giftig; bruke PPE som hansker, briller og lab coat når håndtering. - Kjøpe en sprøyting flasken og fjerne spisse trakten. Måle ut 125 mL vann i en uteksaminert sylinder og legge til flasken. Merk vannstanden på utsiden av flasken med en permanent penn. Kast vannet. Denne endrede sprøyting flasken kan gjenbrukes på ubestemt tid med riktig rengjøring (se nedenfor).
- Definere korket ringene ved siden av vasken så det er et sted å sette gel når den helles. Plass platen sandwich her. Sette en kork i vasken, så det er et sted å sitte platene på mens gel helles. Gel skal bli lagt i glass plate sandwich i en vinkel, slik at bunnen vil hvile på korken mens de hvile på kanten av vasken. Kontroller at det er pads under disse områdene i tilfelle polyakrylamid øser av
- Sted APS løsning og TEMED løsning på den andre siden av vasken, med tomme sprøyting flasken. Plass det godt kam med ønsket antall brønner på siden av vasken med plater. Sette 4 klemmer nærliggende.
Merk: Det neste trinnet i prosedyren er veldig tidsavhengig. Vær forberedt på å flytte raskt gjennom disse trinnene. Det er en begrenset mengde tid å få blandingen mellom platene før det polymerizes. Alle komponenter (Mikropipetter forhåndsinnstilt til riktig volum, løsninger, glassplater) arrangeres nøye å helle gel så raskt som mulig. Hvis en tregere polymerisasjon er ønskelig, APS og TEMED konsentrasjoner kan halveres; Dette vil imidlertid kreve lengre polymerisasjon tid. - Hell 20% akrylamid gel løsningen i sprøyting flasken til et markert punkt. Hell litt mer gel løsning over merkede linjen, så det er nok løsning når det gjelder små lekkasjer. Dette er omtrent 120 mL gel løsning.
- Legge til 120 µL TEMED og 600 µL av APS polyakrylamid gel løsningen i sprøyting flasken samtidig. Raskt legge til en ekstra 600 µL av APS polyakrylamid gel løsningen.
- Cap raskt sprøyting flasken og virvel. Plasser platen sandwich i vasken.
- Begynner å strømme. Dette tar bare 1-2 min for å unngå polymerisasjon. Sakte, men jevnt, legge press til sprøyting flasken gel løsningen kommer jevnt. Hvis løsningen starter sprut uregelmessig fra sprøyting flasken, slippe presset så flasken blir oppblåst og gjenoppta pouring. Se gel løsningen dekker alle områder, og det ikke lekker fra noen av sidene. For å fjerne luftbobler, endre platene. Boblene vil komme på toppen, og vil kjøre raskere hvis vinkelen er brattere. Fortsatt strømme til løsningen har nådd toppen av hakk området, og er litt overfylte hakk kanten. Fjerne alle luftbobler.
Merk: Hvis platen sandwich lekker, eller det er ikke nok gel løsning og løsningen ikke nå toppen av platene, gel kan ikke brukes. Vent til gel har polymerized, og rengjør tilsvarende. - Legge til godt kammen plate sandwich. Sted 4 klemmer på kammen for å trykke ned og la for jevn fordeling av brønnene.
- Raskt kast gjenværende gel løsningen i sprøyting flasken i merket polyakrylamid avfall. Skyll ut sprøyting flasken med DI vann 2 - 3 ganger, gjennom sprut munnstykket.
Merk: Det er viktig å utføre denne rengjøring raskt for å hindre at polyakrylamid tilstopping i sprøyting flasken. Hvis selv en liten mengde polymerisasjon forekommer i munnstykket, skal neste gel helles for sakte og ikke vellykket. Forkaste sprøyting flasken hvis polymerisasjon forekommer.
- gjøre 3 mL 10% ammonium persulfate løsning (APS) ved oppløsning 0,3 g ammonium persulfate og fortynne opptil 3 mL i ultrapure vann.
- Clean plater
- Kjører akrylamid gel
- mens gel er å være polymerized, gjør 1 x TBE kjører buffer. Oppløses 17 g ferdigblandet TBE solid i 1 L ultrapure vann. Rist buffer til alle TBE oppløses.
- Fjerne alle bindemiddel klipp fra platen sandwich.
- Bruker en barberhøvel klippe båndet og fjerne tapen fra alle kanter av platen sandwich.
- Rene av alle polymerized gel fra glass overflater. Bruk en barberhøvel langs kantene for å skrape av gjenværende gelé. Tørk platene med papirhåndklær og vann for å fjerne så mye polyakrylamid rester som mulig. Overflødig akrylamid og/eller tape kan ofte brenne under gel geleelektroforese.
- Fjerne godt kammen ved å skyve det ut jevnt på begge sider.
- Bruker en barberhøvel for å kutte av overflødig gel langs toppen av platen sandwich. Skive langs hakk kanten av tallerkenen.
- Bruker en sprøyte og DI vann til skyll brønnene og fjerne rusk i brønnene. Kontroller hver brønn kan fylles med vann, og ikke blokkeres av overflødig polymerized gel.
- Plasser platen sandwich i apparatet, slik at lengre platen vender utover, og feltet hakk vender innover.
- Legg til utklipp utklipp plate sandwich og aluminium plate med apparatet. Legge til utsiden av platen til fremme selv kjører.
- Legge til TBE buffer base hakkene og akkurat nok til å dekke brønnene på toppen. TBE bufferen kan filtreres og gjenbrukes for ca 5 gels.
- Varme tallerkener for 20 min ved å kjøre gel geleelektroforese 50 W.
- Etter oppvarming platene, ren brønnene. Bruk en sprøyte og TBE bufferen i bad for å sprute gjenværende buffer salter fra brønnene. Gjør dette flere ganger for å sikre feilfri brønner. Hvis brønnene ikke er rent, band vil fray og bildet vil ikke bli interpretable. Selv om dette kan være tidkrevende, vi har funnet det viktig å få gode data.
- Til ytterste veibane på begge sider, Pipetter 5 µL av 95% formamide med bromophenol blå. Dette er den samme løsningen som QBO, men bromophenol blå i stedet for oransje G. Dette vil gi en visuell på hvor du skal klippe gel for bildebehandling, og hvor langt ned DNA har kjørt.
- For hvert utvalg skal analyseres (generert i Seksjon 2.1.1), tilsett 3 µL en enkelt brønn av gel. Etter lasting alle prøver, vente 1 min for prøver å avgjøre.
- Sette caps på både toppen og bunnen plast bad. Koble ledninger til apparatet. Rødt betyr positiv elektrisk ladning, så det burde være på bunnen slik at DNA kjører nedover.
- Fest ledninger til en makt kilde og satt til 50-55 W. Run gel for ca 3 timer eller til bromophenol blå farge foran har kjørt minst 2/3 ned gel.
- Imaging gel
Merk: denne gel er svært tynn og kan være vanskelig å håndtere. Stor forsiktighet må være tatt å forhindre ripping og tap av hele gel.
Merk: avhengig av DNA etiketten, det kan kreve bruke forskjellige gel imagers. Denne protokollen bruker nær infrarød fluorescerende fargestoffer og bildebehandling av prøver ble utført på en gel imager (se Tabell for materiale). Protokollen er spesielt skrevet for at imager.- Når bromophenol blå farge foran har kjørt minst 2/3 ned gel (~ 28 cm), gel kan stoppes ved å slå av strømmen. Fjerne gel fra apparatet og sted på cork ringer.
- Skiller platene med en liten kile plate skilletegn. Sett skilletegn på innsiden hjørne av hakkene å trekke opp. Vær forsiktig og bruker ikke overdreven force; hakkene kan bryte hvis for mye press.
- Når sugekraft mellom platene utgis, nøye løft topplaten og avgjøre hvilken plate gel er på. Hvis gel pinner på den nederste platen, trekke topplate av og plasserer på cork ring. Hvis gel på topplaten opphevelsen, gå sakte og gel kan falle tilbake på den nederste platen. Hvis gel ikke faller, igjen gå sakte dra den gjenværende delen av gel fra bunnplaten og plasser den øverste platen med gel på en separat cork ring.
- Når platene er skilt, der fargestoff er på gel og fjerne overflødig gel fra toppen og bunnen av gel. Vanligvis med våre konstruerer, er bruke enten en 18 eller 23 nukleotid primer og en 45 nukleotid mal, det ingen DNA mellom bromophenol blå farge foran og nederst gel. Klipp loddrett fra fargebad til toppen av gel. Mellomrommene mellom fargestoff og kantene av gel har også ingen DNA. Til slutt, kutte et par inches under godt plassen på gel. Det er ingen atomer syren på toppen av gel.
Merk: Kutte gel i den minste mulige størrelsen gjør det betydelig enklere å overføre på bildeenheten. Hvis gel er for stor, er det mer utsatt for ripping under overføring. Mens vi ofte trim gel før bildebehandling, anbefaler vi varsomhet når trim som relevante data kan gå tapt hvis omsorg ikke er tatt. For å sjekke om fjernet deler inneholde ekstra data, utfører vi ofte en ekstra skanning av de forbrukeravgift delene av gel å sikre at ingen data gikk tapt. - Coat gel med vann for å hindre uttørking.
- Rengjør imager overflaten. Bruker oppgave vindusviskere, tørk overflaten med vann og etanol. Legg et tynt lag med vann til overflaten der gel plasseres.
- Overføre ønsket del av gel på våt overflaten av Li-kor.
- Fjerne luft bobler ved forsiktig trykke dem ut fra gel og tørke med en oppgave vindusvisker. Vær forsiktig så det er veldig lett å rippe gel ved å skyve luftboblene for hardt.
- Image gel ifølge produsenten ' s protokoller. Analysere gel med tilgjengelig programvare for imager.
- Mens gel er blir fotografert, ren arbeidsområdet ved å fjerne overflødig akrylamid gel, vaske tallerkener og filtrering TBE bufferen skal gjenbrukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket polyakrylamid gel analyse av kvalitative karakteristikk av totale aktiviteten (beskrevet i Seksjon 2.1, figur 1) og stabil kinetics (beskrevet i notatet på konklusjonen avsnitt 2.1, figur 2) vises. En mislykket polyakrylamid gel analyse vises også (Figur 3).
Merk at ingen kommersielt tilgjengelig stige eller molekylær markør brukes. Noen ganger vil vi bruke en kjent polymerase-underlaget kombinasjon for å opprette merketråd molekylær; Det er imidlertid viktig å merke seg at ulike endret nukleotider har svært forskjellige electrophoretic mobilities, gjør sammenligning av oligonucleotides av samme lengde, men ulike nukleotid struktur upassende.
Figur 1: eksempel på vellykket polyakrylamid gel analyse av kvalitative karakteristikk av totale aktiviteten. Merk at enkelte bandene veldefinerte og regelmessig. Feltene representerer oligonucleotides av ulik lengde. Denne gel muliggjør enkel sammenligning mellom polymerases. Ingen enzym kontroll lane er angitt med et "-". Aktivitet er dømt etter både lengden på produktene og del av merket primer som er konvertert til større produkter. Fra denne analysen er E6 og E5 den mest aktive. E3 og E2 er omtrent lik i aktivitet, men mindre enn E6 eller E5 E4 og E1 er de minst aktive enzymene.
Figur 2: eksempel på vellykket gel for kvantitativ analyse bruker stabil kinetics. Merk at båndene er godt løst og godt definert. For å måle stabil rente konstantene i enkelttrinn i oligonucleotide syntese, er et enzym som ruges med varierende mengder nukleosid trifosfat (i dette tilfellet dCTP); Merk at bare n og (n + 1) produkter er synthesized aktivere kvantifisering av hendelsen entall.
Figur 3: eksempel på en mislykket gel for samlede aktivitet. Gel ble revet under behandling, noe som resulterer i synlige hull i band. Merk at gel band er uregelmessig formet, gjør kvantifisering og analyse vanskelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet analysen betegner DNA polymerase-mediert syntesen M-DNA. Ved hjelp av nær-infrarøde merket DNA primere, og bruker denaturing polyakrylamid gel geleelektroforese for å løse annerledes størrelse oligonucleotides, kan vi få single nukleotid oppløsning på oligonucleotides, muliggjør nøyaktig måling av syntese. Disse metodene kan brukes enten måle den totale aktiviteten av enzymet (inndelingen 2.1) eller måle Michaelis-Menten parameterne i enkelttrinn (Merk etter trinn 2.1). Våre lab har nylig brukt disse til både karakterisere tidligere utviklet enzymer9 samt rasjonelt konstruert enzymer10.
Våre analyser beskrevet her skiller seg fra tidligere metoder i sin bruk av en ikke-radioaktivt DNA-etikett. Historisk har radioaktivitet blitt brukt til å spore DNA-syntese på grunn av høy følsomheten som kan oppnås ved hjelp av radioaktive fosfor etiketter11,18. Dessverre, de høye kostnadene ved avhending og begrenset holdbarhet radioaktivt etiketter kan gjøre bruk av radioaktivt etiketter uoverkommelige. Her beskriver vi bruk av nær-infrarøde fluorophore merket DNA, som ikke lider ikke av disse ulempene. Spesielt med nær-infrarøde fluorescerende fargestoffer se vi lignende oppdagelsen grenser for radioactively merket DNA (upubliserte resultater). Men med fluorescerende fargestoffer i det synlige området var vi ikke se lignende oppdagelsen grenser (upubliserte resultater). Mens vår gruppe bruker vanligvis kommersielt forberedt DNA bærer nær infrarød fluorophores, er disse fargestoffer kompatible med en rekke etablerte etter syntese 5' endring kjemikalier som kan brukes til å installere disse etikettene.
Nær-infrarøde fluorescerende fargestoffer er også en fordel i at det er flere tilgjengelige farger, kan aktivere mer komplekse eksperimenter som overvåker syntese av to merket oligonucleotides i et enkelt eksperiment. Med radioaktive etiketter, er disse typer multicomponent eksperimenter ikke lett utført. Dette vil sannsynligvis gjøre en rekke mer komplekse eksperimenter, spesielt for ortogonale replikering eksperimenter.
Denne analysen og alle analysen bruker denaturing polyakrylamid gel geleelektroforese, begrenset hovedsakelig av teknisk utfordring ved utføring av geleelektroforese, lave gjennomstrømningen av disse eksperimentene, samt begrenset størrelse områdene som viser på Single nukleotid oppløsning. Vi håper at denne detaljerte protokollen tillater å overvinne utfordringer av disse analyser teknisk. Spesielt mens gjennomstrømningen av analysen er begrensende, øker bruk av nær-infrarøde fluorescerende etiketter gjennomstrømningen, som det ikke krever brukeren å utvikle en autoradiograph. Imidlertid tar gel fortsatt ca 4-6 h å sette opp og kjøre, begrense antall eksperimenter som kan kjøre per dag. Begrenset utvalg skyldes electrophoretic evnene av polyakrylamid. Praktisk talt, disse begrensningene mener at disse analyser er best for fokusert forskning spørsmål som krever single nukleotid oppløsning.
Nylig, har høy gjennomstrømning DNA sekvensering19 brukt stadig som karakteriserer DNA polymerases20,21. Disse analyser er bemerkelsesverdig for sine dramatisk økt gjennomstrømning, som muliggjør bredere spørsmål fokusert på sekvens skjevheter og feil spektra. Viktigere, mens høy gjennomstrømning sekvensering kan aktivere mange parallelle eksperimenter, kan det være utfordrende for å tolke på single nukleotid basis. Dette gir en spennende mulighet for enzym analyser ansette polyakrylamid gel geleelektroforese å fylle hullene i høy gjennomstrømning sekvensering, at metodene som er beskrevet i denne artikkelen er relevante for mange år framover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Research Corporation for vitenskapelige framgang (Cottrell College Scholar Award #22548) og TriLink bioteknologi (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33x42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
