Summary
Denne protokol beskriver karakterisering af DNA polymerase syntese af modificeret DNA gennem observation af ændringer til nær-infrarødt fluorescently mærket DNA ved hjælp af gelelektroforese og gel billeddannelse. Acrylamid geler bruges til høj opløsning billeddannelse af adskillelse af korte nukleinsyrer, der overflyttes til forskellige priser afhængig af størrelse.
Abstract
For enhver enzym er robust, kvantitative metoder nødvendige for karakterisering af både indfødte og manipuleret enzymer. For DNA polymeraser, kan DNA-syntese karakteriseres ved hjælp af en in vitro- DNA syntese assay efterfulgt af polyacrylamid gelelektroforese. Målet med denne analyse er at kvantificere syntese af både naturlige DNA og modificerede DNA (M-DNA). Disse tilgange er især nyttig til at løse oligonukleotider med enkelt nucleotid opløsning, gør det muligt for observation af enkelte skridt under enzymatisk oligonukleotid syntese. Disse metoder er blevet anvendt til vurdering af en række biokemiske og biofysiske egenskaber såsom måling af steady-state sats konstanter af enkelte trin af DNA-syntese, fejlrate på DNA-syntese og DNA bindende affinitet. Ved hjælp af ændret komponenter, herunder, men ikke begrænset til, ændrede nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, og/eller mutant DNA polymeraser, den relative nytte af substrat-DNA polymerase par kan evalueres effektivt. Her, detalje vi analysen, herunder de ændringer, der foretages til at rumme utraditionel primer DNA mærkning strategier såsom nær-infrarødt fluorescently mærket DNA. Desuden, vi har detaljerede afgørende tekniske skridt for acrylamid gel hælde og kører, kan der ofte være en teknisk udfordring.
Introduction
DNA polymeraser udføre præcise og effektive DNA syntese og er afgørende for at opretholde genom integritet. Evne til at syntetisere hundredvis af nucleotider pr. sekund uden at lave fejl gør også DNA polymeraser væsentlige værktøjer i Molekylærbiologi og bioteknologi. Men disse egenskaber også begrænse ansøgningerne om M-DNA substrater; generelt, naturlige DNA polymeraser ikke selv kan syntetisere mange potentielt værdifulde M-DNA substrater, sandsynligvis grund til den høje selektivt pres mod at bruge ikke-standard betalingsnumre substrater i vivo. Mange grupper har udviklet styret evolution metoder til at generere mutant DNA polymeraser i stand til at M-DNA syntese1a,2,3,4,5; disse bestræbelser har udvidet den bioteknologiske nytte af DNA6,7,8.
At evaluere mutant DNA polymeraser evne til at syntetisere M-DNA, vi9,10, og andre11,12,13 typisk bruge in vitro- målinger af DNA polymerase aktivitet, som er beskrevet i dette håndskrift. I disse eksperimenter er DNA polymeraser Co rugede med en mærket primer/skabelon duplex og nucleoside trifosfat substrater; produkterne er evalueret af gelelektroforese. Afhængigt af den specifikke eksperimentelle spørgsmål, mutant DNA polymeraser, modificerede primere, kan modificerede skabeloner eller modificerede nucleoside triphosphates bruges, gør det muligt systematisk biokemiske evaluering af mutant enzymaktiviteten.
Historisk set har har disse assays påberåbt sig en 5' radioaktivt mærket til at spore DNA syntese; mest almindeligt anvendte 32P og 33P; typisk, mærkning er opnået ved hjælp af T4 polynucleotide kinase11. Men på grund af den begrænsede levetid og relativt høje omkostninger ved radioaktive etiketter og deres sikker bortskaffelse, vores gruppe i stedet bruger en syntetisk 5' nær-infrarødt fluorophore mærket DNA. Ved hjælp af en relativt lav pris nær-infrarødt gel imager, har vi observeret lignende påvisningsgrænserne for forudgående undersøgelser ved hjælp af radioaktivt etiketter (ikke-offentliggjorte resultater). Vi har med held gengivet forbi observationer9, og vi har ikke observeret nogen store kvantitative forskel med tidligere målte sats konstanter (ikke-offentliggjorte resultater).
For at analysere størrelsen af DNA, og dermed omfanget af DNA-syntese, stoler vi på polyacrylamid gel elektroforese metoder udviklet oprindeligt for Sanger sekventering14 før fremkomsten af kapillær elektroforese15. Afstand af separation eller mobilitet kan bruges som en måling af Molekylær vægt; stort format, lodret polyacrylamidgeler kan opnå enkelt nucleotid opløsning, gør det muligt for kvantitative observation af DNA oligonukleotider af varierende længde.
Kollektivt, er disse eksperimenter en robust metode til polymerase karakterisering. På grund af tid er følsomme karakter af de reaktioner, forberedelse og pleje nødvendigt at opnå reproducerbare resultater. Yderligere, mens acrylamid gel er en meget effektiv måde at måle DNA-syntese, samt talrige andre DNA ændre reaktioner, med en enkelt nukleotid opløsning, det kan være teknisk udfordrende. Protokol her vil forhåbentlig give brugere til at udføre disse eksperimenter samtidig undgå de mest almindelige fejl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. aktivitet Assay
NOTE: der er to typiske typer af assays, der ofte køres til at karakterisere DNA polymeraser ved hjælp af de metoder, der beskrives her. De adskiller sig i om de kvalitativt karakterisere samlede syntese (omfatter mange trin af DNA syntese) eller om de kvantitativt fokuserer på enkelte trin. Vi beskriver de nødvendige trin for hver af disse nedenfor.
Bemærk: Da samling af materialer er relativt kompliceret, for tid følsomme eksperimenter, anbefaler vi, at alle materialer er samlet på forhånd. Opskrifter på alle kritiske komponenter i analysen er angivet nedenfor. Kommercielle leverandører for komponenter er angivet i Tabel of Materials.
- 10 x SF Buffer opskrift (10 x SFB)
NOTE: I vores assays, vi typisk bruger den N-terminale trunkering af DNA polymerase I Thermus aquaticus, almindeligvis kendt som Stoffel fragment (SF) 16 , 17. Opskriften her er den foretrukne buffer for SF 3 , 13. Andre buffere kan erstattes afhængigt af den specifikke DNA polymerase.
NOTE: Den endelige koncentration af 10 x SF buffer komponenter er 500 mM Tris pH 8,5, 65 mM MgCl 2, 0,5 mg/mL BSA, 500 mM KCl (s), og ultrarent vand. Målinger er på 1 mL af SF buffer, hvilket er tilstrækkeligt for 100-200 assays, afhængig af omfanget. Bufferen kan gemmes på ubestemt tid på-20 ° C.- Kombinere 0,5 mL 1 M Tris, 65 µL 1 M MgCl 2, 50 µL af 10 mg/mL BSA, og 0.0373 g af KCl (s) i et 1,5 mL tube. Tilføje 385 µL ultrarent vand for at nå en endelige mængden af 1 mL.
- 1 x opbevaring Buffer opskrift (1 x SB)
NOTE: den endelige koncentration af 1 x buffer komponenter er 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM DTT, 0,6 mM EDTA og 50% glycerol. Opskriften gør 20 mL af 1 x SB.- Kombinere 0.012 g DTT, 100 µL af 0,5 M EDTA, og fyld en 50 mL konisk slange med 40 mL 100 mm Tris (pH 7,5) at gøre 2xSB. Blanding af vortexing.
- Overføres 10 mL 2 x SB til en ny 50 mL konisk tube og fortyndes med glycerol ved at tilføje 10 mL glycerol til den nye koniske.
- Quenching buffer orange (QBO) opskrift
Bemærk: når der anvendes radioaktivt etiketter, brugere ofte vil ansætte bromophenol blå og/eller xylol cyanol som en tracking farvestof til elektroforese fremskridt. Men disse farvestoffer bliver svagt fluorescerer i regionen nær-infrarødt forstyrre DNA signal. Dermed, vi bruger Orange G i deres sted for alle reaktioner, der indeholder proever. Mens vi har fundet Orange G egnet til sporing gel ladning, har vi fundet Orange G at være mindre konsekvent som et farvestof, der sporer elektroforese fremskridt; dermed, vi kører Tom baner indeholdende bromophenol blå på de ydre baner af gel, der ikke indeholder prøven for at spore gel fremskridt.- Kombinere 950 µL af 95% formamid med 25 µL af 0,5 M EDTA og 25 µL ultrarent vand. Tilsæt 1 skefuld orange G farvestof (~ 10 mg). Blanding af vortexing.
Forsigtig: Formamid er giftige; bære personlige værnemidler (PPE) såsom handsker, briller og lab coat, og bortskaffes som farligt affald.
- Kombinere 950 µL af 95% formamid med 25 µL af 0,5 M EDTA og 25 µL ultrarent vand. Tilsæt 1 skefuld orange G farvestof (~ 10 mg). Blanding af vortexing.
2. Assay Run
- kvalitative karakterisering af samlede aktivitet
Bemærk: For denne analyse, vi typisk opretholde konstant koncentration af M-NTPs og variere tid. Målet er at vurdere de generelle Karakteristik af protein i stedet for at måle de enkelte trin. For at forberede en reaktion, vil et lige saa stort volumen af to separate komponenter, duplex mix (beskrevet taktfast 2.1.1) og den dNTP blanding (beskrevet taktfast 2.1.2), blive udarbejdet særskilt, og derefter kombineres for at give den endelige mængden af 49 µL. Tilsætning af 1 µL 50 x enzym vil derefter indlede reaktionen. Variabel tidspunkter kan tages; typisk, vi slukke på 0, 5, 15 og 60 min.- Udarbejdelse af DNA duplex mix
Bemærk: duplex mix er sammensat af 10 x SF buffer, primer oligonukleotid, skabelon oligonukleotid og ultrarent vand. Samlede volumen tilføjes hver reaktion er 25 µL. 1 µL af enzymet vil blive tilføjet til master mix umiddelbart forud for indledningen af eksperimentet.
Bemærk: For vores assays, vi typisk bruger en 45-mer skabelon og en 18-mer eller 23-mer primer. Mens en række forskellige længder kan bruges, vi har tendens til at bruge denne længde, fordi produkterne (lige fra 18 nukleotider til 45 nukleotider) er let løst på en enkelt nukleotid niveau ved hjælp af protokollerne beskrevet gel elektroforese. Da oligonukleotid produkter stigning i længde, det kan være en udfordring for at løse produkter på single nucleotid opløsning.
Bemærk: I vores forsøg og, vi bruger en 5 ' nær-infrarødt fluorescerende farvestof etiket på primer strand at observere primer produkter. Vi køber brugerdefinerede syntetiserede oligonukleotider forsynet med denne ændring; denne label kan dog indarbejdes ved hjælp af et vilkårligt antal post syntetiske mærkning strategier. Skabelon oligonukleotid er mærket ikke og så det konstateres ikke bruger gel imager. For begge oligonukleotider, vi gemmer oligonukleotider på 100 µM i 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
Bemærk: Fordi vi observerer kun primer, en to-fold overskydende af skabelon der bruges til at sikre, at alle primere (den DNA arter, der er ved at blive iagttaget) er udglødet til skabelonen. Den endelige duplex koncentration i denne reaktion er 40 nM.
Bemærk: Nær-infrarødt fluorescerende farvestoffer er ofte lidt lysfølsomt; Når det er muligt, dækker vi primeren (og enhver løsning, der indeholder primeren) med folie. Dette omfatter polyacrylamid gel, mens den kører.
Bemærk: Nedenfor er et repræsentativt eksempel på syntesen af 2 ' F M-DNA.- Fortyndes primer 1 og skabelon 1 (Se Tabel af materialer for sekvens) til 1 µM i ultrarent vand.
- For hvert assay reaktion, i separate rør, kombinere 5 µL af 10 x SF buffer, 2 µL 1 µM primer 1, 4 µL 1 µM skabelon 1 og 13 µL ultrarent vand i rør kompatibel med en termisk cycler.
- Anneal duplex i en thermocycler ved hjælp af følgende program: 98 ° C i 2 min., 70 ° C i 5 min, 50 ° C i 5 min, 40 ° C i 5 min, hold på 25 ° C. Det specifikke program kan variere afhængigt af den udgloedning temperatur af primer/skabelon duplex. Typisk, vi foretrækker at omfatter mindst en 5 min skridt ad den udgloedning temperatur, og derefter en anden 5-min skridt ved en temperatur på 5-10 grader under den udgloedning temperatur.
- Forberedelse af 2 x dNTP blanding
Bemærk: afhængigt af eksperimentet, er det muligt at bruge variabel dNTP'er og koncentrationer af dNTP'er. Vi bruger typisk 50-200 µM i reaktionen.- Forbered en 25 µL opløsning indeholdende 100 µM af hver 2 ' F-NTP. Gemme M-NTPs på 100 mM.
- Forberedelse af 50 x protein fortynding
Bemærk: lang sigt opbevaring, enzymer bør opbevares ved-20 ° C i 1xSB. Når fjernet fra-20 ° C fryser, bør enzymer opbevares på is på alle tidspunkter inden de tilsættes til master mix. Enzym fortyndinger bør gøres frisk fra koncentreret lager hver dag. Koncentreret enzym bestanden skal returneres til-20 ° C fryser straks efter brug.
Bemærk: Fordi vi evaluere primært mutant DNA polymeraser, vi kun bruger enzymer, der er blevet udtrykt og renset i vores laboratorium ved hjælp af etablerede metoder 9 , 10. For kommercielt købt polymeraser, brugere bør være på vagt over for optimal buffere for forskellige proteiner og deres forenelighed med de buffere, der er beskrevet heri.
Bemærk: Enzym koncentrationer vil variere for hvert forsøg. Her viser vi et repræsentativt eksempel for 2 ' F-DNA-syntese.- At lave en 10 nM enzym løsning, fortyndes 1 µL af enzymet into 1 x SB at gøre et 50 x endelige enzym koncentration. Koncentrationen af 50 x løsning bør være 500 nM. For eksempel, hvis bestand enzym koncentrationen er 50 µM, tilføje 1 µL stock enzym til 99 µL 1 x vejledende
Bemærk: Da enzymet er typisk gemt i 50% glycerol, løsningen er ret tyktflydende. Selv hvis du bruger meget præcise pipetter, vi anbefaler ikke pipettering mindre end 0,5 µL, overvejer betydningen af nøjagtighed og præcision under enzym fortynding.
- At lave en 10 nM enzym løsning, fortyndes 1 µL af enzymet into 1 x SB at gøre et 50 x endelige enzym koncentration. Koncentrationen af 50 x løsning bør være 500 nM. For eksempel, hvis bestand enzym koncentrationen er 50 µM, tilføje 1 µL stock enzym til 99 µL 1 x vejledende
- Indledningen af analysen
- indstillet temperatur på en tør bad til 50 ° C.
- Tilføje 24 µL af den udglødet dupleks Bland (Se trin 2.1.1) til 25 µL af 2 x dNTPs (Se trin 2.1.2).
- Fjerne 9,8 µL af blandingen i trin 2.1.4.2 og tilføje til 20 µL af QBO (Se afsnit 1.3 for opskrift). Denne delprøve fungerer som en " ingen enzym " kontrol og bør opnås for hver kørsel.
- Tilføje 0,8 µL af 50 x enzym (Se trin 2.1.3.1) til duplex/dNTP mix. Pipetteres op og ned med en stor mængde mikropipette blandes grundigt.
- Efter 5, 15 og 60 min, slukke reaktionen ved at fjerne 10 µL af hver reaktion løsning og føje til et microcentrifuge rør indeholdende 20 µL QBO (beskrevet i afsnit 1.3).
- Når slukket, reaktioner kan være gemt under folie på ubestemt tid på 4 ° C eller -20 ° C.
Bemærk: For kvantitative karakterisering af enkelte trin i M-DNA-syntese, en meget lignende assay kan køre kvantitativt få Michaelis-Menten parametre. Denne analyse bruger alle de samme materialer. Michaelis-Menten parametre kan måles til dNTP; i dette tilfælde den væsentligste forskel er, at, snarere end tilføje duplex-mix til dNTP mix, det tilføjer duplex mix med enzym til en serie af 2 x dNTP løsninger. På samme måde, Michaelis-Menten parametre kan måles for DNA duplex. Bestemte betingelser skal være opfyldt for at tilfredsstille de antagelser, der er nødvendige for at bruge Michaelis-Menten-ligningen. Disse betingelser, og den grundlæggende mekanik af analysen, er godt forklaret i et foregående metoder artikel 11.
- Udarbejdelse af DNA duplex mix
3. Gel elektroforese
Bemærk: fordi hælde gelen er tid følsomme, alle materialer er samlet på forhånd. Opskrifter på alle kritiske komponenter i analysen er listet nedenfor; leverandører er angivet i Tabel of Materials.
- Forberede 20% acrylamid gel acrylamid.
Bemærk: Denne opskrift gør 1 L acrylamid blanding. ca 120 mL af denne opløsning anvendes pr. gel. Gemme denne løsning ved stuetemperatur under folie i op til et år.
Forsigtig: Polyacrylamid er neurotoksiske. Det er vigtigt at bære handsker og en lab coat under alle trin af gel hælde. Hvis polyacrylamid får på handsker, erstatte handsker straks. Hvis acrylamid ikke er polymeriserede, placere de kontaminerede materialer i en mærket polyacrylamid affald taske.
Bemærk: Forblandet 40% acrylamid indeholdende 38.67% acrylamid og 1,33% bis-acrylamid for en monomer tværs linker forhold på 29: 1 blev brugt i denne protokol.- Vejer 17 g forblandet TBE pulver. Vejer seks separate dele af 70 g urea (i alt 420 g).
Bemærk: Urinstof skal tilføjes i portioner. Vi finder det bedst at opdele det i seks portioner. - Oprette en 2 L plast bægerglas på en røre pladen. Tilføje en enkelt stor omrøring stang til bægerglasset. Bægerglasset med folie når blanding for at undgå sprøjt.
- Tilsættes 500 mL 40% acrylamid i bægerglas. Sørg for, at løsningen omrøring.
- Tilføj tidligere vejes ud TBE. Tilføje en alikvot af urinstof. Tillade løsning at blande. Urinstof opløses langsomt og kan forekomme diset og hvide ved første tilføjelse. Langsomt tilføje de resterende delprøver af urinstof i blandingen over den næste time. Lad løsningen, bland indtil det er fuldstændig klar og farveløs.
Bemærk: Typisk Tillad dette at røre natten over. Hvis løsningen ikke er stadig opløst, tilføje små prøver af vandet og vente på urea krystallerne. - Tilføjelse af urinstof vil øge volumen tæt på 1 L. Tilføj vand at øge lydstyrken til præcis 1 L.
- Butik i en 1 L tonede glasflaske eller dække glasflaske med aluminiumsfolie.
- Vejer 17 g forblandet TBE pulver. Vejer seks separate dele af 70 g urea (i alt 420 g).
- Overhældning af acrylamid gel.
Bemærk: Ved håndtering af glasplader, være omhyggelig med at undgå kontakt mellem glasplader og en hård overflade. Dette er særligt vigtigt, idet hårdhændet behandling kan medføre små revner i glas; disse revner kan ikke være synlige før gelen kører, som opstår ved en højere temperatur. Vi bruger cork ringe til at forhindre denne uønskede kontakt.- Rene plader
- erhverve to 33 cm x 42 cm gel plader, en hakkede og en unnotched plade. Placere plader på separate cork ringene.
- Skylles plader grundigt med sæbe og vand. Sørg for, at der er ingen sæbe striber eller gel steder efterladt.
- Gør opmærksom på, hvilken side af pladen perlerne mindre vand. Denne side er gel vender side.
Bemærk: Hvis gelen køres på anden siden af pladen, det kan gøre gel udfordrende.
- Tørre plader
- bruger papirhåndklæder til at tørre begge ansigter af hver plade.
- Brug delikat opgave vinduesviskere tørre resterende områder. Være særlig opmærksom på kanterne af pladerne hvor båndet vil blive anvendt.
- Skylles glasplader med ~ 70% ethanol og tørres af med opgave vinduesviskere.
- Sørge for der er ingen papir håndklæde fibre eller vand dråber. Disse kan forårsage bobler, når hælde gelen.
- Tilføj afstandsstykker
- erhverve 0,75 mm spacere. Køre behandskede fingre under DI vand og forsigtigt våd afstandsstykker med behandskede fingre.
- Sted afstandsstykker langs de lange kanter af den indskåret plade. Rydde op enhver vand, der er sprøjtet på resten af pladerne. Sørg for, at spacere er justeret med glasplade og ikke hængende ud over kanten.
- Forsegling gel
- sætte på tørre handsker. Tørre kanterne af glasset igen med delikat opgave vinduesviskere.
- Juster unnotched pladen øverste ovenfor den hak plade, og langsomt lavere ned til tryk på pladerne mod hinanden. Check igen for at være sikker på, at kanterne af alle plader er justeret.
- Ved hjælp af gel tape, placere båndet på tværs af alle kanter undtagen øverst. Sørg for tape er justeret jævnt og forsegles tæt. Båndet kan anvendes i én bevægelse, eller hver side kan gøres individuelt. Skær enderne af båndet med en barberkniv.
- Tilføjer et ekstra lag tape til bunden af gelen. Jo strammere båndet, jo mindre sandsynligt gelen vil lække når hælde.
- Klip sider af glas sandwich med de hvide klemmer. Tilføje 3 clips til hver side og 4 klip nederst.
- Hælde gel
- gøre 3 mL 10% ammonium persulfat løsning (APS) ved at opløse 0,3 g ammonium persulfat og fortynding af op til 3 mL i ultrarent vand.
Bemærk: 1,2 mL APS er nødvendig pr. gel. Dato røret efter derindgiverden. APS løsning udløber i 2 uger, og skal opbevares ved 4 ° C. - Overføre 125 µL af tetramethylethylenediamine (TEMED) til et separat microcentrifuge.
Bemærk: TEMED er giftige; bære PPE som handsker, briller og lab coat når håndtering. - Erhverve en sprøjte flaske og fjerne spidse tragten. Afmåle 125 mL vand i et måleglas og tilføje til flasken. Marker vandstanden på ydersiden af flasken med en permanent markør. Kassér vandet. Denne modificerede sprøjte flaske kan genbruges på ubestemt tid med ordentlig rengøring (se nedenfor).
- Oprettet de tilproppet ringe ved siden af vasken, så der er et sted at sætte gel, når det hældes. Placere plade sandwich her. Sætte en prop i vasken, så der er et sted at sidde pladerne mens gelen hældes. Gelen vil hældes i glas plade sandwich i en vinkel, så bunden vil hvile på proppen, mens toppen vil hvile på kanten af vasken. Sørg for, at der er puder nedenunder disse områder i tilfælde af polyacrylamid siler ned
- Sted APS løsning og TEMED løsning på anden siden af vasken, med tomme sprøjte flaske. Sted godt kam med det ønskede antal brønde på siden af vasken med pladerne. Sætte 4 klemmer i nærheden.
Bemærk: Det næste skridt i proceduren er meget tid følsomme. Være parat til at bevæge sig hurtigt gennem disse trin. Der er en begrænset mængde tid til at få blanding mellem pladerne før det polymeriserer. Alle komponenter (Mikropipetter forudindstillet til korrekte volumen, løsninger, glasplader) er omhyggeligt arrangeret at hælde gelen så hurtigt som muligt. Hvis en langsommere polymerisering ønskes APS og TEMED koncentrationer kan halveres; Dette vil dog kræve længere polymerisering. - Hældes sprøjte flaske til det afmærkede punkt 20% acrylamid gelopløsning. Hæld lidt mere gelopløsning over den markerede linje, så der er nok løsning for små lækager. Dette er ca 120 mL af stamopløsningen.
- Tilføje 120 µL af TEMED og 600 µL APS til polyacrylamid gelopløsning i sprøjte flaske på samme tid. Hurtigt tilføje en yderligere 600 µL af APS til polyacrylamid gelopløsning.
- Cap hurtigt sprøjte flaske og hvirvel. Placere plade sandwich i vasken.
- Begynder at hælde. Det tager kun 1-2 min for at undgå polymerisering. Langsomt, men støt, tilføje pres at sprøjte flaske så gelopløsning kommer ud jævnt. Hvis løsningen starter sprøjter uregelmæssigt fra sprøjte flaske, frigive trykket, så flasken bliver oppustet, og genoptage hælde. Watch for at sikre gelopløsning dækker alle områder, og det er ikke utæt fra nogen af siderne. For at fjerne luftbobler, ændre vinklen på pladerne. Boblerne vil pop øverst, og vil køre hurtigere, hvis vinklen er stejlere. Fortsætte hælde indtil løsningen har nået toppen af hak-området, og lidt overstrømmende hakket kant. Fjern alle luftbobler.
Bemærk: Hvis den plade sandwich lækager, eller der er ikke nok gelopløsning og løsningen ikke nå toppen af pladerne, gel kan ikke bruges. Vent indtil gel har polymeriserede, og rengør derfor. - Tilføje godt kam til plade sandwich. Sted 4 klemmer på kam at trykke ned og gøre det muligt for jævn fordeling af brøndene.
- Hurtigt disponere over den resterende gelopløsning i sprøjte flaske ind i mærket polyacrylamid affald. Skyl ud sprøjte flaske med DI vand 2 - 3 gange, gennem sprøjte dyse.
Bemærk: Det er vigtigt at udføre denne rengøring hurtigt for at forhindre polyacrylamid fra tilstopning i sprøjte flaske. Hvis selv en lille mængde af polymerisering indtræffer i dysen, vil den næste gel hældes alt for langsomt og ikke korrekt. Kassér sprøjte flaske, sker polymerisering.
- gøre 3 mL 10% ammonium persulfat løsning (APS) ved at opløse 0,3 g ammonium persulfat og fortynding af op til 3 mL i ultrarent vand.
- Rene plader
- Kører acrylamid gel
- mens gel er at være polymeriserede, gøre 1 x TBE kører buffer. 17 g forblandet TBE solid opløses i 1 L ultrarent vand. Ryst buffer, indtil alle TBE opløses.
- Fjerner alle ringbind klip fra plade sandwich.
- Bruge en skraber til at klippe båndet og fjerne bånd fra alle kanter af pladen sandwich.
- Ren off alle den polymeriserede gel fra glasset overflader. Bruge en barbermaskine langs kanterne til at skrabe ud resterende gel. Tørre plader med papirservietter og vand for at fjerne så meget polyacrylamid rester som muligt. Overskydende acrylamid og/eller tape kan ofte brænde under gelelektroforese.
- Fjerne godt kam ved at skubbe det jævnt på begge sider.
- Bruge en skraber til at afskære overskydende gel langs toppen af pladen sandwich. Skive langs indskåret kanten af pladen.
- Bruge en sprøjte og DI vand til at skylle brøndene og fjerne snavs i brøndene. Sørg for hver brønd kan være fyldt med vand, og ikke er blokeret af overskydende polymeriserede gel.
- Placere plade sandwich ind i apparatet, så længere pladen vender udad, og indskåret rummet vender indad.
- Tilføj klip til klip plade sandwich og aluminium plade sammen med apparatet. Tilføje til ydersiden af pladen til at fremme selv kører.
- Tilføje TBE buffer til at dække de base hak og lige nok til at dække wells øverst. TBE buffer kan filtreres og genanvendes til ca 5 geler.
- Varme plader i 20 min. ved at køre gelelektroforese på 50 W.
- Efter opvarmning pladerne, rense brøndene. Brug en sprøjte og TBE-buffer i badene til at sprøjte de resterende buffer salte fra brøndene. Gøre dette flere gange for at sikre ren brønde. Hvis brøndene ikke er ren, bands vil flosse og billedet vil ikke blive fortolkelige. Selv om dette kan være tidskrævende, vi har fundet det nødvendigt at få god data.
- Til den yderste vognbane på begge sider, med pipette overfoeres 5 µL af 95% formamid med bromophenol blå. Dette er den samme løsning som QBO, men med bromophenol blå i stedet for Orange G. Dette vil give en visuel om hvor man kan skære gel til billedbehandling, og hvor langt ned DNA har køre.
- For hver prøve analyseres (genereret i afsnit 2.1.1), tilføje 3 µL til et enkelt godt af gelen. Efter indlæsning af alle prøver, vente 1 min til prøver at bilægge.
- Læg hætter på både top og bund plast bade. Vedhæfte ledningerne til apparatet. Rød angiver den positive elektrisk ladning, så det bør være i bunden, så DNA løber nedad.
- Vedhæft ledninger til en power source og indstillet til 50-55 W. Kør gelen i ca 3 timer eller indtil bromophenol blå farvestof front har kørt mindst 2/3 ned gelen.
- Imaging gel
Bemærk: denne gel er ekstremt tynde og kan være vanskelige at håndtere. Stor forsigtighed skal træffes for at forhindre kopiering (ripping) og tab af hele gel.
Bemærk: afhængigt af etiketten DNA det kan kræve brug af forskellige gel kameraer. Denne protokol bruger nær-infrarødt fluorescerende farvestoffer og billeddannelse af prøver blev udført på en gel imager (Se Tabel af materialer). Protokollen er specielt skrevet til denne imager.- Da bromophenol blå farvestof front har kørt mindst 2/3 ned gel (~ 28 cm), gel kan stoppes ved at slukke strømmen. Fjerne gel fra apparater og sted på cork ringe.
- Separate plader med en lille kile plade separator. Placere separatoren på indersiden hjørne af hak at trække op. Vær forsigtig og brug ikke overdreven kraft; hakkene kan bryde hvis for meget pres er anvendt.
- Når sugning mellem pladerne er frigivet, omhyggeligt løft den øverste plade og afgøre, hvilken plade gelen er på. Hvis gelen sticks på bundpladen, trække topplade ud og sted på cork ring. Hvis gelen er på den øverste plade er ophævet, bevæge sig langsomt og gelen kan falde tilbage til bundpladen. Hvis gelen ikke falder, igen bevæge sig langsomt og trække den resterende del af gel fra bundpladen, og Placer den øverste plade med gel på en separat cork ring.
- Når pladerne er adskilt, se, hvor farven på gelen og fjerne overskydende gel fra toppen og bunden af gelen. Typisk, med vores konstruktioner, ved hjælp af enten en 18 eller 23 nukleotid primer og en 45 nukleotid skabelon, der er ingen DNA mellem bromophenol blå farvestof front og bunden af gelen. Skære lodret fra farvestoffet til toppen af gelen. Mellemrummene mellem farvestoffet og kanterne af gelen også har ingen DNA. Endelig, skære et par inches under den godt plads på gelen. Der er ingen nukleinsyrer på toppen af gelen.
Bemærk: Skære gel i de mindste størrelse muligt gør det betydeligt lettere at overføre på billedenheden. Hvis gelen er for stor, er det mere modtagelige for ripping under overførslen. Mens vi ofte trim gel før imaging, anbefaler vi at bruge ekstrem forsigtighed når trimning som relevante data kan gå tabt, hvis ikke omhu. For at kontrollere, om fjernet dele indeholder yderligere data, udfører vi ofte en ekstra scanning af de skåret dele af gel til at sikre, at ingen data gik tabt. - Frakke gel med vand for at undgå udtørring.
- Rense imager overflade. Bruger opgave vinduesviskere, tør ned overfladen med vand og ethanol. Tilføje et tyndt lag af vand til overfladen hvor gelen placeres.
- Overføre den ønskede del af gel Li-kor. våd overflade
- Fjern luft bobler ved forsigtigt at trykke dem ud fra gelen, og aftørring med en opgave vinduesvisker. Være forsigtig, da det er meget nemt at rippe gel ved at skubbe luftboblerne for hårdt.
- Billede gel ifølge producenten ' s protokoller. Analysere gel med tilgængelig software for imager.
- Mens gelen er ved at blive afbildet, ren arbejdsplads ved at fjerne overskydende acrylamid gel, vaske tallerkener og filtrering TBE-buffer genbruges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket Polyacrylamiden analyse af en kvalitativ karakterisering af samlede aktivitet (beskrevet i punkt 2.1, figur 1) og steady-state kinetik (beskrevet i note i indgåelse af afsnit 2.1, figur 2) er vist. En mislykket Polyacrylamiden analyse er også vist (figur 3).
Bemærk at ingen kommercielt tilgængelige stigen eller Molekylær markør er brugt. Lejlighedsvis, vil vi bruge en kendt polymerase-substrat kombination til at skabe en molekylær markør; Det er dog vigtigt at bemærke, at forskellige modificerede nukleotider har meget forskellige elektroforese mobiliteter, foretage sammenligning af oligonukleotider af samme længde, men forskellige nukleotid struktur upassende.
Figur 1: eksempel på vellykket Polyacrylamiden analyse af en kvalitativ karakterisering af samlede aktivitet. Bemærk at de enkelte bands er veldefinerede og regelmæssig. Bandene repræsenterer oligonukleotider af forskellige længde; denne gel giver mulighed for nem sammenligning mellem polymeraser. Ingen enzym kontrol lane er angivet med et "-". Aktivitet er bedømt af både længden af produkterne og del af den mærket primer, der er konverteret til større produkter. Fra denne analyse er E6 og E5 de mest aktive. E3 og E2 er ca lig i aktivitet, men mindre end E6 eller E5, og E4 og E1 er de mindst aktive enzymer.
Figur 2: eksempel på vellykket gel til kvantitativ analyse ved hjælp af steady-state kinetik. Bemærk at bandene er godt løst og veldefineret. For at måle steady-state sats konstanter af enkelte trin i oligonukleotid syntese, er et enzym, der inkuberes med varierende mængder af nucleoside trifosfat (i dette tilfælde, dCTP); Bemærk at kun n og (n + 1) produkter er syntetiseret aktivering kvantificering af den enestående begivenhed.
Figur 3: eksempel på en mislykket gel for samlede aktivitet. Gelen blev revet under håndtering, der resulterer i synlige huller i bands. Bemærk, at gel bands er uregelmæssigt formet, vanskeliggør kvantificering og analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet en analyse for at karakterisere DNA polymerase-medieret syntesen af M-DNA. Ved hjælp af nær-infrarødt mærket DNA primere, og ved hjælp af denaturering polyacrylamid gelelektroforese for at løse forskellige størrelser oligonukleotider, kan vi få enkelt nucleotid beslutning om oligonukleotider, muliggør præcis måling af syntese. Disse metoder kan bruges til enten måle den samlede aktivitet af enzymet (afsnit 2.1) eller til at måle Michaelis-Menten parametre af enkelte trin (Bemærk følgende trin 2.1). Vores lab har for nylig brugt disse til både kendetegner tidligere udviklet enzymer9 samt rationelt manipuleret enzymer10.
Vores assays beskrevet her adskiller sig fra tidligere metoder i deres brug af en ikke-radioaktive DNA etiket. Historisk, er radioaktivitet blevet brugt til at spore DNA syntese på grund af høj følsomhed, der kan opnås ved hjælp af radioaktivt fosfor etiketter11,18. Desværre, de høje udgifter til bortskaffelse og radioaktive etiketter begrænset holdbarhed kan gøre brug af radioaktive etiketter uoverkommelige. Her, beskriver vi brugen af nær-infrarødt fluorophore mærket DNA, som ikke lider af disse ulemper. Især med nær-infrarød fluorescerende farvestoffer ser vi lignende påvisningsgrænserne for radioaktivt mærket DNA (ikke-offentliggjorte resultater). Dog med fluorescerende farvestoffer i det synlige spektrum har vi ikke kunnet iagttage lignende påvisningsgrænserne (ikke-offentliggjorte resultater). Mens vores gruppe bruger typisk kommercielt tilberedt DNA forsynet med nær-infrarødt fluorophores, er disse farvestoffer kompatibel med en række etablerede efter syntese 5' ændring kemi, der kan bruges til at installere disse etiketter.
Nær-infrarødt fluorescerende farvestoffer er også fordelagtige, idet der er flere kommercielt tilgængelige farver, som kan aktivere mere komplekse eksperimenter, der overvåger syntese af to mærket oligonukleotider i et enkelt eksperiment. Med radioaktivt etiketter udføres disse typer af stand eksperimenter nemt ikke. Dette vil sandsynligvis sætte en række mere komplicerede forsøg, især for ortogonale replikering eksperimenter.
Denne analyse, og enhver analyse ved hjælp af denaturering polyacrylamid gelelektroforese, er primært begrænset af den tekniske udfordring af udfører elektroforese, den lave gennemløb af disse eksperimenter, samt de begrænsede intervaller, der kan iagttages på enkelt nucleotid opløsning. Vi håber, at denne detaljerede protokollen tillader grupper at overvinde de tekniske udfordringer ved disse assays. Navnlig, øger gennemløb af analysen er at begrænse, anvendelsen af nær-infrarødt fluorescerende etiketter overførselshastighed, som det ikke gør forlange bruger til at udvikle en autoradiograph. Men gel stadig tager ca 4-6 h at sætte op og køre, begrænse antallet af eksperimenter, der kan køre om dagen. Den begrænsede rækkevidde er forårsaget af polyacrylamid elektroforese kapaciteter. Rent praktisk disse begrænsninger betyder, at disse assays er bedst for målrettet forskningsspørgsmål, der kræver enkelt nucleotid opløsning.
For nylig, har høj overførselshastighed DNA-sekventering19 anvendt i stigende grad som en metode til at karakterisere DNA polymeraser20,21. Disse assays er bemærkelsesværdige for deres dramatisk øget overførselshastighed, der muliggør bredere spørgsmål fokuseret på sekvens afvigelser og fejl spektre. Vigtigere, mens høje overførselshastighed sekvensering kan aktivere mange parallelle eksperimenter, kan det være en udfordring for at fortolke på en enkelt nukleotid grundlag. Dette giver en spændende mulighed for enzym-assays beskæftiger polyacrylamid gelelektroforese at udfylde hullerne i høj overførselshastighed sekventering, sikre, at de metoder, der beskrives i denne artikel er relevant for mange år fremover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskning Corporation for videnskabens fremskridt (Cottrell College Scholar Award #22548) og af TriLink bioteknologi (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33x42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
