Summary
このプロトコルでは、電気泳動、ゲル画像を用いた近赤外蛍光に分類された DNA に変化の観察を通じて変更された DNA の DNA ポリメラーゼの合成の特性について説明します。アクリルアミドゲルはサイズに応じて異なる速度で移行短い核酸の分離の高分解能イメージングに使用されます。
Abstract
酵素、堅牢な定量的メソッドがネイティブと組み換え酵素の特性評価のため必要です。DNA ポリメラーゼの DNA 合成は、体外DNA 合成法によるポリアクリルアミドゲル電気泳動が続くと言えます。この試金の目標は、変更された DNA (DNA) と自然な DNA の合成を定量化することです。これらのアプローチは単一のヌクレオチド分解能、酵素オリゴヌクレオチド合成時の個々 のステップの観察とオリゴヌクレオチドを解決する場合に特に便利です。これらのメソッドは、DNA 合成の個々 のステップ、DNA 合成と DNA 結合親和性の誤り率の定常状態速度定数の測定などの生化学的および生物物理学的プロパティの配列の評価に適用されています。使用して、変更されたヌクレオシドの三リン酸塩に限らず、(NTP) は、M-DNA および/または突然変異 DNA のポリメラーゼ、ペアを効果的に評価できる基板 DNA ポリメラーゼの相対的なユーティリティを含むコンポーネントを変更しました。ここでは、我々 は非伝統的なプライマー DNA の分類の近赤外蛍光標識 DNA などの戦略に合わせて行う必要があります変更を含め、自身を分析を詳しく説明します。また、注ぐアクリルアミドゲルの重要な技術的なステップの詳細な実行して、することがあります技術的に挑戦的です。
Introduction
DNA ポリメラーゼは、正確かつ効率的な DNA 合成を行い、ゲノムの整合性の維持に不可欠な。エラーすることがなく何百もの 1 秒あたりのヌクレオチドを合成する能力も分子生物学とバイオ テクノロジーの DNA ポリメラーゼの不可欠なツールになります。ただし、これらのプロパティも M DNA 基板上へのアプリケーションを制限します。一般的に言えば、自然の DNA ポリメラーゼを合成できない多くの可能性のある貴重な DNA の M 基板可能性が高いため生体内で非標準基板の使用に対する高選択的圧力に。多くのグループが進化の M DNA 合成1,2,3,4、5のことができる突然変異の DNA ポリメラーゼを生成する方法を開発しています。これらの努力は、DNA6,7,8のバイオ テクノロジーの有用性を拡大しています。
M-DNA を合成する DNA ポリメラーゼの変異体の能力を評価する私たち9,10, その他11,12,13通常使用 DNA の生体外の測定本稿で説明するポリメラーゼ活性。これらの実験で DNA ポリメラーゼが二重標識プライマー/テンプレートとヌクレオシド三リン酸基板; 共同培養製品は、ゲルの電気泳動によって評価されます。実験の具体的な質問、突然変異の DNA ポリメラーゼ、変更されたプライマー、によって修正されたテンプレートまたは変更されたヌクレオシドの三リン酸塩使用できます、変異体酵素活動の体系的な生化学的評価を有効にします。
歴史的には、これらの試金は DNA 合成; を追跡する 5' 放射性ラベルに頼ってきた最も一般的に、 32P、 33P が使用されています。通常、ラベル付けには、T4 ポリヌクレオチド キナーゼ11を使用して実現されます。ただし、有限の存続期間、放射性ラベル及びその安全な処分のコストが比較的高いため当社グループは代わりに分類される DNA 合成 5' 近赤外蛍光を使用します。比較的低コストの近赤外ゲルの撮像素子を使用して、同様の検出限界放射性ラベル (未発表結果) を使用して事前研究を観察しています。過去の観測9、正常に再現しております、我々 はない前に測定した速度定数 (結果は未発表) で大規模な定量的な違いを観察しています。
DNA のサイズとしたがって、DNA 合成の範囲を分析するには、我々 はサンガー シーケンス14キャピラリー電気泳動15の出現の前に、のもともと開発されたポリアクリルアミドゲルの電気泳動方法に依存します。分離や移動の距離は、分子量の測定として使用できます。大判、ポリアクリルアミドゲル垂直は単一のヌクレオチド分解能、さまざまな長さのオリゴヌクレオチドを DNA の定量的観測を実現できます。
総称して、これらの実験は、ポリメラーゼ特性に対する堅牢な方法です。時間のため反応、準備とケアの敏感な性質は再現性のある結果を達成するために必要です。さらに、アクリルアミド ゲル多数 DNA 変更、他の反応単一ヌクレオチド分解能でと同様、DNA 合成を測定する非常に効果的な方法ですが、技術的に困難な場合ができます。ここのプロトコルがうまくいけば、ユーザーは最も一般的なミスを回避しながらこれらの実験を実行するを有効にします。
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Protocol
1 です。 作業の試金
注: ここで説明した方法を使用しての DNA ポリメラーゼを特徴付ける多くの場合実行の試金の典型的な 2 つのタイプがあります。全体的な合成 (DNA 合成の多くのステップを含む) の質的特徴かどうか、かどうか彼らは定量的個々 のステップに焦点を当てるが異なります。我々 は以下ごとにこれらの必要な手順を説明します
。
注: 材料の組立は比較的複雑で、時間敏感な実験のためなのですべての材料はあらかじめ組み立てられていることをお勧めします。アッセイのすべての重要なコンポーネントのレシピは次のとおりです。コンポーネントの商業サプライヤーは、材料表 に記載されています
- SF バッファー調理法 x 10 (10 x SFB)
注: 私たちの試金には N 末端切り捨てを使用する通常 DNA のポリメラーゼの 好熱菌、Stoffel としてよく知られているはフラグメント (SF) 16 、 17。ここのレシピは、SF 3 , 13 の最寄りのバッファーです。その他のバッファーは、特定の DNA ポリメラーゼによって代えることができる
。 注: SF バッファー コンポーネント x 10 の最終濃度が 500 mM Tris pH 8.5、65 mM MgCl 2、0.5 mg/mL BSA、500 mM KCl (s) と超純水。測定は、1 mL の SF バッファーを規模に応じて、100-200 の試金のために十分であります。バッファーは、-20 ° C で不明確に保存されることができます。- 結合 0.5 mL 1 M のトリス、1 M MgCl 2 65 μ、50 μ L の 10 mg/mL BSA、1.5 mL に KCl (s) の 0.0373 g 管です。1 mL の最終的なボリュームに到達する超純水の 385 μ L を追加します 。
- 1 x ストレージ バッファー調理法 (1 x SB)
注: バッファー コンポーネント × 1 の最終濃度は、50 mM Tris pH 7.5、1 mM DTT、0.6 ミリメートルの EDTA、および 50% のグリセロール。レシピ 1 x sb 20 mL になります。- 0.012 g DTT、0.5 M の EDTA の 100 μ L を組み合わせるし、100 mm 2xSB にするトリス (pH 7.5) 40 mL と 50 mL の円錐管を埋めます。ボルテックスでミックスします 。
- 10 mL 2 x 〜 新しい 50 mL のコニカル チューブし、新しい円錐形 10 mL グリセリンを追加することによってグリセリンで希釈するを転送します 。
- 焼入れバッファー オレンジ (QBO) レシピ
注: 放射性ラベルを使用すると、ユーザーが多くの場合使用ブロモフェノール ブルーとキシレンシアノール電気泳動法の進歩のための追跡の染料として。しかし、これらの染料、弱蛍光を発する近赤外領域の DNA 信号に干渉すること。したがって、我々 はサンプルを含むすべての反応の場所にオレンジ G を使用します。我々 は電気泳動の進捗状況を追跡する染料としてより少なく一貫するオレンジ G を発見したオレンジ G ゲルを追跡に適していることが見つかりましたが、したがって、我々 はブロモフェノールの青ゲルのゲルの進行状況を追跡するためにサンプルが含まれていない外部の車線を含む空の車線を実行します。- 25 95% ホルムアミドを組み合わせる 950 μ μ 0.5 M EDTA, 25 μ L の純水。オレンジ色の G 染料 (~ 10 mg) の 1 スクープを追加します。ボルテックスでミックスします
。 注意: ホルムアミドは有毒である;手袋、眼鏡、白衣などの個人保護用具 (PPE) を着用し、有害廃棄物として破棄します 。
- 25 95% ホルムアミドを組み合わせる 950 μ μ 0.5 M EDTA, 25 μ L の純水。オレンジ色の G 染料 (~ 10 mg) の 1 スクープを追加します。ボルテックスでミックスします
2。実行を試金
- 全体的な活動の質的特性
注: 我々 は通常 M 表示 NTPs の一定濃度を維持し、時刻を変更この試金のため。目的は、タンパク質の全体的な特性を評価するのではなく、任意の個々 のステップを測定することです。1 つの反作用を準備するには、2 つの個別のコンポーネント (2.1.1 の手順で説明) 二重のミックス、dNTP ミックス (2.1.2 の手順で説明)、等量を別途用意・、49 μ L の最終的なボリュームを与えるために結合されます。1 μ L の 50 倍の酵素の付加はその反応を開始します。可変時間ポイントを取ることができる;通常、我々 は 0、5、15、60 分で急冷します。- の準備の DNA 二重ミックス
注: 二重のミックス、SF バッファー、オリゴヌクレオチドのプライマー、テンプレート オリゴヌクレオチドと超純水 × 10 で構成されます。各反作用に追加容量は 25 μ L 1 μ l の酵素は実験の開始の直前のマスターの組合せに追加されます。
。 注: 私たちの試金のため我々 通常使用 45 mer テンプレートと 18 mer または 23 mer のプライマー。長さの異なる番号が使用できますが、我々 (45 ヌクレオチド 18 ヌクレオチドに至るまで) 製品が簡単に記述されているゲルの電気泳動のプロトコルを使用して単一のヌクレオチド レベルで解決されるために、この長さを使用する傾向があります。塩基の分解能で製品を解決する挑戦的かもしれないオリゴヌクレオチド製品は長さの増加、.
注: 実験の結果, 我々 は使用、5 ' プライマー製品を観察するプライマー ストランドの近赤外蛍光色素ラベル。この変更; をベアリング カスタム合成オリゴヌクレオチドを購入します。ただし、このラベルは後合成のラベリング方法の任意の番号を使用して組み込むことができます。テンプレート オリゴヌクレオチドが無ければ、だからそれはゲルの撮像素子を使用してを観測されていません。我々 が、1 mM EDTA で 10 mM のトリス (pH 8)、100 μ M でオリゴヌクレオチドを格納両方のオリゴヌクレオチド
。 注: プライマーだけを観察している我々 は、ためテンプレートの 2 倍の超過分はすべてプライマー (観察される DNA の種) は、テンプレートにアニールされることを確保するため使用します。この反応で最終的な二重の濃度は 40 nM です
。 注: 近赤外蛍光染料は、多少光に敏感です。可能であれば、我々 アルミホイルをかぶせてプライマー (とプライマーを含む任意のソリューション)。それの実行中、これはポリアクリルアミドゲルを含まれます
。 注: 下記 2 の合成の代表的な例は、' F M DNA。- 希釈プライマー 1 とテンプレート 1 (シーケンスの 材料表 を参照) を超純水で 1 μ 。
- 別管内各試金反応を組み合わせて SF バッファー x 10 の 5 μ、1 μ M プライマー 1、チューブをサーマルサイクラーとの互換性における超純水の 1 μ M テンプレート 1、13 μ の 4 μ L の 2 μ L.
- は、次のプログラムを使用してたちで二重をアニール: 25 ° C で 2 分、5 分、5 分、5 分、40 ° C は 50 ° C のための 70 の ° C の 98 ° C を保持します。特定のプログラムは、プライマー/テンプレートの双方向のアニーリングの温度によって異なります。我々 はアニーリングの温度で少なくとも 1 つの 5 分ステップと温度で別の 5 分ステップを含めることを好む通常、5-10 度熱処理温度以下 。
- 2 x dNTP 混合物の調製
注: 実験によって変数 dNTPs および dNTPs の濃度を使用することが可能です。通常、反応で 50-200 μ M を使用します。- 準備 25 μ L 溶液 100 μ M 各 2 の ' F NTP。100 mm M 表示 NTPs を格納します 。
- 蛋白質希釈 x 50 の準備
注: 長期的な保存、酵素は 1xSB に-20 ° C で格納必要があります。-20 ° C のフリーザーから削除されると、酵素は、マスター ミックスに添加する前にすべての回で氷の上保管する必要があります。酵素の希釈しなければならない集中在庫からの新鮮な毎日。濃縮酵素在庫は使用後すぐに-20 ° C のフリーザーに返されます
。 注: 突然変異の DNA ポリメラーゼを主に評価するので我々 だけ使用酵素発現と精製されている確立された方法 9 , 10 を使用して私たちの研究室で。市販購入したポリメラーゼ ユーザー異なった蛋白質におよび記載バッファーとの互換性のための最適なバッファーを警戒する必要があります
。 注: 各実験のため酵素濃度が異なります。ここでは、2 の代表的な例を示す ' F DNA 合成。- 10 nM 酵素液はを酵素 int の 1 μ L を希釈するにはo 1 x 〜 50 x 最終酵素濃度を確認します。50 x 溶液の濃度は 500 である nM。たとえば、ストック酵素濃度が 50 μ M の場合は 99 μ L 1 に 1 μ L 在庫酵素を追加 SB. x
注: 酵素は通常 50% のグリセロールで格納されるため、ソリューションはかなり粘性です。高精度なピペットを使用して、場合でもお勧めしません未満 0.5 μ L を分注酵素希釈時に正確さと精度を重視したします 。
- 10 nM 酵素液はを酵素 int の 1 μ L を希釈するにはo 1 x 〜 50 x 最終酵素濃度を確認します。50 x 溶液の濃度は 500 である nM。たとえば、ストック酵素濃度が 50 μ M の場合は 99 μ L 1 に 1 μ L 在庫酵素を追加 SB. x
- 試金の開始
- 乾燥お風呂の温度を 50 に設定 ° C
- 焼なまし材の二重の追加 24 μ L ミックス (手順 2.1.1 参照) する (2.1.2 手順参照) 2 x dNTPs を 25 μ l 添加 。
- Μ L の混合物の 2.1.4.2 を手順、20 に追加削除 9.8 μ QBO (レシピのセクション 1.3 を参照)。この因数として、" ない酵素 " を制御し、実行ごとに取得する必要があります 。
- 50 x 酵素の 0.8 μ L を追加 (手順 2.1.3.1 パビリオン参照) 二重/dNTP のミックスに。徹底的にミックスする大量のマイクロ ピペットで、上下ピペットします 。
- 5、15、60 分前後後各反応液の 10 μ L を取り外し、20 μ L QBO (セクション 1.3 で説明) を含む微量遠心チューブに取り付けて反応を抑制します 。
- 反応 4 ° C または-20 で無期限に箔下に収納可能、一度 ° C
注: M DNA 合成の個々 のステップの定量的評価は、非常によく似たアッセイは定量的ミカエリス-メンテン型のパラメーターを取得する実行できます。この試金は、すべて同じ物を使用します。DNTP; ミカエリス-メンテン型のパラメーターが測定できます。この場合、最も重要な違いは、ことがなく二重ミックス dNTP ミックス、それ追加酵素と二重のミックス 2 x dNTP ソリューションのシリーズに。同様に、DNA 二重ミカエリス-メンテン型のパラメーターを測定することができます。ミカエリス-メンテン型の式を使用するために必要な前提条件を満たすために、特定の条件を満たす必要があります。これらの条件と、アッセイの基本的な仕組みは以前メソッド記事 11 でよく説明される 。
- の準備の DNA 二重ミックス
3。ゲルの電気泳動
注: ゲルを注ぐが、敏感なのですべての材料はあらかじめ組み立てられて。アッセイのすべての重要なコンポーネントのレシピを以下に。サプライヤーは、材料表 に一覧表示されます
。- 20% アクリルアミドゲルのアクリルアミドを準備します
。 注: このレシピになります 1 L のアクリルアミドの混合;ゲルあたり約 120 mL のこの溶液が使用されます。1 年間、箔の下で室温でこのソリューションを保存します
。 注意: ポリアクリルアミドは神経毒性です。ゲル注入のすべてのステップの中に手袋、白衣を着用することが重要です。ポリアクリルアミドは、手袋を取得した場合は、すぐに手袋を交換してください。アクリルアミドを重合しない場合ラベル ポリアクリルアミド廃棄袋に汚染物質を配置します
。 注: 38.67% アクリルアミドと架橋剤の比 29:1 のモノマーの 1.33% ビス アクリルアミドを含む予混合の 40% アクリルアミドは、このプロトコルで使用されました。- 予 TBE 粉末の重量を量る 17 g。尿素 (420 g の合計) の 70 g の六つの独立した部分の重量を量ます
。 注: 尿素は部分に追加する必要があります。最高の六つの部分に分割することがわかりました 。
- は、撹拌プレートの 2 L プラスチック ビーカーを設定します。一つの大きな攪拌ロッドをビーカーに追加します。飛散防止のため混合するときに箔でビーカーをカバーします 。
- は、40% アクリルアミド溶液 500 mL をビーカーに追加します。ソリューションの攪拌を確認してください 。
- 追加以前の重量を量ったアウト TBE。尿素の 1 つの因数を追加します。ソリューションを混在させることを許可します。尿素はゆっくり分解してぼんやりと初期追加時に白があります。ゆっくりと混合物に次の時間わたって尿素の残りの因数を追加します。解決策は、それは完全に明確と無色になるまで混ぜるみましょう
。 注: 通常、許可、一晩撹拌します。まだ解決策は解散しない場合水の小さい因数を追加し、溶解する尿素を待つ 。
- 尿素の添加は 1 正確に量を増やすことの 1 の l. 追加水の近くにボリュームを増やす l.
- 1 L 着色ガラス瓶またはカバー アルミ箔をガラス瓶にストアします 。
- 予 TBE 粉末の重量を量る 17 g。尿素 (420 g の合計) の 70 g の六つの独立した部分の重量を量ます
- アクリルアミドゲルの注ぐ
。 注: ガラス板を処理する場合は、ガラス板と任意のハード面との接触を避けるために注意します。乱暴な取り扱いからす製の小さいひびを引き起こすことができるという点で、これは特に重要です。これらのひびはゲルが実行されるまで、発生する高温表示されません。我々 は、この不要な接触を避けるためコルク リングを使用します。- クリーン プレートします
- 取得 2 33 × 42 cm ゲル板、切欠きを有する 1 つ、1 つ平滑プレート。別のコルクリングのプレートを配置します 。
- 石鹸と水で十分にすすぎプレート。Soap 縞模様や残されたゲル斑点がない確認します 。
- より少ない水プレート ビーズのどちら側のメモしておきます。こっちが向いているゲル
。 注: プレートの他の側に、ゲルを実行した場合ことがありますゲル転送挑戦 。
- プレートを乾燥
- 各プレートの両方の面を乾燥するペーパー タオルを使用します 。
- 残りの領域を乾燥する繊細なタスク ワイパーを使用。テープが適用されますプレートの端に特に注意してください 。
- ~ 70% エタノールをガラス板を洗浄し、タスク ワイパーで拭いてください 。
- は、水滴または紙タオルの繊維がないかどうかを確認します。これらはゲルを注ぐとき泡を引き起こすことができます 。
- スペーサーを追加
- 0.75 mm スペーサーを取得します。・ ディ ・水の下で手袋をはめた指を実行し、そっと手袋をはめた指でスペーサーをウェットします 。
- 、切欠きの長い辺に沿って場所スペーサー プレート。プレートの残りの部分に付着している水をクリーンアップします。スペーサー ガラス板と一直線に並ぶかどうかを確認し、端にぶら下がっていない 。
- シールのゲル
- 乾いた手袋を入れて。再び繊細なタスク ワイパーとガラスのエッジをドライします 。
- 平滑板切欠き平板上トップとお互いに対して板を押してゆっくりと下に合わせます。すべてのプレートの端が整列することを確認するチェックします 。
- 使用ゲルのテープは最上位を除くすべてのエッジを越えてテープを配置します。テープは均等に揃え、しっかりと密封されていることを確認します。テープは、1 つの動きに適用できるかまたはそれぞれの側を個別に行うことができます。かみそりでテープの端をカットします 。
- は、ゲルの底にテープの追加レイヤーを追加します。強化テープ、まずゲルがリークを注ぐとき 。
- は、白のクランプでガラスのサンドイッチの両側をクリップします。下にそれぞれの側に 3 つのクリップとクリップ 4 個を追加します 。
- ゲルを注ぐ
- 過硫酸アンモニウム 0.3 g を溶解し、純水で最大 3 mL を希釈して 10% アンモニア過硫酸 (APS) の 3 mL
。 注: AP の 1.2 mL ゲルごと必要です。それを行った後、管を日付します。APS ソリューション 2 週間で有効期限が切れるし、4 で保持する必要があります ° C - 転送の 125 μ Lテトラメチルエチレンジアミン (TEMED) 独立した微量遠心チューブにします
。 注: TEMED は有毒である;PPE を着用、手袋などは眼鏡とラボはコートを処理するたびにします 。
- は、ホヤの瓶を取得し、先の尖った漏斗を削除します。125 mL をメスシリンダーで水を測定し、ボトルに追加。永久的なマーカーとボトルの外側に水のレベルをマークします。水を捨てます。この変更されたホヤの瓶は適切なクリーニング (下記参照) と無期限に再利用できます 。
- は、それが注がれて一度ゲルを置く場所があるのでシンク横にコルク栓をしたリングを設定します。ここでプレートのサンドイッチを配置します。ゲルが注がれている中プレートを座っている場所があるので、流しにコルクを置きます。トップ シンクの縁で休む間、底はコルクで休むので、ゲルは、角度でガラス板サンドイッチに注がれます。ポリアクリルアミド注ぐオフに備えてこれらの領域の下にパッドがあることを確認
- 場所 APS ソリューションと、空と、シンクの反対側 TEMED ソリューションは、ボトルを噴出します。プレートとシンクの側面に井戸の希望の数でよく櫛を配置します。近隣 4 クランプを配置します
。 注: 手順の次のステップは、非常に時間に敏感です。これらの手順を迅速に移動する準備されます。それは重合前にプレートの間混合物を得るために時間の限られた量があります。すべてのコンポーネント (正しいボリューム、ソリューション、ガラス板にプリセット マイクロ ピペット) は、できるだけ早くゲルを注ぎに慎重に配置されます。遅い重合を望まれるかどうか、APS 及び TEMED 濃度を半分にすることができます;ただし、重合時間が必要になります、これ 。
- は、マークされたポイントにホヤの瓶に 20% アクリルアミド ゲル溶液を注ぐ。小さい漏出の場合十分な解決策があるので、マークの線の上の少しのゲル溶液を注ぐ。これは約 120 mL ゲル溶液の 。 同時にホヤの瓶のポリアクリルアミド ゲル溶液に APS の
- 追加 120 μ TEMED と 600 μ。ポリアクリルアミド ゲル溶液に AP の追加 600 μ L をすばやく追加します 。
- には、ホヤの瓶と旋回迅速キャップします。流しに板サンドイッチを配置します 。
- を注ぐを開始します。1-2 分で重合を避けるためにこれだけください。ゆっくりと、しかし着実に、ゲル溶液が均等に出てくるので、ホヤの瓶に圧力を追加します。ソリューションは、ホヤの瓶から不規則な飛散開始した場合ボトルが水増しになるので圧力を解放し、注入を再開します。ゲル溶液はすべての領域をカバー、それが両側のいずれかから漏れていないかどうかを確認するを見る。空気の泡を削除するには、プレートの角度を変更します。泡が上部にあるポップアップ表示し、角度が急な場合は高速に実行されます。引き続きソリューション切欠きの範囲の上部に達したし、切り込みの付いたエッジは、少しあふれているまで注ぐ。すべての空気の泡を削除します
。 注: 場合板サンドイッチ リーク、または十分なゲル溶液がないとソリューションは、プレートの上に到達しない、ゲルを使用することはできません。ゲル重合は、待って、それに応じてきれい 。
- は板サンドイッチによく櫛を追加します。場所 4 クランプ押し井戸の均一な配分を可能にするために櫛にします 。
- はすぐに廃棄物標識ポリアクリルアミドにホヤの瓶の残りのゲル溶液の処分します。Di ではホヤの瓶水を 2 〜 3 回、吹き付けノズルを洗浄し
。 注: ポリアクリルアミドのホヤの瓶の目詰まりを防ぐためにすぐにこのクリーニングを実行することが重要です。ノズル内でも少量の重合が発生すると、次ゲルはもゆっくりではなく正常に注がれます。重合が発生した場合に、ホヤの瓶を破棄します 。
- 過硫酸アンモニウム 0.3 g を溶解し、純水で最大 3 mL を希釈して 10% アンモニア過硫酸 (APS) の 3 mL
- クリーン プレートします
- Acrylamide のゲルを実行
- ゲル重合は中、1 x TBE 連続したバッファーを作る。予 TBE 固体の 17 g を 1 L の純水に溶解します。TBE のすべてが解散するまで、バッファーを振る 。
- プレート サンドイッチからすべてのバインダー クリップを削除します 。
- プレート サンドイッチのすべての端からテープを外し、テープをカットする、かみそりを使用します 。
- クリーンは、ガラス表面からすべての重合ゲルをオフします。残りのゲルをこすり落とすためには、エッジに沿ってかみそりを使用します。ペーパー タオルと可能な限りのポリアクリルアミドの残渣を削除する水で板を拭いてください。余分なアクリルアミドおよび/またはテープはしばしばゲル電気泳動の間に書き込むことができます 。
- 両側均等に押し出すことによってよく櫛を削除します 。
- は、プレート サンドイッチの上部に沿って余分なゲルを遮断するかみそりを使用します。プレートの切り込みの付いたエッジに沿ってスライスします 。
- は、井戸を洗浄し、井戸に残骸を取除く注射器と超純水を使用します。各井戸水で満ちることができれば、過剰な重合ゲルによってブロックされていないことを確認します 。
- 、装置板サンドイッチを所長い板は外側に直面していると切欠きのスペースは内側に直面している 。
- 機器とともにプレート サンドイッチとアルミのクリップにクリップの追加。でも実行を促進するためにプレートの外側に追加します 。 基本のノッチと上部に井戸をカバーするのに十分で、カバーする
- 追加 TBE バッファー。TBE バッファーをフィルター、約 5 ゲルに再利用することができます 。
- 50 w. ゲル電気泳動法を実行して 20 分暖かいプレート
- プレートを温暖化後、井戸をきれいにします。残りのバッファー塩井戸から噴出するのに温泉で注射器や TBE バッファーを使用します。きれいな井戸を確保するためこれを数回を行います。井戸がきれいでない場合は、バンドが争いし、イメージは正しく解釈されません。これは時間がかかることができますが、我々 はそれが良いデータを取得することが不可欠発見した 。
- ブロモフェノールの青 95% ホルムアミドのピペット 5 μ L、両側に外側車線に。これは、同じソリューション、QBO がブロモフェノール ブルー オレンジ g. の代わりに、します。これはゲル画像処理、および DNA をどの程度をカットする上のビジュアルが実行提供されます 。
- の各サンプルを分析する (セクション 2.1.1 で生成された) ゲルの単一の井戸に 3 μ L を追加。すべてのサンプルをロードした後のサンプル解決する 1 分を待つ 。 上部と下部のプラスチック製風呂に
- 入れてキャップ。装置にワイヤーを取り付けます。DNA が下方に実行されるように、それは下部にする必要がありますので、赤は正電荷を示します 。
- まで、ブロモフェノール ブルーの染料フロントが実行接続ワイヤ電源をソースし 50-55 w. 実行する約 3 時間のためのゲルを設定または少なくとも 2/3 ゲル ダウン 。
- ゲルをイメージング
注: このゲルは非常に薄いと扱いにくくすることができます。偉大な注意をリッピングと全体のゲルの損失を防ぐためにする必要があります
。 注: DNA ラベルによってそれ別のゲルの撮像素子を使用して必要があります。このプロトコルは、近赤外蛍光染料を使用して、ゲルのイメージャのサンプルのイメージ投射を行った (材料の表 を参照してください)。プロトコルは、その撮像素子の具体的に書き込まれます。- ブロモフェノール ブルー色素フロントが実行されたとき少なくとも 2/3 ゲル ダウン (〜 28 cm)、電源をオフしてゲルを停止できます。装置およびコルク リング上の場所からゲルを削除します 。
- は、プレートを小さなくさびプレート区切り記号で区切ります。内側に区切り記号を配置をプルアップするノッチのコーナー。注意を払い、過度の力を使用しないでください。切り込みを分割できる場合にあまりにも多くの圧力を適用します 。
- プレート間吸引を外したらは、トップ プレートを慎重に持ち上げ、ゲルはプレートを決定します。ゲルは、底板の棒、トップ プレートをやってのけるし、コルク リング上に配置。ゲルが持ち上げられているトップ プレート上にあるゆっくりと移動し、ゲルは、底板に戻って落ちることがあります。ゲルにも該当しない場合もう一度ゆっくりと移動底板からゲルの残りの部分を引くし、独立したコルク リングにゲルをトップ プレートを配置します 。
- プレートを分割、色素がゲルでは参照してくださいし、ゲルの上下から余分なジェルを取り外します。通常、私たちの構造に 18 または 23 ヌクレオチドのプライマーと 45 ヌクレオチド テンプレートのいずれかを使用がない DNA ブロモフェノール ブルーの染料フロントとゲルの底の間。ゲルの上に染料から垂直方向にカットします。染料とゲルの端との間のスペースはまた DNA を持ってないです。最後に、ゲルでよくスペース下カップル インチにカットします。核酸ゲルの最上部ではありません
。 注: 可能な最小サイズにゲルを切断簡単大幅イメージング デバイスに転送できます。ゲルが大きすぎる場合は、転送中に取り込みやすいです。私たちはしばしばイメージングの前にゲルをトリム、トリミング、ケアが取られなかった場合、関連データが失われることがときに細心の注意を使用してお勧めします。部分に追加データが含まれている削除されたかどうかをチェック、我々 はしばしばデータが失われていないことを確認するゲルの切除部分の追加スキャンを実行します 。
- コートの乾燥を防ぐために水でゲル 。
- 撮像素子表面をきれいにします。タスク ワイパーを使用すると、水とエタノールで表面を拭きます。ゲルの配置場所の表面に水の薄いコートを追加します 。
- 李コリントの湿った表面にゲルの所望の部分を転送
- 削除空気泡で優しく、ゲルからそれらを押すと、タスク ワイパーで拭きます。空気の泡をあまりにもハードにプッシュしてゲルをリッピングする非常に簡単だと、注意を使用します 。
- 画像、メーカーによるとゲル ' s プロトコル。撮像素子の利用可能なソフトウェアを使用してゲルを分析します 。
- ゲルのイメージを作成されている間余分なアクリルアミドゲルの取り外し、洗濯板、および TBE バッファーを再利用をフィルタ リングによって作業スペースをきれいします 。
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Representative Results
全体的な活動 (セクション 2.1、図 1で説明) と定常状態速度論 (セクション 2.1、図 2の結論のノートで説明します) の質的評価の成功ポリアクリルアミド ゲルの分析が表示されます。失敗ポリアクリルアミド ゲル分析している (図 3)。
市販のはしごや分子マーカーを使用しないことに注意してください。時折、我々 は分子マーカーを作成するのに知られていたポリメラーゼ基板組み合わせを使用ただし、別の修正されたヌクレオチドの非常に異なる電気泳動移動度, オリゴヌクレオチドの長さが異なる塩基配列構造の比較を不適切なことを注意してくださいすることが重要です。
図 1: 全体的な活動の質的評価の成功のポリアクリルアミド ゲルの分析の例です。個々 のバンドが明瞭で正規であることに注意してください。バンドは異なる長さのオリゴヌクレオチドを表しますこのゲルは、ポリメラーゼの簡単比較をできます。ないの酵素コントロール レーンが付きます、"-"。活動は製品の両方の長さとが大きい製品に変換される標識プライマーの部分によって判断されます。この分析から、E6 と E5 が最も活発です。E3、E2 が約アクティビティで等しいが、E5、E6 以上少ないと E4、E1 は少なくとも活性酵素。
図 2: 定常状態速度論を用いた定量的解析に成功したゲルの例。バンドがうまく解決され、うまく定義されているに注意してください。オリゴヌクレオチド合成の個々 のステップの定常状態速度定数を測定するには、酵素は (この例では、dCTP); でヌクレオシド三リン酸量の変動と培養です。n だけに注意してください (n + 1) 特異なイベントの定量化を有効に製品が合成されます。
図 3: 全体的な活動の失敗したゲルの例。ゲルは、バンドの目に見えるギャップの結果の処理中に引き裂かれました。ゲルのバンドは、不規則な形状の定量化と分析を難しくに注意してください。
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Discussion
ここでは、DNA ポリメラーゼを介した DNA の合成を特徴付けるアッセイを説明しました。近赤外線標識 DNA プライマーを使用し変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、異なるサイズのオリゴヌクレオチドを解決する、我々 は合成の正確な測定を有効にするオリゴヌクレオチドの単一のヌクレオチドの解像度を取得できます。これらのアプローチは、酵素 (セクション 2.1) の全体の活動を計測するかまたは個々 の手順 (手順 2.1 を次に注意) のミカエリス-メンテン型のパラメーターを測定するために使用できます。私たちの研究室は最近使用したこれらの両方以前進化した酵素9の特徴し同様、合理的設計酵素10。
ここで説明した私たちの試金は非放射性 DNA ラベルの使用で従来の方法によって異なります。歴史的に、放射能は、放射性リン ラベル11,18を使用して得ることができる高い感度のための DNA 合成を追跡に使用されています。残念ながら、処分のコストが高いだけでなく、放射性ラベルの限られた棚の生活は、放射性ラベルの使用禁止。ここでは、分類される DNA は、これらの欠点に苦しまない近赤外蛍光体の使用について述べる。特に、近赤外蛍光染料で我々 は放射能によって分類された dna (未発表結果) と同様の検出限界を参照してください。しかし、目に見える範囲で蛍光染料とできませんでしたと同様の検出限界 (未発表結果) を観察することができます。当社グループは通常、近赤外蛍光物質を含む市販の DNA を使用して、これらの染料はこれらのラベルをインストールに使用することができます設立後合成 5' 変更化学数と互換性が。
近赤外蛍光染料は、単一の実験の 2 つの分類されたオリゴヌクレオチドの合成を監視する複雑なテストを有効にすることができます複数の市販色があることでも有利。放射性ラベルと多成分実験のこれらのタイプは簡単に実行されません。これは可能性が高い直交レプリケーションの実験のために特により複雑な実験の数を有効にします。
この試金および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して任意のアッセイは主に低スループットで注目すべきは、限られたサイズの範囲と同様、これらの実験、電気泳動の実行の技術的な挑戦によって制限されます。塩基の分解能。我々 は、この詳細なプロトコルがこれらのアッセイの技術的課題を克服するためにグループをできることを願っています。特に、アッセイのスループットを制限する一方、近赤外蛍光ラベルの使用は、オートラジオグラフィーを開発するユーザーを必要としない、スループットを向上させるが。しかし、ゲルはまだ 1 日実行することができます実験の数を制限するをセットアップして実行すると、約 4 〜 6 時間かかります。限られた範囲はポリアクリルアミドゲルの電気泳動の機能によるものです。実質的に言えば、これらの制限は、これらの試金は、単一のヌクレオチドの解決が必要な研究の質問に最適を意味します。
最近では、ハイスループット DNA シーケンス19は DNA ポリメラーゼ20,21を特性化の方法としてますます使用されています。これらの試金が、劇的に向上したスループットをシーケンスの先入観とエラー スペクトルに焦点を当てた広範な質問を可能にする注目に値するです。重要なは、高スループット シーケンスことができます多くの並列実験を使用すると、単一のヌクレオチドに基づいて解釈する挑戦ことができます。これは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた酵素試金の高スループット シーケンス、この資料で説明する方法が多くの新しい年のために関連が確実にギャップを埋めるための機会を提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事はだった科学の進歩 (コットレル大学学者賞 #22548) の研究株式会社トライリンク バイオ (ResearchReward グラント #G139) でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33x42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
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