Summary
Este protocolo descreve a caracterização da síntese de DNA polimerase do ADN modificado através da observação de alterações para o infravermelho próximo fluorescente etiquetada DNA usando electroforese em gel e gel de imagem. Géis de acrilamida são utilizados para geração de imagens de alta resolução da separação de curtos ácidos nucleicos, que migram em taxas diferentes dependendo do tamanho.
Abstract
Para qualquer enzima, métodos quantitativos, robustos são necessários para a caracterização das enzimas nativas e engenharia. Para as polimerases de DNA, síntese de DNA pode ser caracterizado usando um em vitro DNA síntese ensaio seguido por eletroforese em gel de poliacrilamida. O objetivo deste ensaio é quantificar a síntese de DNA natural e DNA modificado (M-DNA). Essas abordagens são particularmente úteis para a resolução de oligonucleotídeos com resolução de nucleotídeo único, permitindo a observação dos passos individuais durante a síntese do oligonucleotide enzimática. Esses métodos foram aplicados à avaliação de uma matriz de propriedades bioquímicas e biofísicas tais como a medição das constantes de velocidade de estado estacionário de etapas individuais da síntese de DNA, a taxa de erro de síntese de DNA e afinidade de ligação do DNA. Usando modificado componentes incluindo, mas não limitado a, trifosfatos de nucleósidos modificados (NTP), M-DNA, e/ou mutante DNA polimerase, a utilidade relativa de substrato-DNA polimerase pares podem ser efetivamente avaliados. Aqui, detalhamos o ensaio em si, incluindo as alterações que devem ser feitas para acomodar a primeira demão não tradicionais DNA rotulagem estratégias tais como infravermelha fluorescente etiquetado DNA. Além disso, temos detalhados etapas técnicas cruciais para gel do acrilamido derramando e execução, que pode muitas vezes ser tecnicamente desafiador.
Introduction
As polimerases de DNA realizar preciso e eficiente síntese de DNA e são essenciais para a manutenção da integridade do genoma. A capacidade de sintetizar centenas de nucleotídeos por segundo sem cometer erros também faz ferramentas essenciais de polimerases de DNA na biologia molecular e biotecnologia. No entanto, essas propriedades também limitam as aplicações para substratos de M-DNA; de um modo geral, as polimerases de DNA naturais não podem sintetizar muitos substratos potencialmente valiosos de M-DNA, provavelmente devido à alta pressão seletiva contra o uso de substratos padronizado na vivo. Muitos grupos desenvolveram abordagens evolução dirigida para gerar as polimerases de DNA mutantes capazes de M-DNA síntese1um,2,3,4,5; Estes esforços têm se expandido o utilitário biotecnológico de DNA6,7,8.
Para avaliar a capacidade de polimerases de DNA mutantes de sintetizar DNA-M, nós9,10e outros11,12,13 normalmente usar medições em vitro de DNA atividade de polimerase, que são descritos neste manuscrito. Nesses experimentos, polimerases de DNA são co incubadas com um primer/modelo rotulado frente e verso e substratos de trifosfato de nucleósido; os produtos são avaliados por eletroforese em gel. Dependendo da pergunta específica experimental, polimerases de DNA mutantes, primers modificados, modelos modificados, ou trifosfatos de nucleósidos modificados podem ser usados, permitindo a avaliação sistemática e bioquímica da atividade da enzima mutante.
Historicamente, estes ensaios têm contado com um marcador radioativo 5' para controlar a síntese de DNA; mais comumente, 32P e 33P têm sido utilizados; Normalmente, rotulagem é conseguido usando T4 polinucleotídicas quinase11. No entanto, devido ao tempo de vida finito e custo relativamente alto de rótulos radioativos e sua eliminação segura, nosso grupo, em vez disso usa um sintético 5' infravermelha fluoróforo rotulado de DNA. Usando um gerador de imagens de custo relativamente baixo de gel de infravermelho próximo, temos observado semelhante limites de detecção para estudos prévios, usando rótulos radioativos (resultados não publicados). Podemos ter reproduzido com sucesso observações9, e não observamos nenhuma grande diferença quantitativa com constantes de velocidade medidos anteriormente (resultados não publicados).
Para analisar o tamanho do DNA e, portanto, a extensão da síntese de DNA, contamos com métodos de eletroforese de gel de poliacrilamida originalmente desenvolvidos por Sanger sequenciamento14 antes do advento da eletroforese capilar15. A distância de separação ou mobilidade pode ser usada como uma medida de peso molecular; grande formato, géis de poliacrilamida verticais poderão obter uma resolução de nucleotídeo único, permitindo a observação quantitativa de oligonucleotídeos de DNA de diferentes comprimentos.
Coletivamente, estas experiências são um método robusto para caracterização de polimerase. Devido ao tempo de natureza sensível das reações, preparação e cuidado é necessária para atingir resultados reprodutíveis. Além disso, enquanto o gel do acrilamido é uma forma extremamente eficaz de medir a síntese do ADN, bem como numerosos outras DNA modificando as reações, com resolução de nucleotídeo único, pode ser tecnicamente desafiador. O protocolo aqui Espero que permitirá aos usuários realizar estas experiências, evitando os erros mais comuns.
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Protocol
1. ensaio de atividade
Nota: existem dois tipos típicos de ensaios que muitas vezes são executados para caracterizar as polimerases de DNA usando os métodos descritos aqui. Eles diferem em se eles caracterizam qualitativamente síntese global (englobando muitas etapas da síntese de DNA) ou se focalizam quantitativamente passos individuais. Descrevemos os passos necessários para cada um destes abaixo.
Nota: A montagem de materiais são relativamente complexa, para experiências sensíveis de tempo, recomendamos que todos os materiais são montados previamente. As receitas de todos os componentes críticos do ensaio estão listadas abaixo. Comerciais fornecedores para componentes estão listados na Tabela de materiais.
- 10 x receita do amortecedor de SF (10 x SFB)
Nota: em nossos ensaios, normalmente usamos o truncamento do N-terminal da DNA polimerase I de Thermus aquaticus, comumente conhecido como Stoffel fragmento (SF) 16 , 17. A receita aqui é a reserva preferencial para SF 3 , 13. Outros buffers podem substituir dependendo a DNA-polimerase específica.
Nota: A concentração final de 10 x componentes de tampão de SF são pH de Tris 500mm 8.5, 65 mM MgCl 2, 0,5 mg/mL BSA, 500 mM KCl (s) e água ultrapura. As medições são para 1 mL de tampão de SF, que é suficiente para os ensaios de 100-200, dependendo da escala. O buffer pode ser armazenado por tempo indeterminado a-20 ° C.- Combinar 0,5 mL de 1 M Tris, 65 µ l de 1m MgCl 2, 50 µ l de 10 mg/mL BSA e 0,0373 g de KCl (s) em um 1,5 mL do tubo. Adicione 385 µ l de água ultrapura para chegar a um volume final de 1 mL.
- 1 receita de Buffer de armazenamento x (1 x SB)
Nota: A concentração final de 1 x componentes de reserva são 50 mM Tris pH 7,5, 1 milímetro DTT, 0,6 mM EDTA e 50% de glicerol. A receita faz 20 mL de 1x SB.- Combinar 0,012 g TDT, 100 µ l de EDTA 0,5 M e encher um tubo cónico de 50 mL com 40 mL de 100 mM Tris (pH 7,5) tornar-se 2xSB. Mix vortexing.
- 10 ml da 2 SB x para um novo 50ml cónico tubo e diluir com glicerol pela adição de glicerol de 10 mL para o novo cónico.
- Receita do amortecedor laranja (QBO) extinguem
Nota: quando rótulos radioactivos são usados, os usuários muitas vezes vão empregar azul de bromofenol e/ou xileno cianol como uma tintura de seguimento para o progresso da electroforese. No entanto, estas tinturas serão fracamente fluorescente na região do infravermelho próximo, interferir com o sinal de DNA. Assim, nós usamos laranja G em seu lugar para todas as reações que contêm amostras. Enquanto encontramos Orange G adequado para acompanhamento de gel de carregamento, encontramos G de laranja para ser menos consistente como uma tintura que controla o progresso de eletroforese; assim, corremos vazias faixas contendo bromofenol nas pistas externas do gel que não contém a amostra a fim de acompanhar o progresso de gel.- µ L 950 combinar de formamida 95% com 25 µ l de EDTA 0,5 M e água ultrapura de 25 µ l. Adicione 1 colher de corante laranja de G (~ 10 mg). Mix vortexing.
Cuidado: Formamida é tóxica; usar equipamentos de proteção individual (EPI) como luvas, óculos e jaleco e dispor como resíduos perigosos.
- µ L 950 combinar de formamida 95% com 25 µ l de EDTA 0,5 M e água ultrapura de 25 µ l. Adicione 1 colher de corante laranja de G (~ 10 mg). Mix vortexing.
2. Execução de ensaios
- caracterização qualitativa da atividade global
Nota: para este teste, geralmente mantemos constante concentração de M-PTR e variam de tempo. O objetivo é avaliar as características gerais da proteína ao invés de medir qualquer etapa individual. Para preparar uma reação, um volume igual de dois componentes separados, a mistura de frente e verso (descrito na etapa 2.1.1) e o dNTP mix (descrito na etapa 2.1.2), irá ser preparados separadamente e então combinados para dar o volume final de 49 µ l. A adição de enzima de 50 x 1 µ l irá então iniciar a reação. Pontos de tempo variável podem ser tomados; Normalmente, nós saciar em 0, 5, 15 e 60 min.- Preparação de DNA duplex mix
Nota: O mix de frente e verso é composto de 10 x buffer de SF, do oligonucleotide cartilha, do oligonucleotide modelo e água ultrapura. Volume total adicionado a cada reação é 25 µ l. 1 µ l da enzima será adicionado à mistura mestre imediatamente anterior ao início do experimento.
Nota: Para os nossos ensaios, normalmente usamos um modelo 45-mer e um primer 18-mer ou 23-mer. Enquanto pode ser usado um número de diferentes comprimentos, tendemos a usar este comprimento porque os produtos (variando de 18 nucleotídeos a 45 nucleotídeos) são facilmente resolvidos em um nível de nucleotídeo único usando os protocolos da electroforese do gel de descrito. Como produtos do oligonucleotide aumentam de comprimento, pode ser um desafio para resolver os produtos com resolução de nucleotídeo único.
Nota: Em nossas experiências, usamos um 5 ' rótulo de tintura fluorescente do infravermelho próximo na cordoalha cartilha para observar os produtos da primeira demão. Nós compramos o personalizado oligonucleotides sintetizados tendo essa modificação; no entanto, esta etiqueta pode ser incorporada usando qualquer número de estratégias de rotulagem pós-sintéticos. O oligonucleotide de modelo não é rotulado e então observa-não se usando o gel de tonalizador. Para ambos os oligonucleotides, armazenamos os oligonucleotides em 100 µM em 10mm Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
Nota: Porque estamos observando apenas o primer, um excesso de dupla de modelo é usado para garantir que todos os iniciadores (a espécie de DNA que está sendo observada) são recozidos para o modelo. A concentração final de frente e verso nesta reação é de 40 nM.
Nota: Corantes fluorescentes infravermelha são muitas vezes sensíveis a um pouco de luz; Quando possível, nós cobrimos o primer (e qualquer solução contendo o primer) com papel alumínio. Isso inclui o gel de poliacrilamida, enquanto está em execução.
Nota: Abaixo está um exemplo representativo da síntese de 2 ' F M-DNA.- Diluir primer 1 e modelo 1 (ver Tabela de materiais para sequência) de 1 µM em água ultrapura.
- Para cada reação de ensaio, em tubos separados, combine 5 µ l de 10x buffer de SF, 2 µ l de 1 µM da primeira demão 1, 4 µ l de 1 µM modelo 1 e 13 µ l de água ultrapura em tubos compatíveis com um termociclador.
- Recoze o duplex em um thermocycler usando o seguinte programa: 98 ° C por 2 min, 70 ° C por 5 min, 50 ° C por 5 min, 40 ° C por 5 min, segure a 25 ° C. O programa específico pode variar dependendo da temperatura do recozimento da primeira demão/modelo de frente e verso. Normalmente, nós preferimos incluir pelo menos um passo 5 min à temperatura de recozimento e depois outro passo 5 min à temperatura 5-10 graus abaixo da temperatura de recozimento.
- Preparação da mistura de 2 x dNTP
Nota: dependendo do experimento, é possível usar a variável dNTPs e concentrações de dNTPs. Normalmente, usamos 50-200 µM na reação.- Prepare uma solução de 25 µ l contendo 100 µ m de cada 2 ' F-NTP. Armazenar o PTR-M a 100 mM.
- Preparação de 50 x diluição da proteína
Nota: para o armazenamento de longo prazo, as enzimas devem ser mantidas a-20 ° C em 1xSB. Quando retirados do congelador-20 ° C, as enzimas devem ser mantidas no gelo em todos os momentos antes da adição à mistura de mestre. Diluições da enzima devem ser feitas frescas do estoque concentrado cada dia. O estoque de enzima concentrada deve ser retornado para o congelador-20 ° C imediatamente após a utilização.
Nota: Porque avaliamos principalmente as polimerases de DNA mutantes, só usamos enzimas que foram expressas e purificadas em nosso laboratório usando métodos estabelecidos 9 , 10. Por polymerases adquiridos comercialmente, os usuários devem ser cuidadosos de buffers ideais para diferentes proteínas e a sua compatibilidade com os buffers descritos neste documento.
Nota: Concentrações de enzima irão variar para cada experimento. Aqui, nós mostramos um exemplo representativo para 2 ' síntese de DNA-F.- Para fazer uma solução de enzima 10 nM, diluir 1 µ l da enzima into 1 x SB tornar-se uma concentração de enzima final 50 x. A concentração da solução 50 x deve ser 500 nM. Por exemplo, se a concentração da enzima estoque 50 µM, adicionar 1 enzima de estoque µ l a 99 µ l 1 x SB
Nota: Uma vez que a enzima é normalmente armazenada em glicerol 50%, a solução é bastante viscosa. Mesmo se usando pipetas altamente precisas, não recomendamos pipetagem menos de 0.5 µ l, considerando a importância da exatidão e precisão durante a diluição do enzima.
- Para fazer uma solução de enzima 10 nM, diluir 1 µ l da enzima into 1 x SB tornar-se uma concentração de enzima final 50 x. A concentração da solução 50 x deve ser 500 nM. Por exemplo, se a concentração da enzima estoque 50 µM, adicionar 1 enzima de estoque µ l a 99 µ l 1 x SB
- Início do ensaio
- definir a temperatura do banho seco a 50 ° C.
- Adicionar 24 μL de recozido duplex mix (consulte a etapa 2.1.1) de 25 µ l de 2 x dNTPs (consulte a etapa 2.1.2).
- Remover 9,8 µ l da mistura em passo 2.1.4.2 e adicionar 20 µ l de QBO (consulte a seção 1.3 para receita). Essa alíquota serve como um " sem enzima " controle e devem ser obtidas para cada execução.
- Adicionar 0,8 µ l da enzima x 50 (consulte a etapa 2.1.3.1) à mistura duplex/dNTP. Pipetar para cima e para baixo com uma micropipeta de grande volume para homogeneizar completamente.
- Após 5, 15 e 60 min, saciar a reação de remoção de 10 µ l de cada solução de reação e adicionando a um tubo de microcentrifugadora contendo 20 µ l QBO (descrito na seção 1.3).
- Uma vez saciada, reações podem ser armazenadas sob folha indefinidamente em 4 ° C ou a -20 ° C.
Nota: Para a caracterização quantitativa dos passos individuais da síntese de DNA-M, um ensaio muito semelhante pode ser executado para quantitativamente obter parâmetros de Michaelis-Menten. Este ensaio utiliza todos os materiais mesmos. Parâmetros de Michaelis-Menten podem ser medidos para o dNTP; Neste caso, a diferença mais significativa é que, em vez de adicionando a mistura de frente e verso para dNTP mix, adiciona a mistura frente e verso com enzima para uma série de 2 x dNTP de soluções. Da mesma forma, os parâmetros de Michaelis-Menten podem ser medidos para duplex de DNA. Condições específicas devem ser atendidas para satisfazer os pressupostos necessários para a utilização da equação de Michaelis-Menten. Nestas condições e a mecânica básica do ensaio, é bem explicada em um anterior métodos do artigo 11.
- Preparação de DNA duplex mix
3. Electroforese do gel
Nota: porque derramando o gel é sensível do tempo, todos os materiais são montados previamente. As receitas de todos os componentes críticos do ensaio estão listadas abaixo; fornecedores estão listados na Tabela de materiais.
- Preparando acrilamida para gel do acrilamido 20%.
Nota: Esta receita faz 1 L de mistura de acrilamida; aproximadamente 120 mL desta solução é usado por gel. Armazene esta solução à temperatura ambiente sob folha por até um ano.
Cuidado: Poliacrilamida é neurotóxica. É importante usar luvas e avental durante todas as etapas de gel de derramar. Se poliacrilamida Obtém as luvas, substitua imediatamente as luvas. Se a acrilamida não é polimerizada, coloque os materiais contaminados em um saco de resíduos de poliacrilamida rotulado.
Nota: Pré-misturados 40% acrilamida contendo acrilamida 38.67% e 1,33% bis-acrilamida para um monômero à relação de cross-linker de 29:1 foi usada no presente protocolo.- Pesa 17 g de pó TBE pré-misturados. Pesa seis porções separadas de 70 g de ureia (total de 420g).
Nota: A ureia deve ser adicionada em parcelas. Achamos melhor dividi-la em seis porções. - Configurar num copo de plástico de 2L em uma placa de agitação. Adicione uma única haste de agita grande para o copo. Cubra o copo com uma folha quando mistura para evitar salpicos.
- Adicionar 500 mL de solução a 40% do acrilamido em béquer. Certifique-se de que a solução está se mexendo.
- Add anteriormente pesava saída TBE. Adicione uma alíquota de ureia. Permitir que a solução misturar. Ureia dissolve-se lentamente e pode parecer confuso e branco em cima da adição inicial. Adicione lentamente as restantes alíquotas de ureia na mistura durante a próxima hora. Deixe a solução misture até é completamente transparente e incolor.
Nota: Normalmente, deixe isto agitar a noite. Se a solução ainda não é dissolvida, adicionar pequenas alíquotas de água e aguarde a ureia a dissolver-se. - a adição de ureia aumentará o volume perto de 1 L. adicionar água para aumentar o volume de exatamente 1 L.
- Loja em uma garrafa de vidro matizado de 1L ou tampa do frasco de vidro com papel alumínio.
- Pesa 17 g de pó TBE pré-misturados. Pesa seis porções separadas de 70 g de ureia (total de 420g).
- Derramamento do gel do acrilamido.
Nota: Ao manusear placas de vidro, tenha cuidado para evitar o contato entre as placas de vidro e qualquer superfície dura. Isto é particularmente importante, em que o manuseio indevido pode causar pequenas fissuras no vidro; Estas rachaduras não podem ser visíveis até que o gel está sendo executado, que ocorre a uma temperatura mais elevada. Nós usamos anéis de cortiça para evitar esse contato indesejado.- Clean placas placas de gel
- adquirir dois 33 x 42 cm, um entalhe e uma placa unnotched. Coloque as placas nos anéis de cortiça separada.
- Placas de enxaguar abundantemente com água e sabão. Certifique-se de que não existem marcas de sabão ou gel de pontos deixados para trás.
- Anote qual lado dos grânulos placa menos água. Deste lado é o gel voltado para o lado.
Nota: Se o gel é executado do outro lado da placa, pode fazer a transferência de gel desafiador.
- Secar as placas
- usar toalhas de papel para secar as duas faces de cada placa.
- Utilização delicada tarefa limpa para-brisas para secar áreas remanescentes. Atenção especial às bordas das placas, onde será aplicada fita.
- Enxaguar as placas de vidro com ~ 70% de etanol e limpe com limpa para-brisas tarefa.
- Verifique se que existem sem fibras de toalha de papel ou gotículas de água. Estes podem causar bolhas quando derramar o gel.
- Adicionar espaçadores
- adquirir espaçadores de 0,75 mm. Executar com luvas dedos debaixo d'água DI e molhe suavemente os espaçadores com os dedos com a luva. Placa
- espaçadores de lugar ao longo das bordas longas do entalhado. Limpe toda a água que é espirrada no resto das placas. Certifique-se de espaçadores são alinhados com a placa de vidro e não pendurado na borda.
- Selo gel de
- Calce luvas secas. Seque as bordas do vidro novamente com limpadores de delicada tarefa.
- Alinhe a placa unnotched superior acima da placa entalhada e lentamente mais baixo para pressionar as placas contra o outro. Verifique novamente para ter certeza de que as bordas de todas as placas estão alinhadas.
- Usando gel de fita, coloque a fita em todas as bordas, exceto a parte superior. Certifique-se de fita é alinhada uniformemente e selada hermeticamente. Fita pode ser aplicada em um movimento, ou cada lado pode ser feito individualmente. Corte as extremidades da fita com uma navalha.
- Adicionar uma camada adicional de fita para o fundo do gel. Quanto mais a fita, o menos provável o gel irá vazar quando deitar.
- Clip dos lados do vidro sanduíche com branca. Adicionar 3 clipes para cada lado e 4 clipes para o fundo.
- Derramar o gel
- faça 3 mL de solução de persulfato de amónio de 10% (APS), persulfato de amónio 0,3 g de dissolução e diluir em água ultrapura até 3 mL.
Nota: 1,2 mL de APS é necessária por gel. Data do tubo depois de fazer isso. Solução APS expira em 2 semanas e deve ser mantida em 4 ° C. - Transferir 125 µ l de tempted (TEMED) para um tubo de microcentrifugadora separada.
Nota: TEMED é tóxico; usar o EPI como luvas, óculos e laboratório revestir sempre que manipulação. - Adquirir uma garrafa de água e retire o funil pontiagudo. Meça 125 mL de água em uma proveta graduada e adicione ao frasco. Marque o nível de água do lado de fora da garrafa com um marcador permanente. Descarte a água. Esta garrafa de esguicho modificados pode ser reutilizada indefinidamente com a limpeza apropriada (veja abaixo).
- Configurar os arrolhado anéis ao lado da pia para que haja um lugar para colocar o gel, uma vez que é derramado. Coloque o sanduíche de placa aqui. Colocar uma rolha na pia, então não há um lugar para sentar as placas enquanto o gel está sendo servido. O gel será colocado no sanduíche de placa de vidro em um ângulo, por fundo irá descansar na rolha, enquanto o top vai descansar à beira da pia. Verifique se há almofadas debaixo dessas áreas, no caso de poliacrilamida derrama fora Solução de
- lugar APS e TEMED solução do outro lado da pia, com o vazio fofa garrafa. Coloque o pente bem com o número desejado de poços ao lado da pia com as placas. Coloque 4 grampos nas proximidades.
Nota: O próximo passo no processo é tempo muito sensível. Prepare-se mover-se rapidamente através desses passos. Há uma quantidade limitada de tempo para obter a mistura entre as placas antes que se polimeriza. Todos os componentes (micropipetas predefinidos para o volume correcto, soluções, placas de vidro) são cuidadosamente arranjados para derramar o gel tão rapidamente quanto possível. Se uma polimerização mais lenta é desejada, APS e TEMED concentrações podem ser reduzido para metade; Isso exigirá, no entanto, um tempo de polimerização. - Despeje a solução de gel do acrilamido 20% a garrafa de esguicho ao ponto marcado. Despeje a solução de gel um pouco mais acima a linha marcada, para que haja suficiente solução no caso de pequenos vazamentos. Isto é aproximadamente 120 mL de solução de gel.
- Adicionar 120 µ l de TEMED e 600 µ l de APS para a solução de gel de poliacrilamida na garrafa esguicho ao mesmo tempo. Adicionar rapidamente um adicional µ 600 l de APS para a solução de gel de polyacrylamide.
- Cap rapidamente a garrafa de esguicho e redemoinho. Coloque o sanduíche de prato na pia.
- Começar a derramar. Isto deve levar apenas 1-2 min para evitar a polimerização. Lentamente, mas firmemente, adicione pressão no frasco de esguicho, assim a solução de gel sai uniformemente. Se a solução começa salpicos irregularmente da garrafa esguicho, liberar a pressão para que a garrafa torna-se inflado e retomar a derramar. Cuidado garantir que a solução de gel está cobrindo todas as áreas, e não está vazando de qualquer um dos lados. Para remover as bolhas de ar, mude o ângulo das placas. As bolhas irão aparecer no topo e irão correr mais rápido se o ângulo for mais acentuado. Continue derramando até a solução atingiu o topo da área entalhado e ligeiramente está transbordando a borda entalhada. Remover todas as bolhas de ar.
Nota: Se o sanduíche de placa vazamentos, ou não há suficiente solução de gel e a solução não alcança o topo das placas, o gel não pode ser usado. Espere até que o gel tem polimerizado e limpar adequadamente. - Adicionar o pente bem para o sanduíche de placa. Coloque 4 grampos no pente para pressionar para baixo e permitir uma distribuição uniforme dos poços.
- Deitar rapidamente a solução de gel restantes na garrafa esguicho no lixo de poliacrilamida rotulada. Enxaguar fora a garrafa de esguicho com DI água 2 - 3 vezes, através do bocal do esguicho.
Nota: É importante realizar esta limpeza rapidamente para evitar entupimento na garrafa esguicho poliacrilamida. Se até mesmo uma pequena quantidade de polimerização ocorre dentro do bocal, o gel próximo será colocado muito lentamente e não com sucesso. Descartar o frasco de esguicho se polimerização ocorre.
- faça 3 mL de solução de persulfato de amónio de 10% (APS), persulfato de amónio 0,3 g de dissolução e diluir em água ultrapura até 3 mL.
- Clean placas placas de gel
- Executando o gel do acrilamido
- enquanto gel é ser polimerizado, fazer 1 buffer de execução x TBE. Dissolva 17 g de sólido pré-misturado TBE em 1 L de água ultrapura. Agitar o tampão até todos TBE é dissolvido.
- Retire todos os grampos da pasta o sanduíche de placa.
- Usar uma navalha para cortar a fita e remova a fita de todas as bordas do sanduíche placa.
- Limpe fora todo o gel polimerizado das superfícies de vidro. Use uma lâmina de barbear ao longo das bordas para raspar o gel restante. Limpe as placas com toalhas de papel e água para remover tanto resíduo de poliacrilamida quanto possível. Acrilamida em excesso e/ou fita pode queimar muitas vezes durante a electroforese do gel.
- Remover o pente bem empurrando-o uniformemente em ambos os lados.
- Usar uma navalha para cortar o excesso de gel na parte superior do sanduíche placa. Fatia na borda da ranhura da placa.
- Usar uma seringa e DI água para lavar os poços e remover os restos dos poços. Certifique-se de cada poço pode ser enchido com água e não é bloqueado pelo excesso de gel polimerizado.
- Colocar o sanduíche de placa para o aparelho, para que a placa mais é virada para fora, e o espaço entalhado está enfrentando para dentro.
- Add clips para cortar a placa de sanduíche e alumínio juntamente com o aparelho. Adicionar para fora da placa para promover funcionando mesmo. Amortecedor de TBE adicionar
- para cobrir os base entalhes e apenas o suficiente para cobrir os poços no topo. Amortecedor de TBE pode ser filtrado e reutilizado para aproximadamente 5 géis.
- Placas quentes por 20 min, executando a eletroforese em gel de 50 w.
- Após o aquecimento das placas, limpar os poços. Use uma seringa e o amortecedor de TBE nos banhos para esguichar os sais restantes de reserva dos poços. Fazer este diversas vezes para garantir limpos poços. Se os poços não são limpos, as bandas irão desgastar e a imagem não será interpretável. Embora isso pode ser demorado, encontrámo-lo imperativo para obter bons dados.
- Para a lane ultraperiférica em ambos os lados, pipetar 5 µ l de formamida 95% com o azul de bromofenol. Esta é a mesma solução como QBO, mas com bromofenol no lugar de Orange G. Isto proporcionará um visual na onde cortar o gel para a imagem latente e quão baixo o DNA tem executar.
- Para cada amostra a ser analisada (gerado na seção 2.1.1), adicionar 3 µ l para um único poço do gel. Depois de carregar todas as amostras, esperar 1 min para amostras resolver.
- Colocar as tampas na parte superior e inferior de banhos de plástico. Prenda os fios para o aparelho. Vermelho indica a carga elétrica positiva, portanto, deve ser na parte inferior para que o DNA seja executado para baixo.
- Fios de anexar a uma potência de fonte e defina a 50-55 W. Execute o gel por aproximadamente 3 h ou até o bromofenol frente corante azul foi executado pelo menos 2/3 para baixo o gel.
- Imaging o gel
Nota: Este gel é extremamente fino e pode ser difícil de lidar. Grande cuidado deve ser tomado para evitar rasgar e perda do gel todo.
Nota: dependendo do rótulo de DNA, pode exigir usando gel de diferentes geradores de imagens. Este protocolo usa corantes fluorescentes infravermelha e imagem latente de amostras foi realizada em um gel de imagem (consulte a Tabela de materiais). O protocolo é escrito especificamente para aquele imager.- Quando a frente do corante azul de bromofenol tem executado pelo menos 2/3 para baixo o gel (~ 28 cm), o gel pode ser interrompido desligando-se o poder. Retire o gel do aparelho e lugar nos anéis de cortiça.
- Separar as placas com um separador de placa pequena cunha. Colocar o separador no interior canto das partes vazadas para puxar para cima. Tenha cuidado e não use força excessiva; os entalhes podem quebrar se muita pressão é aplicada.
- , Uma vez que a sucção entre as placas são liberados, cuidadosamente levante a placa superior e determinar qual placa o gel é em. Se o gel adere na placa inferior, retire a placa superior e colocar no anel de cortiça. Se o gel na placa superior sendo levantada, movem-se lentamente e o gel pode recuar para a placa de fundo. Se o gel não cai, novamente se movem lentamente puxar a parte restante do gel da placa inferior e coloque a placa superior com o gel em um anel de cortiça separada.
- , Uma vez que as placas são separadas, ver onde está o corante em gel e remover o excesso de gel da parte superior e inferior do gel. Normalmente, com nossas construções, não usando um primer de nucleotídeo 18 ou 23 e um modelo de 45 nucleotídeo, há nenhum DNA entre a frente de corante azul de bromofenol e parte inferior do gel. Corte verticalmente da tintura para o topo do gel. Os espaços entre as bordas do gel e a tinta também não têm nenhum DNA. Por último, corte um pouco abaixo do espaço bem no gel. Não há nenhum ácidos nucleicos no topo do gel.
Nota: O gel para o menor possível tamanho de corte facilita significativamente a transferir para o dispositivo de imagem. Se o gel é muito grande, é mais suscetível a rasgar durante a transferência. Enquanto nós muitas vezes aparar o gel antes da imagem latente, recomendamos extrema cautela quando aparar como dados relevantes podem ser perdidos se não tomar cuidado. Para verificar se removido porções contenham dados adicionais, muitas vezes vamos realizar uma verificação adicional das porções excisadas do gel para garantir que os dados não foram perdidos. - Casaco o gel com água para evitar ressecamento.
- Limpe a superfície do tonalizador. Usando limpadores de tarefa, limpe a superfície com água e etanol. Adicionar uma camada fina de água para a superfície onde será colocado o gel.
- Transferir a parte desejada de gel na superfície molhada do Li-cor.
- Remover ar bolhas delicadamente pressionando-os para fora do gel e limpando com um limpador de tarefa. Tenha cuidado, pois é muito fácil de arrancar o gel por exigindo demais as bolhas de ar. O gel de acordo com o fabricante de imagem
- ' protocolos s. Analisar o gel usando software disponível para o imager.
- Enquanto o gel está sendo fotografado, limpar o espaço de trabalho, retirar o gel do acrilamido em excesso, lavar pratos, e filtrando o amortecedor de TBE para ser reutilizado.
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Representative Results
Uma análise do gel de polyacrylamide bem sucedida de uma caracterização qualitativa da atividade global (descrito na seção 2.1, Figura 1) e da cinética do estado estacionário (descrito na observação na conclusão da seção 2.1, Figura 2) são mostrados. Uma análise do gel de polyacrylamide vencida também é mostrada (Figura 3).
Observe que não há escada comercialmente disponível ou marcador molecular é usado. Ocasionalmente, usaremos uma combinação conhecida do polymerase-substrato para criar um marcador molecular; no entanto, é importante notar que os nucleotídeos modificados diferentes têm diferentes mobilidades eletroforética, fazendo a comparação dos oligonucleotides da estrutura de nucleótidos diferentes mas mesmo comprimento inadequado.
Figura 1: exemplo de análise bem sucedida do gel de polyacrylamide de uma caracterização qualitativa de actividade geral. Observe que as bandas individuais são bem definidos e regulares. As bandas representam oligonucleotides comprimentos diferentes; Este gel permite uma fácil comparação entre as polimerases. A pista sem controle de enzima é indicada com um "-". Atividade é julgada por ambos o comprimento dos produtos e a porção do primer etiquetado que é convertido em produtos de maiores. A partir desta análise, E6 e E5 são os mais ativos. E3 e E2 são aproximadamente iguais em atividade, mas menos de E6 ou E5, e E4 e E1 são as enzimas menos ativas.
Figura 2: exemplo de sucesso gel para análise quantitativa usando cinética do estado estacionário. Note que as bandas são bem resolvidas e bem definidas. Para medir constantes de velocidade de estado estacionário de etapas individuais em síntese do oligonucleotide, uma enzima é incubada com quantidades variadas de trifosfato de nucleósido (no caso, dCTP); Observe que somente o n e (n + 1) produtos são sintetizados permitindo a quantificação do evento singular.
Figura 3: exemplo de um gel sem sucesso para a atividade global. O gel foi rasgado durante a manipulação, resultando em falhas visíveis nas bandas. Observe que as bandas de gel são formato irregular, tornando difícil a quantificação e análise.
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Discussion
Aqui, descrevemos um ensaio para caracterizar a síntese de DNA polimerase-mediada de M-DNA. Usando primers de DNA etiquetadas infravermelha, e usando a eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturação para resolver oligonucleotides diferente tamanhos, podemos obter resolução de nucleotídeo único no oligonucleotides, permitindo uma medição precisa da síntese. Estas abordagens podem ser usadas para medir também a actividade global da enzima (seção 2.1) ou para medir os parâmetros de Michaelis-Menten de etapas individuais (nota seguindo passo 2.1). Nosso laboratório tem usado recentemente para ambos caracterizar enzimas anteriormente evoluída9 , bem como projetado racionalmente enzimas10.
Nossos ensaios aqui descritos diferem dos métodos anteriores em termos de um rótulo de DNA não-radioativo. Historicamente, radioactividade tem sido usada para controlar a síntese de DNA devido à alta sensibilidade que pode ser obtida usando rótulos de fósforo radioativo11,18. Infelizmente, o alto custo de eliminação, bem como a vida útil limitada de rótulos radioactivos podem fazer o uso de etiquetas radioativos proibitivo. Aqui, descrevemos o uso do infravermelho próximo fluoróforo rotulado de DNA, que não sofrem estas desvantagens. Notavelmente, com corantes fluorescentes de infravermelho próximo vemos semelhantes limites de detecção de DNA marcado radioactivamente (resultados não publicados). No entanto, com corantes fluorescentes na faixa visível, não fomos capazes de observar os limites de detecção similar (resultados não publicados). Enquanto nosso grupo normalmente usa DNA preparado comercialmente rolamento fluorophores infravermelho próximo, estes corantes são compatíveis com um número de estabelecida pós-síntese 5' químicas modificação que pode ser usado para instalar esses rótulos.
Corantes fluorescentes infravermelha também são vantajosos em que existem várias cores disponíveis comercialmente, que podem permitir experiências mais complexas que monitoram a síntese dos dois oligonucleotídeos etiquetados em uma única experiência. Com rótulos radioativos, estes tipos de experimentos multicomponentes não são facilmente executados. Isto provavelmente irá permitir uma série de experimentos mais complexos, particularmente para experimentos de replicação ortogonais.
Este ensaio e qualquer ensaio utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturação, principalmente é limitada pelo desafio técnico da execução da eletroforese, a baixa produtividade destas experiências, bem como os intervalos de tamanho limitado são observáveis no resolução de nucleotídeo único. Esperamos que este protocolo detalhado permite que grupos de superar os desafios técnicos estes ensaios. Notavelmente, enquanto a taxa de transferência do ensaio é limitar, o uso de etiquetas fluorescentes infravermelha aumenta a taxa de transferência, como não exige ao usuário desenvolver um autoradiograph. No entanto, o gel ainda leva cerca de 4-6 h para configurar e executar, limitando o número de experimentos que podem ser executados por dia. A gama limitada é causada pela capacidades eletroforética de poliacrilamida. Praticamente falando, essas limitações significam que estes ensaios são melhores para perguntas de pesquisa focada que exigem resolução de nucleotídeo único.
Recentemente, alta taxa de transferência de sequenciamento de DNA19 tem sido usada cada vez mais como um método de caracterizar o DNA polymerases20,21. Estes ensaios são notáveis por sua taxa de transferência dramaticamente aumentada, que permite que perguntas mais amplas, focadas na sequência polarizações e espectros de erro. Importante, enquanto o sequenciamento de alto rendimento pode ativar muitas experiências paralelas, isso pode ser um desafio para interpretar em uma base de nucleotídeo único. Isso proporciona uma excelente oportunidade para ensaios enzimáticos, empregando eletroforese em gel de poliacrilamida para preencher as lacunas no sequenciamento de alto rendimento, garantindo que os métodos descritos neste artigo são relevantes para muitos anos vindouros.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela corporação de pesquisa para o avanço científico (Cottrell faculdade Scholar Award #22548) e por TriLink biotecnologias (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33x42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
