Summary
Bu iletişim kuralı DNA polimeraz yakın kızılötesi fluorescently etiketli DNA Jel Elektroforez ve jel görüntüleme kullanarak değişiklikleri gözlem yoluyla değiştirilmiş DNA sentezi karakterizasyonu açıklar. Akrilamid jelleri yüksek kararlılık düşsel boyutuna bağlı olarak farklı fiyatlara geçiş kısa nükleik asitler ayrılması için kullanılır.
Abstract
Herhangi bir enzim için sağlam, nicel yöntemler hem yerli hem de mühendislik enzimleri karakterizasyonu için gereklidir. DNA polimeraz için DNA sentezi polyacrylamide Jel Elektroforez tarafından takip bir vitro DNA sentez yöntemi kullanarak karakterize edilebilir. Bu tahlil doğal DNA ve değiştirilmiş DNA (M-DNA) sentezi ölçmek için hedeftir. Bu yaklaşımlar ile tek nükleotid kararlılık, enzimatik Oligonükleotid sentezi sırasında tek tek adımları gözlem etkinleştirme oligonucleotides çözmek için özellikle yararlıdır. Bu yöntemleri bir dizi biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri gibi kararlı durum hızı sabitler tek tek adımları DNA sentezi, DNA sentezi ve DNA bağlama benzeşme hata oranı ölçümü değerlendirilmesi için uygulandı. Dahil ancak bununla sınırlı olmamak üzere, değiştirilmiş nükleozit trifosfatlardan (NTP), M-DNA, ve/veya mutant DNA polimeraz, çift etkili bir şekilde değerlendirilebilir substrat DNA polimeraz göreli yarar bileşenleri kullanılarak değiştirilebilir. Burada, geleneksel olmayan astar DNA stratejileri yakın-kızılötesi fluorescently DNA etiketli gibi etiketleme karşılamak için yapılması gereken değişiklikleri içeren tahlil ayrıntılı. Ayrıca, dökme Akrilamid jel için çok önemli teknik adımları ayrıntılı olması ve çalışan, hangi sık sık teknik olarak zor olabilir.
Introduction
DNA polimeraz doğru ve etkili DNA sentezi gerçekleştirir ve genom bütünlüğünü korumak için gereklidir. Nükleotit saniyede yüzlerce hata yapmadan sentez yeteneği Ayrıca moleküler biyoloji ve biyoteknoloji DNA polimerazlar temel araçları sağlar. Ancak, bu özellikler de M-DNA yüzeylerde uygulamalarda sınırı; Genel olarak, doğal DNA polimerazlar birçok potansiyel olarak değerli M-DNA yüzeylerde, büyük olasılıkla nedeniyle standart olmayan yüzeylerde vivo içindekullanarak karşı yüksek seçici basınç için sentez olamaz. Birçok grup mutant DNA polimerazlar M-DNA sentezi1a,2,3,4,5/ yetenekli üretmeye yönlendirilmiş evrim yaklaşımlar geliştirdik; Bu çabalar DNA6,7,8Biyoteknolojik yarar genişletmiştir.
Mutant DNA polimerazlar M-DNA, sentez yeteneği değerlendirmek için biz9,10ve diğer11,12,13 genellikle DNA'ın vitro ölçümler kullanın polimeraz etkinlik, bu el yazması açıklanmıştır. Bu deneylerde, DNA polimerazlar bir etiketli astar/şablonu çift yönlü ve nükleozit trifosfat yüzeyler ile birlikte inkübe; Ürünler Jel Elektroforez tarafından değerlendirilir. Deneysel sorularınıza, mutant DNA polimeraz, değiştirilmiş astar bağlı olarak, değiştirilen şablonlar veya değiştirilmiş nükleozit trifosfatlardan, sistematik biyokimyasal değerlendirme mutant enzim aktivitesinin etkinleştirme kullanılabilir.
Tarihsel olarak, bu deneyleri DNA sentezi izlemek için bir 5' radyoaktif etikette yararlanmıştır; En çok 32P ve 33P kullanılmıştır; genellikle, etiketleme T4 polinükleotit kinaz11kullanarak elde edilir. Ancak, sonlu yaşam ömrü ve radyoaktif etiketleri ve güvenli ellerinde nispeten yüksek maliyet nedeniyle, bizim grup yerine sentetik 5' yakın kızılötesi fluorophore DNA etiketli kullanır. Nispeten düşük maliyetli yakın kızılötesi jel Imager kullanarak, önceki çalışmalar radyoaktif etiketleri (yayınlanmamış sonuçları) kullanarak benzer algılama sınırları gözlemledim. Başarıyla gözlemler9yeniden oluşturduktan ve biz daha önce ölçülen hızı sabitler (yayınlanmamış sonuçları) ile herhangi bir büyük nicel fark gözlemledim değil.
DNA boyutunu ve böylece, DNA sentezi ölçüde çözümlemek için orijinal Sanger sıralama14 Kapiler Elektroforez15gelişiyle önce için gelişmiş polyacrylamide Jel Elektroforez yöntemleri güveniyor. Ayırma ve hareket etme mesafe moleküler ağırlık ölçüsü kullanılabilir; geniş format, dikey polyacrylamide jeller DNA oligonucleotides değişen uzunlukları nicel gözlem etkinleştirme tek nükleotid çözünürlük elde edebilirsiniz.
Toplu olarak, bu deneyler polimeraz karakterizasyonu için sağlam bir yöntemdir. Zaman nedeniyle hassas doğası reaksiyonlar, hazırlık ve bakım tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek gereklidir. Ayrıca, Akrilamid jel DNA sentezi yanı sıra çok sayıda diğer DNA değiştirme reaksiyonları, tek nükleotid çözünürlükle ölçmek için son derece etkili bir yol olsa da teknik olarak zor olabilir. İletişim kuralı burada Umarım kullanıcıların en yaygın hatalardan kaçınırken bu deneyleri gerçekleştirmeye olanak verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. faaliyet tahlil
Not: Burada açıklanan yöntemleri kullanarak DNA polimerazlar karakterize etmek için sık sık çalıştırılır deneyleri iki tipik türü vardır. İster niteliksel genel sentez (DNA sentezi birçok adımları kapsayan) karakterize veya olup kantitatif bireysel adımlar üzerinde odaklanmak farklıdırlar. Biz gerekli adımları bunlar için aşağıda açıklanmaktadır.
Not: malzeme montaj zaman duyarlı deneyler için oldukça karmaşık olduğu için tüm malzemeler önceden monte öneririz. Testin tüm kritik bileşenlerinin tarifleri aşağıda listelenmiştir. Bileşenler için ticari tedarikçiler Malzemeler tablo listelenir.
- 10 x SF arabellek tarifi (10 x SFB)
Not: bizim deneyleri genellikle N-terminal kesme kullanır DNA polimeraz ben Thermus aquaticus Stoffel bilinen, (SF) 16 parçası , 17. Burada SF 3 , 13 için tercih edilen arabellek reçetedir. Diğer arabellekleri bağlı olarak belirli DNA polimeraz yerine olabilir.
Not: 10 x SF arabellek bileşenleri son konsantrasyonu vardır 500 mM Tris pH 8,5, 65 mM MgCl 2, 0,5 mg/mL BSA, 500 mM KCl (s) ve ultrasaf su. Ölçümler ölçek bağlı olarak 100-200 deneyleri için yeterlidir SF arabelleği 1 mL içindir. Arabellek süresiz-20 ° C'de saklanabilir- Birleştirme 0.5 mL 1 m Tris, 1 M MgCl 2 65 µL, 10 mg/mL BSA 50 µL ve KCl (s) 0.0373 g 1.5 ml tüp. 385 µL son hacim 1 ml ulaşmak için ultrasaf su ekle.
- 1 x depolama arabellek tarifi (1 x SB)
Not: 1 x arabellek bileşenleri son konsantrasyonu 50 mM Tris pH 7.5, 1 mM DTT, 0.6 mM EDTA ve % 50 gliserol vardır. Tarifte 20 mL 1 x SB yapar.- 0.012 g DTT, 0,5 M EDTA, 100 µL birleştirmek ve bir 50 mL konik tüp 100 mM Tris (pH 7.5) 2xSB yapmak için 40 mL ile doldurulması. Vortexing tarafından Mix.
- Yeni 50 mL konik tüp ve gliserol ile 10 mL gliserol yeni konik ekleyerek sulandırmak için 2 x SB 10 mL transfer.
- Quenching arabellek turuncu (QBO) tarifi
Not: radyoaktif etiketleri kullanıldığında, kullanıcılar sık sık bromophenol mavi ve/veya Ksilen cyanol Elektroforez ilerleme için bir izleme boya gibi istihdam sağlayacak. Ancak, bu boyalar zayıf yakın kızılötesi bölgede belli DNA sinyal ile müdahale. Böylece, biz Orange G örnekleri içeren tüm reaksiyonlar için onların yerine kullanın. Orange G jel yükleme izlemek için uygun olmak bulduk, biz portakal Elektroforez ilerlemesini izler bir boya daha az tutarlı olacak şekilde G bulduk; Böylece, boş şerit bromophenol jel ilerlemeyi izlemek için örnek içermeyen dış hatlarının jel üzerinde mavi içeren çalıştırın.- % 95 formamide 25 ile birleştirmek 950 µL µL 0,5 M EDTA ve 25 µL ultrasaf su. Turuncu G boya (~ 10 mg), 1 kaşık ekleyin. Vortexing tarafından Mix.
Dikkat: Formamide toksik; eldiven, gözlük ve önlük gibi kişisel koruyucu donanımları (PPE) giymek ve tehlikeli atık atmayın.
- % 95 formamide 25 ile birleştirmek 950 µL µL 0,5 M EDTA ve 25 µL ultrasaf su. Turuncu G boya (~ 10 mg), 1 kaşık ekleyin. Vortexing tarafından Mix.
2. Tahlil Çalıştır
- genel faaliyet nitel karakterizasyonu
Not: Biz genellikle M-NTP'ler sürekli konsantrasyon korumak ve zaman değişir bu tahlil için. Protein genel özellikleri değerlendirmek için yerine herhangi bir bireysel adım ölçmek için hedeftir. Bir reaksiyon hazırlamak için iki ayrı bileşenleri, (2.1.1. adımda açıklanan) çift yönlü mix ve (2.1.2. adımda açıklanan) dNTP karışımı eşit bir hacmi ayrı ayrı hazırlanacak ve sonra da 49 µL son hacim vermek için birleştirilmiş. 1 µL 50 x enzim ilavesi sonra reaksiyon başlatır. Değişken zaman Puan alınabilir; genellikle, 0, 5, 15 ve 60 dk gidermek.- Hazırlık DNA çift yönlü mix
Not: Çift yönlü mix 10 x SF arabellek, astar Oligonükleotid, şablon Oligonükleotid ve ultrasaf su oluşur. Her reaksiyon için eklenen toplam 25 birimdir µL. 1 µL enzim hemen önceki deneme inisiyasyon ana karışıma eklenir.
Not: bizim deneyleri için biz genellikle 45-mer şablonu ve bir 18-mer veya 23-mer astar kullanın. Farklı uzunlukta bir dizi kullanılabilir süre (18 nükleotit için 45 nukleotid çeşitli) ürünleri kolayca açıklanan Jel Elektroforez protokollerini kullanarak bir tek nükleotid düzeyinde çözülebilecek olan olduğundan bu uzunluğu kullanma eğiliminde. Oligonükleotid ürünleri uzunluğu arttıkça, bu ürünler tek nükleotid çözünürlükte gidermek için zorlu bir iş olabilir.
Not: bizim deneylerde kullandığımız bir 5 ' astar ürünleri gözlemlemek için astar iplikçikteki yakın kızılötesi floresan boya etiket. Biz bu değişikliği taşıyan özel sentezlenmiş oligonucleotides satın alma; Ancak, bu etiket herhangi bir sayıda sonrası sentetik etiketleme stratejileri kullanarak dahil edilebilir. Şablon Oligonükleotid değil etiketlenir ve bu yüzden jel Imager kullanarak gözlem değil. Her iki oligonucleotides için 100 µM, oligonucleotides 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA saklıyoruz.
Not: çünkü biz sadece astar gözlemleyerek, iki kat fazla şablonunun tüm astar (görülmektedir DNA tür) için şablon komplementer sağlamak için kullanılır. Bu tepki olarak son çift yönlü konsantrasyonu 40 olduğunu nM.
Not: Yakın kızılötesi floresan boyalar biraz ışığa duyarlı çoğu zaman; mümkün olduğunda, biz astar (ve astar içeren herhangi bir çözüm) folyo ile kapatın. Çalışırken bu polyacrylamide jel içerir.
Not: Aşağıda bir temsilcisi 2 sentezi örnektir ' F M-DNA.- Seyreltik astar 1 ve 1 şablonu (bkz: Malzemeler tablo için sıra) 1 µM her birinin ultrasaf su için.
- Ayrı tüpler, her tahlil tepki için birleştirmek 10 SF arabellek x 5 µL, 1 µM astar 1, 1 µM Şablon 1 ve 13 µL ultrasaf su tüpler termal cycler ile uyumlu 4 µL 2 µL.
- Tavlama aşağıdaki programı kullanarak bir thermocycler dubleks: 98 ° C için 2 dk, 5 dk, 5 dk, 5 dk, 40 ° C için 50 ° C için 70 ° C 25 ° C'de tutun Bulunan belirli bir programa astar/şablonu çift yönlü tavlama sıcaklığı bağlı olarak değişebilir. Tipik olarak, en az 5 dk yavaş tavlama sıcaklığı ve daha sonra başka bir dakika 5 adım bir ısıda içerecek şekilde tercih 5-10 derece altında tavlama sıcaklığı.
- 2 x dNTP karışımı hazırlanması
Not: deney bağlı olarak, değişken dNTPs ve dNTPs konsantrasyonları kullanmak mümkündür. Genellikle, 50-200 µM tepki olarak kullanılır.- Hazırla her 2 100 µM içeren bir 25 µL çözüm ' F-NTP. M-NTP'ler 100 mm depolamak.
- 50 protein seyreltme x hazırlanması
Not: uzun süreli depolama için enzimler içinde 1xSB-20 ° C'de tutulmaları gerekir. -20 ° C dondurucudan kaldırılır, enzimler ek ana karıştırmak için önce her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Enzim dilutions her gün konsantre stoktan taze yapılmalıdır. Konsantre enzim hisse senedi-20 ° C-dondurucu kullanımdan hemen sonra döndürülmelidir.
Not: Öncelikle mutant DNA polimerazlar değerlendirmek çünkü sadece ifade ve saf enzimleri kurulan yöntemleri 9 , 10 kullanarak bizim laboratuvar olarak kullanıyoruz. Ticari olarak satın alınan polimerazlar için kullanıcılar farklı proteinler ve burada açıklanan arabellekleri uyumluluğunu en iyi arabelleklerini dikkatli olmanız gerekir.
Not: Enzim konsantrasyonları her deneme için değişir. Burada, 2 için temsil edici bir örnek göstermek ' F-DNA sentezi. Yapmak a 10 nM enzim eriyik, enzim int 1 µL sulandırmak için- o 1 x SB 50 x son enzim toplama yapmak. 50 x çözüm konsantrasyonu-meli var olmak 500 nM. Örneğin, hisse senedi enzim konsantrasyonu 50 µM ise, 1 µL hisse senedi enzim 99 µL 1 ekleyin SB. x
Not: enzim genellikle % 50 gliserol içinde depolanan olduğundan, oldukça yapışkan bir çözümdür. Son derece hassas Pipetler kullanarak bile, biz daha az 0.5 µL, pipetting doğruluk ve kesinlik önemini enzim seyreltme sırasında göz önünde bulundurarak önermiyoruz.
- o 1 x SB 50 x son enzim toplama yapmak. 50 x çözüm konsantrasyonu-meli var olmak 500 nM. Örneğin, hisse senedi enzim konsantrasyonu 50 µM ise, 1 µL hisse senedi enzim 99 µL 1 ekleyin SB. x
- Tahlil inisiyasyon
- kuru banyo sıcaklığı 50'ye ayarla ° C.
- Ekleyin 24 µL tavlanmış dubleks, mix (bkz. Adım 2.1.1) 2 x dNTPs (bkz. Adım 2.1.2) 25 µL için.
- Karışımı µL 2.1.4.2 adım ve 20'ye ekleyin 9,8 kaldırmak µL olan QBO (tarifi için 1.3 bölümüne bakın). Bu aliquot olarak hizmet veren bir " hiçbir enzim " kontrol etmek ve her çalışma için alınmalıdır.
- Ekle 50 x enzim 0.8 µL (bkz. Adım 2.1.3.1) çift yönlü/dNTP karıştırmak için. Yukarı ve aşağı bir büyük ses micropipette ile iyice karıştırın pipet.
- 5, 15 ve 60 dk sonra tepki her reaksiyon çözümünün 10 µL kaldırarak ve 20 µL (1.3 bölümünde açıklanan) QBO içeren bir microcentrifuge tüp ekleme yavaşlaması.
- Giderdikten sonra tepkiler folyo süresiz olarak, 4 ° C veya -20 altında saklanabilir ° C.
Not: M-DNA sentezi bireysel adımları nicel karakterizasyonu için çok benzer bir tahlil kantitatif Michaelis-Menten parametrelerini elde etmek için çalıştırılabilir. Bu tahlil aynı malzeme kullanır. Michaelis-Menten parametreleri için dNTP ölçülebilir; Bu durumda, en önemli fark, yerine çift yönlü mix dNTP karışıma ekleyerek, bu 2 x dNTP çözümleri bir dizi için enzim ile çift yönlü mix ekler. Benzer şekilde, Michaelis-Menten parametreleri DNA çift yönlü için ölçülebilir. Michaelis-Menten denklemi kullanmak için gereken varsayımlar karşılamak için belirli koşulların yerine getirilmesi gerekir. Bu koşullar ve testin temel mekanik bir önceki yöntemleri madde 11 ' de açıklanmıştır.
- Hazırlık DNA çift yönlü mix
3. Jel Elektroforez
Not: jel dökme zamanı duyarlı olduğundan, tüm malzemeler önceden monte edilir. Testin tüm kritik bileşenlerinin tarifleri aşağıda listelenmiştir; Tedarikçiler Tablosu reçetesi listelenir.
- İçin % 20 Akrilamid jel Akrilamid hazırlanıyor.
Not: Bu tarifi 1 L Akrilamid karışımı yapar; Bu çözümün yaklaşık 120 mL jel kullanılır. Bu çözüm için bir yıl folyo altında oda sıcaklığında saklayın.
Dikkat: Polyacrylamide sinir hücrelerini tahrip eder. Jel dökülen tüm adımları sırasında eldiven ve önlük giymek önemlidir. Eğer polyacrylamide eldiven, eldiven yerini alması. Akrilamid polimerli değil, kirlenmiş malzemeler etiketli polyacrylamide atık torbasına koyun.
Not: premix % 40 Akrilamid %38.67 Akrilamid ve %1.33 BIS-Akrilamid bir monomer 29:1 cross-linker oranı için içeren bu protokol için kullanıldı.- Tartmak 17 g premix TBE tozu. Altı ayrı bazı bölümleri üre (Toplam 420 g) 70 g tartmak.
Not: Üre porsiyonlar halinde eklenmiş olması gerekir. Biz altı bölümlerini içine bölmek en iyi bulabilirsiniz. - 2 L plastik kabı bir heyecan plaka üzerinde ayarlayın. Bir tek büyük karıştırma çubuk ölçek kabı için ekleyin. Ne zaman sıçramasına önlemek için karıştırma kabı folyo ile kapak.
- 500 mL % 40 Akrilamid çözeltisi kabı ekleyin. Çözüm karıştırarak emin olun.
- Ekle daha önce tartılır-TBE out. Üre bir aliquot ekleyin. Çözüm karıştırmak izin verin. Üre yavaş yavaş erir ve puslu ve ilk ek üzerine beyaz görünebilir. Yavaş yavaş üre kalan aliquots üzerinde bir saat içine karışımı ekleyin. Mix kadar tamamen açık ve renksiz bir şey çözüm izin.
Not: Genellikle bu gecede heyecan izin. Eğer çözüm hala çözülmüş değil, küçük aliquots su ekleyin ve çözülmeye üre için bekleyin. - Üre ek birim hacim tam olarak 1 1 L. Ekle suya yakın artacak L.
- Bir 1 L renkli cam şişe veya kapak alüminyum folyo ile cam şişe mağaza.
- Tartmak 17 g premix TBE tozu. Altı ayrı bazı bölümleri üre (Toplam 420 g) 70 g tartmak.
- Akrilamid jel boşalırcasına.
Not: cam plakalar ele alırken, cam plakanın ve herhangi bir sert yüzey arasındaki temas önlemek dikkatli olun. Cihazın sert kullanımı küçük çatlaklar bardakta neden olabilir ki bu özellikle önemlidir; jel, oluşan daha yüksek bir sıcaklıkta çalışıncaya kadar bu çatlaklar görünür olmayabilir. Cork halkalar bu istenmeyen kişi engellemek için kullanın.- Temiz
- edinme iki 33 cm x 42 cm jel Kaplamalar, bir çentikli ve bir unnotched plaka tabaklar. Ayrı cork halkaları tabak yerleştirin. Durulama tabak sabun ve su ile iyice
- . Sabun çizgiler ya da geride jel noktalar yok emin olun.
- Daha az su hangi tarafta plaka boncuk not alın. Bu yan yüzün dönük jel olan.
Not: jel plaka öbür ucunda çalıştırırsanız, bu jel transfer zorlu yapabilir.
- Kuru plakaları
- her iki yüzleri her plaka kuru için kağıt havlu kullanın. Kalan alanlarda kurumaya
- kullanımı hassas görev silecekler. Nerede teyp uygulanır plakaları kenarlarını özel dikkat.
- Cam plakanın ~ %70 etanol ile durulayın ve silmek ile görev silecekler.
- Hiçbir kağıt havlu lifleri olduğundan emin olun veya Su damlacıkları. Bunlar ne zaman jel dökme kabarcıklar neden olabilir.
- Çubukları Ekle
- 0,75 mm boşluk ekleyiciler elde etmek. Eldivenli parmak DI su altında çalıştırmak ve yavaşça eldivenli parmaklarıyla tutucular ıslak.
- Yer tutucular çentikli uzun kenarları boyunca plaka. Tabakları geri kalanı üzerinde sıçrayan su temizleme. Ara levhaları cam levha ile uyumlu olduğundan emin olun ve kenar üzerinde asılı değil.
- Mühür jel
- kuru eldiven takmışım. Tekrar ile hassas görev silecekleri cam kenarları kuru.
- Unnotched kalenin üst çentikli plaka üzerinde ve yavaş yavaş daha düşük aşağı levhalar birbirlerine karşı basın hizalayın. Tekrar tüm plakaları kenarlarını hizalandığından emin olmak için onay.
- Kullanma jel teyp, kaset üst hariç tüm kenarları arasında yerleştirin. Teyp eşit olarak hizalanmış ve sıkı kapalı olduğundan emin olun. Teyp bir çekimde uygulanabilir veya her iki tarafta ayrı ayrı yapılabilir. Kaset biter jiletle kesti.
- Ek bir teyp katmanı jel altýna ekleyin. Sıkı kaseti, daha az muhtemel jel ne zaman dökme sızıntısı olacak.
- Cam sandviç kenarlarında beyaz kelepçeler ile küçük. Her tarafa 3 klipler ve 4 klipleri altına eklemek.
- Jel dökme
- 3 mL % 10 amonyum persülfat çözeltisi (APS) 0.3 g amonyum persülfat eriterek ve ilâ 3 mL ultrasaf su sulandrarak olun.
Not: APS 1.2 mL jel gereklidir. Tüp yaptıktan sonra tarih. APS çözüm 2 hafta içinde sona eriyor ve 4'te tutulmalıdır ° C. - , 125 µL transfer tetramethylethylenediamine (TEMED) ayrı microcentrifuge Tube.
Not: TEMED toksik; PPE giymek gibi eldiven, gözlük ve laboratuvar kat ne zaman işleme. - Ve fışkırmak şişe satın sivri huniyi çıkarın. 125 mL su mezun silindir dışarı ölçmek ve şişe ekleyin. Dış şişe su seviyesi kalıcı bir kalem ile işaretleyin. Su atın. Bu değiştirilmiş fışkırmak şişe süresiz olarak uygun (aşağıya bakın) temizliği ile yeniden kullanılabilir. Bu nedenle bir kez o dökülür jel koyacak bir yer
- corked Yüzüklerin lavabonun yanındaki ayarlayın. Plaka sandviç buraya koyun. Bu nedenle jel dökülür varlık iken plakaları oturacak bir yer mantar lavaboya koy. Yüzden üst lavabonun kenarında dinlenme olacak iken alt mantar üzerinde dinlenme jel açılı cam plaka sandviç içine dökülür. Polyacrylamide uçurmaya dökülen diye yastıkları bu alanların altında olduğundan emin olun
- Yer APS çözüm ve TEMED çözüm boş ile lavaboya diğer tarafında şişe bücür. Kuyu istenen sayıda iyi tarak plakalı lavabonun kenarında koyun. 4 kelepçeler yakın koymak.
Not: Yordam sonraki adımda çok hassas zamanı. Bu adımlarda size hızlı bir şekilde taşımak hazır olun. Bu polymerizes önce plaka arasındaki karışımı için zaman sınırlı bir miktarda vardır. Tüm bileşenleri (hazır ayarı doğru birim, çözümleri, cam plakanın MİKROPİPETLER) dikkatli bir şekilde mümkün olduğunca çabuk jel dökmek için düzenlenir. Daha yavaş bir polimerizasyon, APS ve TEMED konsantrasyonları yarıya; isteniyorsa, Bu ancak, daha uzun bir polimerizasyon zaman gerektirir. - % 20 Akrilamid jel çözüm işaretli noktaya fışkırmak şişe içine dökün. Bu nedenle yeterli bir çözüm küçük sızıntıları durumunda işaretli çizgi üstü biraz daha jel solüsyonu dökün. Yaklaşık 120 mL jel çözüm budur. Aynı zamanda fışkırmak şişe polyacrylamide jel çözümde için
- Ekle 120 µL TEMED ve 600 µL APS ile. Hızlı bir şekilde APS bir ek 600 µL polyacrylamide jel ekleyin.
- Hızla fışkırmak şişe ve girdap kap. Plaka sandviç lavaboda yerleştirin.
- Yağmaya başlar. Bu sadece polimerizasyon önlemek için 1-2 dk sürer. Jel çözüm eşit olarak çıkıyor yavaş ama giderek, basınç fışkırmak şişe ekleyin. Çözüm düzensiz fışkırmak şişe spattering başlarsa, şişe şişirilmiş olur bu yüzden basıncı serbest bırakmak ve dökme devam edin. Jel çözüm tüm alanlarını kapsayan ve herhangi iki tarafın sızdırıyor değil emin olmak dikkat et. Hava kabarcıkları kaldırmak için tabakları açısını değiştirmek. Kabarcıklar üstündeki açılır ve açı dik ise daha hızlı çalışır. Devam çözüm çentikli alanının üstüne ulaştı ve biraz çentikli kenarına taşan kadar dökme. Tüm hava kabarcıkları kaldırmak.
Not: Eğer plaka sandviç sızıntıları, ya da yeterli bir jel çözüm değil ve çözüm tabakaların üst ulaşmak değil, jel kullanılamaz. Jel polimerli kadar bekleyin ve buna göre temiz. - İyi tarak plaka sandviç için ekleyin. Yer 4 Klemensler üzerine bastırın ve kuyular eşit dağılımı için izin vermek için tarak.
- Hızlı bir şekilde fışkırmak şişe kalan jel çözümde etiketli polyacrylamide atık atın. DI ile fışkırmak şişe su 2 - 3 kez, su bașlığı dışarı durulama.
Not: Bu hızlı bir şekilde polyacrylamide fışkırmak şişe tıkanmasını önlemek için temizleme işlemi önemlidir. Polimerizasyon bile az miktarda meme içinde oluşursa, sonraki jel çok yavaş ve değil başarılı döktü. Polimerizasyon oluşursa fışkırmak şişe atın.
- 3 mL % 10 amonyum persülfat çözeltisi (APS) 0.3 g amonyum persülfat eriterek ve ilâ 3 mL ultrasaf su sulandrarak olun.
- Temiz
- Akrilamid jel çalıştıran
- jel polimerli, 1 x TBE çalışan arabellek olun. Premix TBE katı 17 g 1 litre ultrasaf su geçiyoruz. Tüm TBE eriyene kadar arabellek sallamak.
- Bağlayıcı klipleri plaka sandviç kaldırmak.
- Kaseti kesip plaka sandviç tüm kenarlarından bandı çıkarın bir jilet kullanın.
- Temiz cam yüzeyler polimerli jel kapalı. Jiletin kenarları boyunca kalan jel kazımak için kullanın. Plakayı su mümkün olduğu kadar polyacrylamide artıklarını çıkarın ve kağıt havlu ile silin. Aşırı Akrilamid ve/veya teyp Jel Elektroforez sırasında sık sık yazabilir.
- İyi tarak her iki tarafta eşit olarak bu iterek çıkarın.
- Plaka sandviç üstündeki aşırı jel kesmek için jilet kullanın. Çentikli kenarı boyunca dilim plaka.
- Bir şırınga ve DI su kuyuları durulayın ve wells enkaz kaldırmak için kullanın. Emin olun her şey su ile dolu ve aşırı polimerli jel tarafından engellenmeyen.
- Plaka sandviç aparatı uzun plaka dışa karşı karşıya olduğunu ve çentikli alanı içe doğru bakacak şekilde yerleştirin.
- Plaka sandviç ve alüminyum plaka aparatı ile birlikte klip için Ekle klipleri. Da çalışmayı teşvik için plaka dışa doğru ekleyin. Bir
- eklemek TBE arabellek temel çentikler ve yeterli üst kuyuları kapsayacak şekilde karşılamak için. TBE tampon filtre ve yaklaşık 5 tırnaklar için jeller yeniden.
- Jel Elektroforez 50 W. çalıştırarak 20 dk sıcak tabakları
- Kuyu temiz tabakları ısınma sonra. Bir şırınga ve TBE tampon kalan arabellek tuzları kuyulardan squirt banyolarında kullanın. Temiz kuyu emin olmak için bu birkaç kez yapmak. Kuyu temiz değilseniz, bantları fray ve görüntü yorumlanabilir olmayacaktır. Bu zaman alıcı olabilir, ancak iyi bir veri elde etmek için zorunlu bulduk.
- En dıştaki Lane damlalıklı 5 µL % 95'i formamide bromophenol mavi, her iki tarafta. Aynı çözüm olarak QBO ama bromophenol turuncu G. yerine mavi ile bu Bu görüntü üzerinde ne jel görüntüleme için ve ne kadar DNA aşağı kesmemi tükendi sağlayacaktır.
- Analiz edilecek her örnek için (2.1.1 bölümünde oluşturulan), 3 µL jel bir tek şey için ekleyin. Tüm örneklerini yükledikten sonra örnekleri yerleşmek için 1 dakika bekleyin. Plastik banyo alt ve üst kapaklar
- yerine. Teller için cihazı takın. Kırmızı gösterir pozitif elektrik yükü, bu nedenle böylece aşağõ DNA ishal alt kısmında olmalıdır.
- Bağlama teller için bir güç kaynağı ve yaklaşık 3 h için jel 50-55 W. Çalıştır olarak ayarlayın veya bromophenol kadar mavi boya açık çalıştırılmış en az 2/3 aşağı jel.
- Jel görüntüleme
Not: Bu jel son derece incedir ve ele almak zor olabilir. Çok dikkatli sökük ve tüm jel kaybı önlemek için götürülmeli.
Not: bağlı olarak DNA etiket bu farklı jel görüntüleme cihazları kullanarak gerektirebilir. Bu protokol yakın kızılötesi floresan boyalar kullanır ve görüntüleme örneklerinin bir jel Imager üzerinde gerçekleştirilen (Tablo malzemeleri görmek). Protokol özellikle için o Imager bulunmakta.- Bromophenol mavi boya açık çalıştırdığınızda
- en az 2/3 aşağı jel (~ 28 cm), jel gücü çevirerek durdurulabilir. Cihaz ve mantar halkaları üzerinde yer jel kaldırmak.
- Plakaları küçük takoz plaka ayırıcı ile ayırın. Ayırıcı iç yer çekmek için iki kayıtta bitecek iş köşesinde. Dikkatli olun ve aşırı güç kullanmayın; çok fazla baskı uygulanırsa çentik kırabilir.
- Emme sonra plakaları arasında serbest bırakılır, dikkatle üst plaka kaldırın ve hangi plaka üzerinde jel olduğunu belirlemek. Jel alt plaka üzerinde sopa, üst plaka koparmak ve mantar halkada yer. Jel kaldırdı üst plaka üzerinde ise, yavaş yavaş hareket ve jel geri alt plaka düşebilir. Jel düşmek değil, daha yavaş hareket ve alt plaka jel kalan kısmını çekin ve jel ile üst plaka ayrı cork halkada yer. Bir kez plakaları ayrılır,
- üzerinde jel boya nerede görmek ve aşırı jel jel alt ve üst kaldırın. Tipik olarak, bizim yapıları ile bir 18-23 nükleotit astar ve bir 45 nükleotit şablonunu kullanarak var. bromophenol mavi boya ön ve alt jel arasında DNA yok Dikey olarak boya jel üstüne kesmek. Boya ve jel kenarları arasında boşluk da hiçbir DNA'sı var. Son olarak, jel iyi alanınızda aşağıda birkaç santim kes. Jel çok üst yok nükleik asitler vardır.
Not: jel en küçük boyut mümkün içine kesme önemli ölçüde görüntü aygıtı aktarmak kolaylaştırır. Jel çok büyükse, aktarım sırasında kopyalama için daha duyarlıdır. Biz genellikle jel görüntüleme önce döşeme iken, bakım gerçekleştirilmezse ilgili veri kaybolabilir gibi kırpma zaman çok dikkatli kullanmanızı öneririz. Bazı bölümleri içeren ek veri kaldırılmış olup olmadığını denetlemek için biz genellikle bir ek tarama veri kayıp olduğunu emin olmak için jel eksize kısımlarının gerçekleştirir. - Jel kurumasını önlemek için su ile kat.
- Imager yüzeyi temizleyin. Görev silecekler kullanarak, su ve etanol ile yüzey aşağı silin. Nerede jel alınacaktır yüzey su ince bir kat ekleyin.
- İstediğiniz kısmını jel Li-kor ıslak yüzeyine transfer
- Kaldır hava baloncuklar yavaşça onları jel tuşuna basıp görev silecek ile silerek. Hava kabarcıkları çok zor iterek jel yırtmak çok kolay olduğundan dikkatli olun.
- Jel üreticiye göre görüntü ' s iletişim kuralları. Mevcut yazılım için Görüntüleyici kullanarak jel analiz.
- Jel görüntüsü olsa da, çalışma alanı aşırı Akrilamid jel kaldırma, tabak yıkama ve yeniden kullanılabilir TBE tampon filtreleme temizlik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı polyacrylamide jel analiz genel faaliyet (2.1, şekil 1bölümünde açıklanan) ve (Bölüm 2.1, Şekil 2sonuç notta açıklanan) kararlı durum Kinetik nitel bir karakterizasyonu gösterilir. Başarısız polyacrylamide jel analizi de (şekil 3) gösterilir.
Not yok piyasada bulunan merdiven ya da moleküler marker kullanılır. Zaman zaman, moleküler bir işaretleyici oluşturmak için bilinen polimeraz-substrat birleşiminden kullanır; Ancak, farklı değiştirilmiş nükleotit oligonucleotides aynı uzunlukta ama farklı nükleotit yapısı karşılaştırılması uygunsuz hale çok farklı elektroforetik mobilities var unutmamak gerekir.
Şekil 1: genel faaliyet nitel bir karakterizasyonu başarılı polyacrylamide jel analizi örneği. Bireysel grup iyi tanımlanmış ve normal olduğunu unutmayın. Bantları farklı uzunlukta oligonucleotides temsil eder; Bu jel polimerazlar arasında kolay karşılaştırma sağlar. Hiçbir enzim denetim lane ile belirtilen bir "-". Etkinlik her iki ürün uzunluğu ve daha büyük ürünler için dönüştürülür etiketli astar bölümü tarafından karar verilir. Bu analiz, E5 ve E6 en aktif vardır. E3 ve E2 yaklaşık eşit etkinlikte, ama E6 ya da E5 daha az, ve E4 ve E1 az etkin enzimlerdir.
Şekil 2: nicel analiz kararlı durum Kinetik kullanarak başarılı jel örneği. Şeritler de çözüldü ve iyi tanımlanmış dikkat edin. Oligonükleotid sentez bireysel adımların kararlı durum hızı sabitler ölçmek için bir enzim nükleozit trifosfat (Bu durumda, dCTP); değişen miktarlarda ile inkübe Sadece n unutmayın ve (n + 1) ürünler sentez miktar tekil olay etkinleştirme.
Şekil 3: genel faaliyet için başarısız bir jel örneği. Jel bantlarında görünür boşluklar sonuçlanan işleme sırasında yıkıldı. Not miktar ve analiz zorlaştırır jel bantları düzensiz şekillenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, M-DNA DNA polimeraz aracılı sentezi karakterize etmek için bir tahlil anlatmıştık. Yakın kızılötesi etiketli DNA primerler kullanılarak ve farklı büyüklükteki oligonucleotides gidermek için denaturing polyacrylamide Jel Elektroforez kullanarak, biz sentezi hassas ölçüm etkinleştirme oligonucleotides, tek nükleotid çözünürlük elde edebilirsiniz. Bu yaklaşımlar da enzim (Bölüm 2.1) genel etkinliğini ölçmek için veya tek tek adımları (2.1. adımda takip Not) Michaelis-Menten parametrelerini ölçmek için kullanılabilir. Bizim laboratuvar en son bunlar için kullandığı her ikisi de daha önce gelişmiş enzimler9 karakterize yanı sıra mantıklı bir şekilde tasarlanmış enzimler10.
Burada açıklanan bizim deneyleri radyoaktif olmayan bir DNA etiket kendi kullanımında önceki yöntemleri farklı. Tarihsel olarak, radyoaktivite DNA sentezi radyoaktif fosfor etiketleri11,18kullanılarak elde edilebilir yüksek hassasiyet nedeniyle izlemek için kullanılır. Ne yazık ki, elden çıkarma yüksek maliyet yanı sıra sınırlı raf ömrü radyoaktif etiket radyoaktif etiket kullanımı engelleyici yapabilirsiniz. Burada, bu sakıncaları saptanmamış DNA etiketli yakın kızılötesi fluorophore nasıl kullanılacağını açıklar. Özellikle, yakın kızılötesi floresan boyalar ile radioactively etiketli DNA (yayınlanmamış sonuçları) benzer algılama sınırları görüyoruz. Ancak, görünen aralığın içinde floresan boyalar ile biz benzer algılama sınırları (yayınlanmamış sonuçları) gözlemlemek mümkün değildi. Bizim grup genellikle ticari olarak hazırlanan DNA yakın kızılötesi fluorophores taşıyan kullanırken, bu boyalar bu Etiketler yüklemek için kullanılan kurulu sonrası sentez 5' değişiklik kimyaları, bir dizi ile uyumludur.
Tek bir deneyde iki etiketli oligonucleotides sentezi izlemek daha karmaşık denemeler-ebilmek olanaklı kılmak çok sayıda ticari olarak mevcut renk olduğunu yakın kızılötesi floresan boyalar da avantajlı. Radyoaktif etiketlerle uygulamasının deneyler bu tür kolayca yürütülmez. Bu büyük olasılıkla daha karmaşık denemeler, özellikle dik çoğaltma deneyler için bir dizi sağlayacaktır.
Bu tahlil ve denaturing polyacrylamide Jel Elektroforez, kullanarak herhangi bir tahlil öncelikle sınırlı yürütme Elektroforez, iş hızı düşük gözlemlenebilir, sınırlı boyut aralıkları yanı sıra bu deneyler teknik challenge by Tek nükleotid çözünürlük. Umarız bu ayrıntılı iletişim kuralı grupları bu deneyleri teknik zorlukların üstesinden gelmek izin verir. Tahlil throughput sınırlama, o does değil istemek bir autoradiograph geliştirmek kullanıcı olarak özellikle, yakın kızılötesi floresan etiket kullanımı daha fazla işlem hacmi gidermemesine karşın. Ancak, jel hala yaklaşık 4-6 kurmak ve çalıştırmak, günlük çalıştırabilirsiniz deneyler sayısını sınırlama h alır. Sınırlı alan polyacrylamide elektroforetik yeteneklerini tarafından nedeniyle oluşur. Pratik konuşma, bu sınırlamaların bu deneyleri tek nükleotid çözümlemesine gerek duyar odaklı araştırma soruları için en iyi olduğu anlamına.
Son zamanlarda, yüksek işlem hacmi DNA sıralama19 giderek DNA polimerazlar20,21karakterize bir yöntem olarak kullanılmıştır. Bu deneyleri daha geniş soru sıra önyargıları ve hata spectra odaklı sağlar onların önemli ölçüde yüksek üretilen iş için dikkati çeker. Yüksek işlem hacmi sıralama birçok paralel deney etkinleştirebilirsiniz iken, önemlisi, o bir tek nükleotid olarak yorumlamak zor olabilir. Bu yüksek işlem hacmi sıralama, bu makalede açıklanan yöntemleri uzun yıllar için ilgili sağlama boşlukları doldurmak için heyecan verici bir fırsat polyacrylamide Jel Elektroforez istihdam enzim deneyleri için sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser TriLink biyoteknoloji (ResearchReward Grant #G139) ve bilimsel ilerleme (Cottrell üniversite Scholar Ödülü #22548) için araştırma kurumu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33x42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
