Summary
这份手稿描述了 tailor-made 设计微生物培养介质的通用方法。这是由一个迭代工作流, 结合 Kriging-based 实验设计和 microbioreactor 技术的充分栽培吞吐量, 这是支持的实验室机器人, 以提高可靠性和速度在液体处理介质制备.
Abstract
工业生物技术的核心业务是利用微生物生产细胞工厂, 是应变工程的迭代过程和生物条件的优化。一个重要的方面是改善培养培养基, 为微生物形成的利益的产品提供一个最佳的环境。这是公认的媒体组成可以戏剧性地影响整体生物性能。营养培养基优化是已知的, 以改善重组蛋白生产与微生物系统, 因此, 这是一个值得一步的生物发展。然而, 通常标准的媒体食谱是取自文学, 因为 tailor-made 设计的培养介质是一个繁琐的任务, 要求 microbioreactor 技术, 以充分的种植吞吐量, 快速产品分析, 以及支持通过实验室机器人, 使液体处理步骤的可靠性。此外, 还需要有先进的数学方法来合理地分析测量数据, 并有效地设计并行实验, 以达到最佳的信息内容。
所提出的协议的一般性质允许容易适应不同的实验室设备, 其他表达主机, 和目标蛋白的兴趣, 以及进一步的生物参数。此外, 其他优化目标, 如蛋白质的生产率, 特定的产量, 或产品质量可以选择, 以适应范围的其他优化研究。应用的克里格工具箱 (KriKit) 是一个通用的工具设计的实验 (DOE), 有助于改进整体生物优化。它还支持多目标优化, 这对于优化上游和下游进程都是非常重要的。
Introduction
现代重组基因技术能够广泛应用于制药工业、动物饲养、有机化学和食品加工等各种用途的技术酶1,2,3。大量生产技术酶是工业生物技术和优化重组蛋白生产的重要课题, 需要应变和生物工程。为产生高效的工程生产菌株, 可提供不同的遗传库,例如, 用于平衡基因表达式4或提高分泌效率5。
杆菌谷氨酸是一个主要的氨基酸生产者在工业规模的6,7和代表一个有吸引力的非常规表达载体的分泌生产重组蛋白8 ,9。一般分泌 (Sec) 和双精氨酸易位 (达) 通路均存在于C. 谷氨酸中, 并成功应用于重组蛋白分泌物10。广泛的经验, 在生物工程的氨基酸生产在工业规模, 以及能力分泌蛋白质的 g/L 金额11和强大的鲁棒性有关生物均匀发现大规模培育12,13, 使C. 谷氨酸成为在工业规模上分泌生产异源蛋白质的有前途的平台有机体。
营养培养基优化是已知的以微生物系统改善重组蛋白的生产14,15,16,17 , 因此, 介质的调整组合是在生物开发方面的一个值得一步, 关于最佳生产率18,19,20,21。孔板 (台胞) 在微生物培养中的应用研究22,23,24为微生物培养台胞的开发和设计铺平了道路25 ,26和开发具有在线监视和环境控制的 MTP-based microbioreactor (MBR) 系统27,28。MBRs 能显著提高实验培养的产量。此外, MBR 系统从其他类型的生物反应器,例如, 气泡柱或搅拌槽反应器, 可用于微生物生物优化29,30,31, 32。
一般而言, 优化研究得益于增加的实验吞吐量, 这与 DOE 的方法结合起来更加强大, 例如评估设计变量之间的交互或减少高维搜索空间。因此, MBR 系统、实验室自动化和 DOE 的联合使用证明是生物技术中的一种强有力的方法8,16,33,34,35。
本文将先进的实验室自动化、MBR 技术与在线过程监控、Kriging-based 数据分析/实验设计相结合, 提出了一种媒体优化协议。克里格方法是在 MATLAB 工具箱 ("KriKit") 中实现的, 它可以下载并免费使用36。以应用实例为例, 通过优化 CgXII 最小介质的组成, 展示了利用C. 谷氨酸分泌的绿色fluorescent 蛋白 (GFP) 的生产。选用 GFP 滴度作为最优化的目标, 可以方便地进行量化, 并广泛应用于 MBR 系统的模型蛋白质研究37,38,39。
所介绍的框架分为四步骤, 如图 1所示。这些步骤由方框框表示, 对应于协议的各个部分。第一步 (图 1A) 是定义项目目标并确定所需的方法。DOE 方法学、MBR 技术和实验室自动化的结合使得实验吞吐量增加, 需要强大的数据处理能力。第二步 (图 1B) 旨在检测对优化目标有很高影响的敏感设计变量 (即、中等组件)。这导致了设计变量的数量减少的利益。第三步 (图 1C) 包括一个迭代优化, 用于更详细地调查剩余的设计变量与感兴趣的目标之间的函数关系。利用逐次扩展的数据集, 应用克里格方法对未测地点的实验结果进行预测。当克里格模型预测到一个最优或高精度时, 迭代周期就会停止。在第四步 (图 1D) 中对结果进行了验证, 并开始对确定的最佳值进行进一步的灵敏度分析。如果最初, 不敏感的组件被发现在最佳区域也不敏感, 在第三步的迭代优化过程中假设这是正确的, 这是合理的。然后, 建议通过应用正交试验方法, 如活性分析或 SDS 页, 对优化结果进行验证。
所提出的协议的一般性质, 允许易于适应不同的实验室设备, 其他表达主机, 和目标蛋白的选择, 以及进一步的生物变量, 如 pH 值或培养温度。此外, 其他优化目标, 如蛋白质的生产率, 特定的产量, 或产品质量可以选择, 以适应范围的其他优化研究。
图 1: 优化研究的工作流程.四帧框对应于协议的各节, "构思方法的研究和定义" (第1节), "灵敏度分析" (第2节), "迭代优化" (第3节) 和 "验证" (第4节)。请单击此处查看此图的较大版本.
Protocol
1. 构思方法的研究和定义 (图 1: A 部分)
注: 优化目标的定义: 是产品形成所需要的时间过程, 还是仅仅是一个有限的时间间隔, 甚至是一个固定的时间点相关？此外, 考虑潜在的问题, 如稳定性, 努力的分析量化, 或培养时间。作为最终蛋白质滴度的替代品, 其他的目标可以被考虑, 如生物量或栽培时间。生物量是由生物量特定的产品产量反映出来的, 而栽培时间则反映在 space-time 产量上。(最小) 产品质量也可能是一个目标。在某些情况下可能需要多目标优化, 如在其他地方所讨论的那样40。本研究选取 17 h 培养后的 GFP 滴度作为优化目标。GFP 荧光可以使用本研究中的设备在线跟踪, 这大大简化了模型蛋白的浓度测定。
注: 要优化的参数定义: CgXII 介质由16个单独的组件41组成, 在完整的阶乘设计中调查所有这些内容将导致 216 ≈6.5万实验。因此, 需要在合理和经验驱动的基础上减少搜索空间。为优化考虑的媒体组件的选择可以得到可用的专家知识或文献数据的支持。
- 确定哪些中等组分浓度不应变化。为了优化 CgXII 介质, 选择了以下组件进行固定:
- 葡萄糖固定在10克/升。这种优化是微不足道的, 因为更多的葡萄糖产生更多的 GFP 分泌生物量。目的是揭示直观的媒介效应。
- 3-(n-吗) 磺酸 (拖把) 固定在42克/升。这提供了足够的缓冲能力, 在间歇培养, 并没有代谢。
注: 在这最后的浓度添加拖把确保了 ph 值 7, 即使与其他股票解决方案的不同体积添加, 这不是在 ph 7。但是, 要排除起始 ph 值的任何偏差, 应检查所有库存溶液在其最大和最小体积上添加的介质成分。 - 2PO4和 K2HPO4分别固定在1克/升。这些也提供缓冲能力, 并且作为磷酸盐来源。
- 尿素固定在5克/升。这是一个基础氮源和 pH 稳定剂, 足以防止 n-限制。
- 生物素固定在0.2 毫克/升.谷氨酸ATCC13032 是生物素的缺陷。
- 儿茶酸 (PCA) 固定在30毫克/升。它充当铁螯合剂。
- Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 固定在100µM。它诱导了gfp基因的表达。
- 选择高和低浓度的介质元件进行初始灵敏度筛查。在这里, 选择了三典型的媒体组件组的组件。被调查的低和高集中为每个组分是:
- 标准氮源: (NH4)2所以4 (8-32 克/升);据报道, 氮源的变化有望优化生物质特异性 GFP 信号8。
- 跟踪元素: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 毫克/升), MnSO4 ∙ H2o (4-16 毫克/升), ZnSO4 ∙ 7 H2o (0.4-1.6 毫克/升), 丘索4 ∙ 5 h2o (125-501 µg/升), NiCl2 ∙ 6 h2o (8-32 µg/升) 和 CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 µg/升)。跟踪元素的组成是从 CgXII 媒体41的第一个发布继承的。此外, Na2MoO4 ∙ h2O (26-104 µg/l) 和 h3BO3 (20-80 µg/升) 作为跟踪元素包括在内, 因为它们在 CgXII 介质42的已发布变体中使用。
- 宏元素: MgSO4 ∙ 7 H2O (0.2-0.4 克/升), CaCl2 ∙ 2 H2o (5.3-21.2 毫克/升)。这些被发现在其他价阳离子增加分泌 GFP 生产在另一项研究14中, 其中C. 谷氨酸应变 R 使用了不同的介质背景和 CgR0949 达信号肽。
- 材料的准备和定义程序
注意: 建议在详细的层次上定义和修复实验方法。这种标准化确保了不同的结果可以追溯到内在的生物变异或不同的培养基组成。
注: 媒体库存解决方案: 为所有已调查的媒体组件准备单独的库存解决方案。准备高度集中的库存, 以便为所有部件稀释不同的体积。这意味着, 在根据设计计划将所有库存解决方案合并为最高容量后, 这不能超过最终的培养量,参见第 "生成中型股票解决方案移列表" 步骤1.3.3。如果添加高度集中的解决方案会导致非常低的添加量, 则如和 #60; 1/100) 最后培养量的th , 相应地稀释了库存溶液。例如, 在本研究中, 移体积小于10的µL 被定义为不可行。通常, 在介质中的最终标准浓度方面, 痕量元素溶液的浓缩程度与1,000fold 一样高。将介质成分作为倍数 (X 倍) 集中在参考配方中是有利的。这样, 就避免了小数小数的不可行移卷。CgXII 介质的所有库存解决方案的详细食谱载于补充文件。- 工作细胞银行 (WCB)
注: 对于每个生长试验, 使用一个 WCB 分。如果需要更多的等分, 使用100毫升脑心灌注 (BHI) 培养基在1000毫升的困惑摇瓶或接种多个摇瓶, 这是汇集之前加入甘油溶液。- 制备重组表达式菌株的单菌落C. 谷氨酸pCGPhoDBs-GFP43琼脂板 (37 克/升 BHI 粉, 20 克/升琼脂, 25 毫克/升卡那霉素)。电镀材料可以是来自新鲜的转变或从冷冻分。
- 工作细胞银行 (WCB)
注: 对于受雇的 BioLector MBR 系统在本研究中, 散射光 (生物量) 和 GFP 荧光是强度测量, 需要一定的增益值分配。增益越高, 光信号放大越高;这也是为什么散射光和荧光以任意单位 (a.u) 来测量的原因。在初步实验中, 确定适当的生物量和 GFP 检测的增益值, 以及适当的震动频率和填充量, 以避免在以后的工艺阶段较高的生物量浓度的氧气限制。被雇用的耕种情况 ("Flowerplates",即, 花形48井台胞, 震动频率1200转每分钟, 装填容量1000µL, 10 克/L 葡萄糖作为主要碳来源) 保证氧气无限制的耕种。在花形48井台胞中, 由于其他组合的灌装容积和震动频率的影响, 可获得最大的氧气传输速率, 提供了供应商的数据表。另外, 由于次级基质含量低 (例如、氮、痕量元素), 个别培养物的生长缺陷可能发生。因此, 在耕种结束时检查生物量浓度。在这项研究中, 没有观察到这样的生长效应。
- 定义 MBR 系统 ("BioLector") 的栽培协议如下:
- Filterset 1: 生物量, 增益14。Filterset 2: pH 值, 增益预设。Filterset 3: pO2, 增益预设。4: GFP, 增益80。
- 震动频率: 1200 rpm。
- 温度:30 ° c。
- 周期时间:15 分钟
- 试验时间: 手动 (培养不会自动停止)。
注意: 几乎任何液体搬运机器人系统都能从外部文件中读取移的操作。基本上, 所需的最小信息是试剂源的传递量和位置, 以及在机器人甲板上的实验室位置和实验室内的特定腔的目标。但是, 对于不同的液体处理系统, 必须考虑不同的语法。图 2显示了本研究中使用的移系统的一个示例文件结构。
- 四种类型的股票解决方案是 pipetted 到每个种植井:
- 各种媒体组件的库存解决方案 ("变体股票")。
- 水, 以补偿不同的累积量以上的股票。
- 包含所有已修复组件的股票解决方案 ("剩余库存")。此股票解决方案可以由包含不同组件的股票组成, 它们是例如, 存储在不同的温度下或用不同的方法灭菌。
- 接种, 应添加为最后一个组件, 并把它放在工作台上, 以避免细胞沉淀。
- 每种植好, 根据以下内容计算所有媒体组件要传输的卷:
为某些变体股票添加的卷可能为零, 如果省略此特定组件, 则为即。 - 为适当的数字修订所有计算出的卷Vi 。卷步骤中的移卷增量不应太小。如有必要, 请调整变体库存的浓度。例如, 这里的最小移卷定义为10µL, 最小增量定义为5µL。一般来说, 这些卷应该根据实验确定的精度和准确度为所用的液体处理站15,44。
- 计算包含所有井的固定组件的剩余库存的体积, 如下所示:
使用变体库的最大累计卷的位置.
因此, 在Rest 库存中计算固定组件的所需浓度, 如下所示:
相应地准备剩余库存。 - 每种植井, 计算水量增加如下:
- 每耕种好, 列出要添加的所有卷在以下加法顺序: VH2O, vRestStock, vi, vInok。根据液体处理站的规格格式化移列表, 如图 2中的示例所示。
因此, 在Rest 库存中计算固定组件的所需浓度, 如下所示:
- 为液体搬运机器人创建一个协议。有关 "双面" 系统的示例协议, 请参见图 3和图 4 , 并在相应的 "WinPREP" 软件中实现。该议定书应考虑以下方面:
- 在媒体准备之前, 包括一个足够的无菌住房的运行时间。
- 包括初始过度清洗和清洗所有移提示和油管。
- 为库存解决方案选择合适的实验室容器。在这里, 有12列的深井板适用于存储变体库存, 因为所有八移提示都可以在平行排列中插入井柱。这大大加快了媒体的准备工作。如果使用15毫升或50毫升试剂管作为水库, 只有一个移的尖端可以蘸入它一次。
- 停止17小时运行后的主要区域性。
- 根据制造商的用户手册, 将测量数据从 BioLector MBR 设备传输到连接的计算机, 使用 BioLection 软件包。
- 使用 "BioLection" 软件包的 "数据管理→转换数据" 功能, 该软件包伴随着 MBR 系统将原始数据文件转换为易于访问的电子表格格式。从最接近17小时的时间戳柱上复制所有培养井的 gfp 信号数据, 从参考栽培井和平均值中识别 gfp 信号。通过平均参考信号正常化所有剩余的 GFP 信号。
- 使用附加方法量化 GFP 滴度 (如果需要)
- 用台式离心机将所有培养井的细胞悬浮液转化为 prelabeled 反应管, 在离心后获得无细胞上清液10分钟。
- 将每一个无细胞的上清液转移200µL 到一个透明的底部的黑色96井中期, 并使用合适的微阅读器在 488/520 nm 读取 GFP 特异荧光。从参考栽培的平均信号的所有井中标准化 GFP 信号, 如步骤1.5.3。
注意: 对于不同的测量装置, 不能比较 GFP 荧光的绝对信号。因此, 从所有主要栽培的5参考菌株作为一个内部标准。提高 GFP 的效价可以表达与内部标准有关。这允许比较不同的实验结果和不同的 GFP 定量方法 (见下面两个步骤)。 - 用标准的协议,例如, 布拉德福或免疫分析法测定无细胞清的蛋白质含量。结合2步的结果, 可以确定蛋白质特定的 GFP 效价。
注: 荧光测量后, 直接使用本微样品。使用多通道管大大方便了必要的液体处理步骤。 - 执行 SDS 页面可视化的无细胞清遵循标准协议, 以验证大多数增加蛋白质含量是由于增加 GFP 分泌。
注: SDS-页比前面提到的方法更费力, 特别是在高样本载荷下。为了验证目的, 从参考介质和最终优化培养基培养15中运行无细胞清的 SDS 页往往是足够的。
2. 灵敏度分析 (图 1: B 部分)
注意: 本部分的目标是确定对目标有重大影响的重要因素。
- 选择介质组件的初始浓度范围。参考介质成分应位于所选浓度范围内。
- 选择合适的 DOE。这种设计可以在文献中找到,例如, 来自 NIST/SEMATECH 电子手册的统计方法 (可在 www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm)。选择的设计取决于感兴趣的媒体组件的数量 (这里, 11) 和执行的实验的数量 (这里, 32)。在给定的示例中, 选择了设计 "2IV11-6", 结果在32实验中, 并允许估计增加十一个组件之一的浓度对目标感兴趣的影响。更具体地, 主要作用不混淆与对因素互作用。他们可以被混淆与高阶的互动, 但是, 很可能不显着。
- 使用剩余的井 (这里, 16) 执行多次复制与参考媒介评估过程的再现性。复制应该同样分布在板块上, 以发现位置效应。参考实验的测量输出的平均值用于规范化。即灵敏度分析的每个测量输出除以参考输出的平均值。
- 使用适当的统计软件计算主要的和可能的组合效果。经典的实验设计是基于多项式逼近45。例如, MATLAB 函数 mvregress 可用于估计多项式系数。
3. 迭代优化 (图 1: C 部分)
注: MATLAB 工具 KriKit 用于解释和统计数据分析36。KriKit 允许用户构造一个数据驱动的克里格模型。这种克里格模型预测了媒体组件和目标之间的功能关系。它还提供了预测不确定性的信息。高不确定度表示噪音数据和/或数据密度不足。
- 能源部
注: 根据上一次运行的结果, 对新的实验进行迭代设计。- 在第一次迭代中, 设计新的实验以详细调查已识别的媒体组件的兴趣。2节的实验结果不能转移到迭代优化 (第3节), 因为没有相关效应的组分的浓度现在被固定到相应的参考值。因此, 从灵敏度分析和迭代优化的实验是不可比拟的。
- 否则, 请按照图 1中所示的方案, 框架 "迭代优化"。如果潜在的优化位于定义的浓度范围内, 则使用预期的改进4046设计新的实验。基于期望改进的实验设计集成在 KriKit 工具箱中。如果最佳的是在边界, 扩大浓度范围。
- 根据2节中定义的实验方法, 在设计的取样点上进行实验。
- 统计分析
- 使用所有迭代 (包括当前的) 的组合数据构造克里格模型。
- 利用 KriKit 的综合工具 (2/3 维插值、电影分析、筛选图、等) 对模型输出进行可视化研究。
- 如果用足够的精度估计最优面积, 停止优化。如果没有, 请继续执行步骤3.1。
注意:图 6说明了测试研究的迭代优化。浓度范围依次扩大, 直到找到一个高原 (迭代 1-6)。第七迭代用于更详细地探索边界。
4. 结果的验证 (图 1: D 部分)
注: 在完成迭代优化后, 需要检查初始假设的有效性。
- 重做灵敏度分析 (2 节), 以获得最佳介质成分。即, 在图 1中调查的组件的浓度 (C 部分) 被固定到它们的最优值。其他成分的浓度根据适当的 DOE 而异。
注: 这两项检查的结果都表明, 被调查成分的浓度水平不会改变其他成分的影响。如果筛选显示出与 B 部分的结果有显著差异, 则应在已调查的组件池中添加具有更改效果的组件, 并且应重复 C 部分。 - 在间接测量的情况下 (例如, 荧光作为产品浓度的指示器), 应用正交测量方法 (如: 如, 活性测定, 布拉德福德或蛋白质定量评估, SDS 页), 以确认变化通过比较引用媒体和优化的媒体15的结果来实现感兴趣的目标。
Representative Results
引入的协议, 以最大限度地提高分泌 GFP 的效价。具体而言, 选择 17 h 培养后的 GFP 效价作为优化目标。在线荧光检测 GFP 允许简单的产品量化。然而, 从参考培养数据中获得 GFP 信号的规范化是确保结果的重现性和可比的必要条件。如1节所述, 对媒体组成部分的预选是在合理基础上进行的。根据1节的说明进行了实验: 为整个研究确定了湿实验室程序的参数, 以确保结果的一致性和重现性。
如2节所述, 进行了初步筛选, 以确定有关的成分对进一步、更详细的研究的优化目标有重大影响。MTP-based MBR 系统允许48实验并行执行。考虑到在一个中期计划 (48) 上最大可能的并行实验次数和媒体组件 (11) 的总数, 使得 2IV11-6小数设计成为一个合适的选择。该实验设计包括32实验, 并允许对每一个被调查的媒体组件的主要效果的估计。其余的培养井 (16) 用于多次复制的实验与参考介质, 以评估再现性和位置效应。即, 每个实验进行一次 (没有复制), 除了参考实验 (五复制)。
表 1总结了筛选分析的结果。在被考虑的集中范围, 变化多数媒介组分没有显示对目标的一个引人注目的作用。组件 NH4+显示了强烈的负面影响, 而 Ca2 +和 Mg2 +显示了最强的正向趋势。Mg2 +对当前浓度范围的影响并不显著, 但可能是因为浓度范围更广。因此, 决定从介质中省略 NH4+ , 并在进一步的实验中研究 Ca2 +和 Mg2 +的效果。
3节描述了用于最大化 GFP 荧光信号的迭代优化过程, 同时改变了 Ca2 +和 Mg2 +的浓度。在迭代1中, 测试了可以省略 NH4+的假设。筛选分析采用了 Ca2 +和 Mg2 +的浓度范围。将 NH4+的最小浓度设置为零, 并从筛选实验中采用最大浓度。在下面的实验中, 组分浓度分布在 3 x 3 x 3 格栅内的定义浓度范围, 导致27实验。在所有的耕种过程中, 都包括了五复制的参考培养基, 作为内部标准, 并确保没有在中期计划的位置影响发生。对于余下的16口井, NH4+、Ca2 +和 Mg2 +的浓度在给定范围内随机分布。
图 5A可视化第一次迭代的结果。轴标签指的是原始参考介质中使用的成分浓度, 由 x Ref. 表示蓝色曲面表示使用 KriKit 软件计算的克里格插。每个曲面与 NH4+ (深蓝色: 0 x ref, 方格: 1 x ref, 浅蓝色: 2 x ref) 的相对浓度水平相关联。这种可视化表示形式表明, 省略 NH4+是有利的。插值曲面还显示了 Mg2 +和 Ca2 +的正面效果, 因为所有的平面都随着浓度的增加而上升。
根据迭代1的结果, 决定将 Ca2 +和 Mg2 +的浓度范围扩大一倍, 并将实验设计窗口移到右上角, 请参阅图 5B. 在这个范围内, 浓度分布在 6 x 6 的网格上。这保证了均匀分布在充分的集中范围, 导致最佳的克里格插值结果。图 5B显示基于两次迭代 (红点和黄色正方形) 中的组合数据的克里格插值图。对于两者, Ca2 +和 Mg2 +, 增加其浓度的积极作用继续。因此, 该过程通过加倍的最大浓度重复, 从而, 实验设计窗口的移动, 以探索的边界右上角。
图 6A提供了剩余优化过程的概览。对迭代3所收集的数据的分析显示了 mg2 +的正效应的限制,即, 确定了 mg2 +的最佳浓度范围。因此, 决定只为 Ca2 + (迭代 4) 进一步扩展集中范围。此过程重复了两次 (迭代5和 6), 直到发现了 GFP 信号的饱和度。这种饱和度是由钙盐的沉淀所解释的, 适用浓度为 ca2 +, 这些单元格不可用。
由于实验结果总是被噪声干扰, 由此产生的克里格插值出现不规则和目视检查可能导致错误的结论。然而, 通过统计的z测试, 可以可靠地识别出饱和 GFP 信号的培养基组分的最佳浓度范围, 并在 KriKit 中实现。z测试直接使用克里格方法提供的内部统计信息,即即、预测值和预测不确定性。图 6B显示已标识的高原, 使用 KriKit 工具箱确定和可视化。KriKit 工具箱是免费提供的36 , 并附带了详细的教程, 说明如何使用其功能。
如果找到两个以上的相关组件, 3 d-可视化达到其极限。KriKit 提供了其他几种可能的可视化表示方法, 如电影或 "筛选情节"。如果潜在的优化位于定义的浓度范围内, 则将使用预期的改进4046自动设计新的实验。基于期望改进的实验设计集成在 KriKit 工具箱中。在软件文档中可以找到更详细的信息。
在迭代过程之后, 对结果进行了验证, 如第 D 部分所述。通过使用最佳介质组成进行附加灵敏度分析, 对初始假设的有效性进行了检验。即, 所有的初始媒体组件的兴趣是不同的, 但 Ca2 +和 Mg2 +被设置为其最佳浓度水平。在本研究中, 选择了最佳浓度 = 32 x ref 和 = 6.8 x ref. 
表 2显示验证筛选的结果。与初始灵敏度筛选类似 (cf 表 1), NH4+仍有显著的负面影响, 剩余的影响仍然可以忽略不计。
由于容易获得, 从培养悬浮液中的 gfp 荧光信号被用来量化的细胞外 gfp 的效价在所有的实验。为了验证的原因, GFP 荧光验证了其他测量。由于 gfp 是通过达通路分泌的, 荧光信号不能区分和胞外 gfp。因此, 利用参考介质和优化培养基对栽培进行了复制。除了荧光测量从无细胞培养清, 蛋白质含量是量化的布拉德福德检测和 (半) 定性 GFP 改善可视化 SDS 页15。与参考介质相比, 所得到的优化培养基的所有结果测量信号大约为两倍, 并验证了优化培养基分泌性能的大约100% 的改善。因此, gfp 特异荧光的培养悬浮可以被认为是一个合适的指标的优化目标,即, 胞外 gfp 滴度。
图 2: 从卷移列表中进行敏感度分析的屏幕快照.第一列中的条目为一行的所有卷分配唯一标识符;此标识符是在液体处理程序工作台上的目标培养计划的中期计划井号,参见图 4C。剩余的列为不同的解决方案 ("Sln-01" 到 "Sln-15") 编码卷以 pipetted。一排的累计容积对应于相应井的最终栽培量。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 从液体处理控制软件 "WinPREP" 中截屏.左: 行顺序命令, 包括每个股票解决方案的转移命令 pipetted。在接种添加的最后一个命令之前, 将插入一个用户提示, 以确保种子区域性刚好放在表中。右: 工作台的示意图, 包括变异种群的源实验室 (两个深孔板, 有12柱状井), 用于休息库存的试剂槽, 水和接种, 以及培养基制备靶向培养中期计划。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 为库存解决方案的移设置详细截图的编译.(A) 移铁库存的非包装命令。在工作台上用相应的深井板的读框和红柱标记出源实验室和源井。目标实验室和目的井内的标志是蓝框周围和蓝水井的靶培养中期计划。(B) 有关此步骤 (Fe 库存解决方案) 的移卷分配的详细示例视图。从具有48行的移列表中读取目标的数量。移列表中的4栏中找到了所有用于 Fe 库存解决方案的目的井的免除量。请注意, 移列表中的第一列包含标识符, 而不是要传输的卷, 请参见图 2。(C) 有关目标井编号的详细信息。在相应的移列表的行 #1 中写入的卷将 pipetted 为 #1 等标记。井 #01, #08, #41 和 #48 对应于井 A01, A08, F01 并且 F08 为α数字编码, 也打印入耕种中期计划本身。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 第一次迭代的详细结果.(A) 基于迭代1的实验数据的克里格插值。红色点表示数据集。为比较, 所有三插值表面是堆在一个情节 (深蓝: 0 x 参考, 格子: 1 x 参考, 浅蓝色: 2 x 参考)。可以在其他15中找到结果的替代表示形式。(B) 克里格插值基于在迭代 1 (红点) 和迭代 2 (黄色正方形) 中执行的实验。此图中显示的部分数据以前已发布15。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 迭代收集的优化结果的描述.(A) 最后的克里格模型预测。(B) 基于统计的z测试的最佳区域 (red) 的统计标识 (由 KriKit 提供)。方框表示迭代设计和实验执行的连续步骤。此图中显示的部分数据以前已发布15。请单击此处查看此图的较大版本.
| 组件 | 归一化系数均值 |
| Fe2 + | -0.08 |
| 锰2 + | -0.05 |
| Zn2 + | -0.21 |
| Cu2 + | -0.21 |
| NH4+ | -2.04 |
| Ni2 + | -0.11 |
| Co2 + | -0.10 |
| MoO42- | 0.03 |
| BO33- | 0.06 |
| Ca2 + | 1.00 |
| Mg2 + | 0.45 |
表 1: 灵敏度分析的结果.系数值表示平均效果时, 增加各自的媒体组件集中从它的中心值, 以其最大值。对于最优化的实验设计, 如标准文献中所示, 标准偏差直接表现为参考实验的复制所引起的实验变化。系数值由最大值 (0.0422 用于组件 Ca2 +) 进行规范化。归一化和绝对系数标准差分别为0.54 和0.0226。
| 组件 | 归一化系数均值 |
| Fe2 + | -1.00 |
| 锰2 + | 1.00 |
| Zn2 + | -3.48 |
| Cu2 + | -0.52 |
| NH4+ | -15.95 |
| Ni2 + | 0.69 |
| Co2 + | -0.51 |
| MoO42- | -0.45 |
| BO33- | -1.11 |
表 2: 最终灵敏度分析的结果.系数值表示平均效果时, 增加各自的媒体组件集中从它的中心值, 以其最大值。由于采用了最佳的实验设计, 标准差只取决于实验的变化, 采用优化的介质组成。实验变异比使用参考介质的变异略有增加。系数值由最大值 (0.0106 用于组件锰2 +) 进行规范化。归一化和绝对系数标准差分别为3.63 和0.0385。
Discussion
所提出的协议的一般性质允许各种适应,例如, 用于研究其他微生物表达式主机9,47,48,49,50,51, 或优化目标蛋白的其他属性, 如糖基化模式或二硫化物键。该议定书也可能需要适应现有的实验室设备。MBR 系统的集成允许增加实验吞吐量, 从而节省了大量时间。然而, 当用 MBR 系统替换完全检测和可控的生物反应器时, 结果的可伸缩性必须考虑8、37、52、53。使用 DOE 方法和数学建模有助于通过有效的实验规划和基于模型的数据解释15, 将测量数据的信息内容与所研究的目标54最大化。
对方法的修改
在这项研究中使用的多用途和可扩展的机器人液体处理系统旁边, 应该提到的是, 有几个较小的可供商业使用的液体处理系统, 它们能够执行这项任务, 并且可以放在层流工作台。如果没有自动移系统, 则根据 DOE 计划的不同媒体组合也可以通过使用单声道和/或多渠道管的手动移实现。由于手工准备更容易出错, 并且需要高度集中的工作很长一段时间, 建议准备较低数量的不同媒体组合。
根据被雇用的 MBR 系统的能力, 相应的耕种协议将变化。例如, 如果没有在线测量生物量的形成, 它可能就足以在生长试验完成后测量生物量的浓度。与 pH 值和溶解氧的在线监测相结合, 在几个 MBR 系统中实现, 可以安全地确定生长饱和度。原则上, 生长实验可以进行台胞单独放置在震动孵化器内, 而不使用一个 MBR 系统。在这种情况下, 必须确保适当的耕作条件: (1) 使用适当的几何台胞, 结合适当的震动频率和震动直径, 可以避免氧气有限的耕作,例如, 正方形96或24深井板操作在1000转每分钟在3毫米投掷或在250转每分钟在25毫米投掷, 分别。重要的是, 可实现的最大氧转移率越低, 主要碳源的浓度越低。如上所述, 在本研究中, 10 克/L 葡萄糖的使用适合于防止受雇的耕作条件的氧气限制;(2) 对生物量和产品定量的中期培养的抽样应减少到最低限度。每次将中期计划从摇箱中移除时, 氧气转移会立即分解, 从而导致不利的耕作条件;(3) 作者认为, 不建议使用中期计划读者作为培养设备, 因为这些设备不是为此目的开发的。例如, 振动力学是为偶尔混合板后的试剂添加, 因此, 往往缺乏鲁棒性长期连续晃动持续数天。此外, 这些读者无法实现微生物培育所需的足够功率输入。光密度读数在短时间间隔内的积分需要停止震动运动, 从而导致重复的氧限制周期。此外, 这种系统在长时间耕作期间的蒸发会扭曲结果。有关使用台胞进行微生物培育的令人惊讶的复杂主题的详细信息, 读者可以参考引用的文献22,23,24,25,26和其中的引用。
进一步考虑
为了加速迭代优化步骤, 建议仔细选择产品量化的分析方法。由于迭代实验设计策略容忍实验误差, 因此, 快速、简单的方法应以精度和精确度为代价。然而, 最终的结果必须得到验证, 以充分准确和准确的产品量化方法, 可能会更复杂。一般来说, 仔细的评估和决策的研究程序需要努力在开始的研究, 但长期支付, 在常规的方法已经建立。
强烈建议定义一个参照实验, 它与在优化过程中的所有实验进行比较。即, 所应用的介质成分浓度和测量输出均通过参考值进行归一化。这样, 每个应用和测量值都可以被解释为参考值的 x-fold。考虑到板块之间的变化, 每个板块都进行五参考实验。度量结果的平均值用于规范化。
一般不保证所开发的培养基对其他菌株也是最佳的。然而, 改良后的培养基也很可能适合培养具有小遗传差异的表达菌株,例如, 当产生由诱变研究获得的单一氨基酸替代品的酶变体时 (虽然单点突变已被描述为影响细胞代谢和外源表达性能55,56)。在这种情况下, 所提出的协议可以是第一步, 其次是高通量表达式筛选的协议57。如果协议被用于中等发展与随后扩大到哺养的分批耕种, 优选的媒介应该被核实为对应的生物条件, 当克隆筛选运动在微尺度辨认了不同的顶端执行者为不同的哺养的战略和耕种媒介52,58。此外, 引入的 KriKit36通常可以促进改进的整体生物优化。直到最近, 工具能力也被扩展到支持多目标优化40, 这对于优化上游和下游进程都很重要59,60。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
经济科学中心的科学活动在北威州-Strategieprojekt BioSC (No. 313/323-400-002 13) 框架内由创新、科学和研究部资助。作者感谢北莱茵-威斯特伐利亚和 Heine 大学的创新、科学和研究部, 在 CLIB 研究生集群工业生物技术领域获得了 Freier 的奖学金。从德国亥姆霍兹协会的 "亥姆霍兹创新实验室" 的 "授权空间计划" 中获得了进一步的资金支持 "微生物生物实验室--亥姆霍兹创新实验室"。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLector | m2p-labs | G-BL-100 | |
| Flowerplate | m2p-labs | MTP-48-BOH | For cultivation in the BioLector device |
| Sealing foil | m2p-labs | F-GP-10 | Sterile sealing for Flowerplate |
| MATLAB | Mathworks | 2016b | |
| KriKit | Forschungszentrum Jülich | n/a | Freely available, MATLAB installation required |
| Janus pipetting robot | Perkin Elmer | n/a | Includes "WinPrep" software installation |
| 12-column deep well microplate | E&K Scientific | EK-2034 | Container for medium stock solutions |
| 96 well microplates, transparent, F-bottom | Greiner | 655101 | For Bradford protein assay |
| µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom | Greiner | 655087 | For flourescence measurement in cell-free supernatants |
| Pipette Research plus multi-channel pipettes | Eppendorf | n/a | Facilitates manual liquid handling with microplates |
| TruPAG Precast Gels | Sigma | PCG2002 | For SDS-Page analysis of cell-free supernantants |
| Bradford Reagent | Sigma | B6916 | |
| C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP | n/a | n/a | Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007) |
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