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Bioengineering

Heterologous प्रोटीन उत्पादन के अनुकूलन के लिए जेनेरिक प्रोटोकॉल स्वचालित Microbioreactor प्रौद्योगिकी का उपयोग

Published: December 15, 2017 doi: 10.3791/56234
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2,4
1IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich, 2Research Center Jülich, Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB), RWTH Aachen University, 4Institute for Biotechnology, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

यह पांडुलिपि सूक्ष्म जीवाणु खेती मीडिया की दर्जी डिजाइन के लिए एक सामांय दृष्टिकोण का वर्णन । यह एक चलने Kriging आधारित प्रयोगात्मक डिजाइन और पर्याप्त खेती के प्रवाह के लिए microbioreactor प्रौद्योगिकी के संयोजन कार्यप्रवाह द्वारा सक्षम है, जो प्रयोगशाला रोबोटिक्स द्वारा समर्थित है विश्वसनीयता और तरल हैंडलिंग मीडिया में गति बढ़ाने के लिए तैयारी.

Abstract

औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी में एक मुख्य व्यापार माइक्रोबियल उत्पादन सेल कारखानों का उपयोग कर तनाव इंजीनियरिंग और जैविक प्रक्रिया की स्थिति के अनुकूलन के चलने प्रक्रिया है । एक महत्वपूर्ण पहलू खेती के सुधार माध्यम हित के उत्पाद के माइक्रोबियल गठन के लिए एक इष्टतम वातावरण प्रदान करने के लिए है । यह अच्छी तरह से स्वीकार किया है कि मीडिया संरचना नाटकीय रूप से समग्र प्रक्रिया के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं । पोषण मध्यम अनुकूलन माइक्रोबियल प्रणालियों के साथ संयोजक प्रोटीन उत्पादन में सुधार करने के लिए जाना जाता है और इस प्रकार, इस प्रक्रिया के विकास में एक पुरस्कृत कदम है । हालांकि, बहुत बार मानक मीडिया व्यंजनों साहित्य से लिया जाता है, के बाद दर्जी खेती के माध्यम से बनाया डिजाइन एक थकाऊ काम है कि मांग microbioreactor प्रौद्योगिकी के लिए पर्याप्त खेती का प्रवाह, तेजी से उत्पाद विश्लेषिकी, साथ ही समर्थन प्रयोगशाला रोबोटिक्स द्वारा तरल हैंडलिंग चरणों में विश्वसनीयता सक्षम करने के लिए । इसके अलावा, उन्नत गणितीय तरीकों को तर्कसंगत रूप से माप डेटा का विश्लेषण करने और इष्टतम जानकारी सामग्री प्राप्त करने के लिए कुशलता से समानांतर प्रयोगों को डिज़ाइन करने के लिए आवश्यक हैं.

प्रस्तुत प्रोटोकॉल की जेनेरिक प्रकृति विभिंन प्रयोगशाला उपकरण, अंय अभिव्यक्ति मेजबान के लिए आसान अनुकूलन के लिए अनुमति देता है, और ब्याज की लक्ष्य प्रोटीन, साथ ही साथ आगे की प्रक्रिया के मानकों । इसके अलावा, अंय प्रोटीन उत्पादन दर, विशिष्ट उपज, या उत्पाद की गुणवत्ता की तरह अनुकूलन उद्देश्यों के लिए अंय अनुकूलन अध्ययन के दायरे में फिट चुना जा सकता है । एप्लाइड Kriging Toolbox (KriKit) प्रयोगों के डिजाइन के लिए एक सामान्य उपकरण (डो) कि बेहतर समग्र प्रक्रिया अनुकूलन के लिए योगदान देता है. यह भी बहु उद्देश्य अनुकूलन जो दोनों नदी के नीचे और बहाव प्रक्रियाओं के अनुकूलन में महत्वपूर्ण हो सकता है का समर्थन करता है ।

Introduction

आधुनिक संयोजक जीन प्रौद्योगिकी दवा उद्योग में विभिंन अनुप्रयोगों के लिए तकनीकी एंजाइमों के व्यापक उपयोग में सक्षम बनाता है, पशु खिला, कार्बनिक रसायन, और खाद्य प्रसंस्करण1,2,3। भारी मात्रा में तकनीकी एंजाइमों का उत्पादन औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी के लिए एक प्रमुख विषय है और अनुकूलित संयोजक प्रोटीन उत्पादन के लिए, और दोनों तनाव और जैव प्रक्रिया इंजीनियरिंग की जरूरत है । कुशलता से इंजीनियर उत्पादन उपभेदों की पीढ़ी के लिए, विभिंन आनुवंशिक पुस्तकालयों उपलब्ध हैं, जैसे, संतुलित जीन अभिव्यक्ति4 या वृद्धि हुई स्राव दक्षता5के लिए ।

Corynebacterium glutamicum औद्योगिक पैमाने6,7 में अमीनो एसिड की एक प्रमुख निर्माता है और संयोजक प्रोटीन8 के स्रावी उत्पादन के लिए एक आकर्षक गैर पारंपरिक अभिव्यक्ति मेजबान का प्रतिनिधित्व करता है ,9. दोनों जनरल स्रावी (एसईसी) और जुड़वां arginine translocation (जैसे) मार्ग सी. glutamicum में मौजूद है और सफलतापूर्वक संयोजक प्रोटीन स्राव10के लिए आवेदन किया गया । औद्योगिक पैमाने पर एमिनो एसिड उत्पादन के बारे में प्रक्रिया इंजीनियरिंग में व्यापक अनुभव है, के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए प्रोटीन के लिए जी/L मात्रा में स्रावित करने की क्षमता11 और बड़े पैमाने पर पाए जाने वाले प्रक्रिया सजातीयताओं के विषय में महान मजबूती खेती12,13, बना सी glutamicum औद्योगिक पैमाने पर heterologous प्रोटीन के स्रावी उत्पादन के लिए एक होनहार मंच जीव ।

पोषण मध्यम अनुकूलन माइक्रोबियल प्रणालियों के साथ संयोजक प्रोटीन उत्पादन में सुधार करने के लिए जाना जाता है14,15,16,17 और फलस्वरूप, मध्यम का समायोजन संरचना इष्टतम उत्पादकता18,19,20,21के संबंध में एक पुरस्कृत कदम है । माइक्रोबियल खेती के लिए microtiter प्लेटों (MTPs) के आवेदन पर गहन अनुसंधान22,23,24 सूक्ष्म जीवाणु खेती के लिए MTPs के विकास और डिजाइन के लिए रास्ता प्रशस्त25 ,26 और ऑनलाइन निगरानी और पर्यावरण नियंत्रण के साथ एमटीपी आधारित microbioreactor (MBR) प्रणालियों का विकास27,28। MBRs प्रयोगात्मक खेती के प्रवाह में एक महत्वपूर्ण वृद्धि सक्षम करें । इसके अलावा, MBR सिस्टम के अन्य प्रकारों से उपजी है, उदा, बुलबुला कॉलम या उभारा टैंक रिएक्टरों, माइक्रोबियल जैविक प्रक्रिया अनुकूलन के लिए उपलब्ध हैं29,30,31, ३२.

सामान्य तौर पर, ऑप्टिमाइज़ेशन अध्ययन वृद्धि प्रयोगात्मक प्रवाह से लाभ, जो भी डो के तरीके के साथ संयोजन में और अधिक शक्तिशाली हो जाता है, जैसे डिजाइन चर के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए या उच्च आयामी खोज रिक्त स्थान को कम. नतीजतन, MBR सिस्टम का संयुक्त उपयोग, प्रयोगशाला स्वचालन, और डो जैव प्रौद्योगिकी8,16,३३,३४,३५में एक शक्तिशाली विधि साबित हुआ है ।

मीडिया अनुकूलन के लिए एक प्रोटोकॉल के संयोजन के राज्य के अत्याधुनिक प्रयोगशाला स्वचालन प्रस्तुत किया है, ऑनलाइन प्रक्रिया की निगरानी के साथ MBR प्रौद्योगिकी, और Kriging आधारित डेटा विश्लेषण/ Kriging पद्धति एक MATLAB Toolbox में लागू किया गया है ("KriKit") जो डाउनलोड और नि: शुल्क३६का उपयोग किया जा सकता है । अनुप्रयोग उदाहरण के रूप में, स्रावी ग्रीन fluorescent प्रोटीन (GFP) उत्पादन के साथ ग. glutamicum का अधिकतम CgXII ंयूनतम माध्यम की संरचना के अनुकूलन द्वारा दिखाया गया है । GFP titer अनुकूलन उद्देश्य के रूप में चुना गया था के रूप में इसे आसानी से मात्रा जा सकता है और यह व्यापक रूप से MBR सिस्टम पर अध्ययन के लिए मॉडल प्रोटीन के रूप में लागू किया जाता है३७,३८,३९।

प्रस्तुत ढांचा चार चरणों में विभाजित है, जो चित्रा 1में सचित्र हैं । चरण बॉक्स फ़्रेम द्वारा इंगित किए जाते है और प्रोटोकॉल के अनुभागों के संगत होते हैं । पहला चरण (चित्र 1a) प्रोजेक्ट लक्ष्यों को परिभाषित करने और आवश्यक विधियों को निर्धारित करने के लिए है । डो के तरीके, MBR प्रौद्योगिकी, और प्रयोगशाला स्वचालन के संयोजन एक वृद्धि की प्रयोगात्मक प्रवाह है कि मांग शक्तिशाली डेटा प्रोसेसिंग की अनुमति देता है । दूसरा कदम (आंकड़ा 1b) के लिए संवेदनशील डिजाइन चर का पता लगाने (यानी, मध्यम घटक) अनुकूलन उद्देश्य पर उच्च प्रभाव के साथ करना है । यह ब्याज की डिजाइन चर की एक कम संख्या की ओर जाता है । तीसरा कदम (चित्रा 1C) शेष डिजाइन चर और ब्याज के उद्देश्य के बीच कार्यात्मक संबंध की एक अधिक विस्तृत जांच के लिए एक चलने अनुकूलन शामिल हैं । क्रमिक विस्तारित डेटा सेट का उपयोग करना, Kriging दृष्टिकोण unमापना स्थानों पर प्रयोगात्मक परिणाम की भविष्यवाणी के लिए लागू किया जाता है । चलने चक्र के रूप में जल्द ही बंद हो जाता है के रूप में Kriging मॉडल पर्याप्त सटीकता के साथ एक इष्टतम या पठार भविष्यवाणी । परिणाम चौथे चरण (चित्र 1 d) में सत्यापित कर रहे हैं, की पहचान इष्टतम चारों ओर एक और संवेदनशीलता विश्लेषण के साथ शुरुआत । यदि शुरू में, असंवेदनशील घटकों को भी इष्टतम क्षेत्र में असंवेदनशील पाए जाते हैं, यह मान लेना उचित है कि यह तीसरे चरण में चलने अनुकूलन प्रक्रिया के दौरान सच रखती है । बाद में, यह एक गतिविधि परख या एसडीएस-पृष्ठ की तरह, ओर्थोगोनल तरीकों के आवेदन के द्वारा अनुकूलन परिणामों की पुष्टि करने की सलाह दी है ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल की जेनेरिक प्रकृति अलग प्रयोगशाला उपकरण, अन्य अभिव्यक्ति मेजबान के लिए आसान अनुकूलन के लिए अनुमति देता है, और पसंद का लक्ष्य प्रोटीन, और साथ ही पीएच मूल्य या खेती के तापमान की तरह आगे की प्रक्रिया चर ।इसके अलावा, अंय प्रोटीन उत्पादन दर, विशिष्ट उपज, या उत्पाद की गुणवत्ता की तरह अनुकूलन उद्देश्यों के लिए अंय अनुकूलन अध्ययन के दायरे में फिट चुना जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1 : अनुकूलन अध्ययन के कार्यप्रवाह । चार फ्रेम बक्से प्रोटोकॉल के वर्गों के अनुरूप है, "अध्ययन और तरीकों की परिभाषा की कल्पना" (खंड 1), "संवेदनशीलता विश्लेषण" (खंड 2), "चलने अनुकूलन" (धारा 3), और "मांयता" (खंड 4) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

1. अध्ययन की कल्पना और विधियों की परिभाषा (चित्रा 1: भाग एक)

नोट: अनुकूलन उद्देश्य की परिभाषा: उत्पाद के गठन की जरूरत का समय पाठ्यक्रम है या केवल एक सीमित समय अंतराल या यहां तक कि एक निश्चित समय बिंदु प्रासंगिक है? इसके अलावा, स्थिरता, विश्लेषणात्मक ठहराव के प्रयास, या खेती के समय जैसे संभावित मुद्दों पर विचार करें । अंतिम प्रोटीन titer के विकल्प के रूप में, अन्य उद्देश्यों को बायोमास या खेती के समय के रूप में माना जा सकता है । बायोमास बायोमास विशिष्ट उत्पाद उपज द्वारा परिलक्षित होता है, जबकि खेती के समय अंतरिक्ष समय की उपज से परिलक्षित होता है । (न्यूनतम) उत्पाद की गुणवत्ता भी एक उद्देश्य हो सकता है । कुछ स्थितियों में बहु-उद्देश्य अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, जैसा कि कहीं४०पर चर्चा की गई । इस अध्ययन में, खेती के 17 ज के बाद GFP titer अनुकूलन उद्देश्य के रूप में चुना गया था । GFP प्रतिदीप्ति इस अध्ययन है, जो बहुत मॉडल प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण सरल में उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर ऑनलाइन पीछा किया जा सकता है ।
नोट: अनुकूलित किया जा करने के लिए पैरामीटर्स की परिभाषा: CgXII मध्यम 16 व्यक्तिगत घटकों के होते हैं४१ और एक पूर्ण कारक डिजाइन में इन सभी की जांच 216 ≈ ६५,००० प्रयोगों में परिणाम होगा. नतीजतन, खोज अंतरिक्ष के लिए एक तर्कसंगत और अनुभव संचालित आधार पर कम की जरूरत है । मीडिया घटकों के अनुकूलन के लिए विचार के चयन उपलब्ध विशेषज्ञ ज्ञान या साहित्य डेटा द्वारा समर्थित किया जा सकता है ।

  1. जो मध्यम घटक सांद्रता अलग नहीं किया जाना चाहिए तय करते हैं । CgXII माध्यम के अनुकूलन के लिए, निम्न घटकों को निश्चित करने के लिए चुना गया:
    1. ग्लूकोज 10 ग्राम/L पर तय होता है । इस अनुकूलन तुच्छ है क्योंकि अधिक ग्लूकोज पैदावार अधिक GFP बायोमास स्रावित । इसका उद्देश्य गैर-सहज मध्यम प्रभाव को प्रकट करना था ।
    2. 3-(N-morpholino) propanesulfonic अम्ल (MOPS) ४२ g/L पर स्थिर है । यह बैच खेती के दौरान पर्याप्त बफ़रिंग क्षमता प्रदान करता है और metabolized नहीं है ।
      नोट: इस अंतिम एकाग्रता में MOPS के अलावा पीएच 7 के एक प्रारंभिक मूल्य सुनिश्चित करता है, यहां तक कि अंय स्टॉक समाधान के विभिंन संस्करणों के साथ जोड़ा है, जो पीएच 7 पर नहीं कर रहे हैं । तथापि, पीएच मूल्यों को शुरू करने में किसी भी विचलन को बाहर करने के लिए, पीएच मध्यम रचनाओं जहां सभी स्टॉक समाधान उनके अधिकतम और न्यूनतम मात्रा में जोड़ रहे हैं के लिए जाँच की जानी चाहिए.
    3. KH2पो4 और K2HPO4 1 g/L प्रत्येक पर स्थिर हैं । ये भी बफर क्षमता प्रदान करते हैं, और एक फॉस्फेट स्रोत के रूप में सेवा.
    4. यूरिया 5 ग्राम/L पर तय होता है । यह एक बेसल नाइट्रोजन स्रोत और पीएच स्थिर एजेंट, N-सीमा को रोकने के लिए पर्याप्त के रूप में कार्य करता है ।
    5. बायोटिन ०.२ मिलीग्राम/एल. सी. glutamicum ATCC13032 बायोटिन के लिए auxotrophic है ।
    6. Protocatechuic एसिड (पीसीए) 30 मिलीग्राम/एल पर तय होता है । यह एक लौह chelating एजेंट के रूप में कार्य करता है ।
    7. Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) १०० µ मीटर पर स्थिर है । यह gfp जीन की अभिव्यक्ति लाती है ।
  2. प्रारंभिक संवेदनशीलता की जांच के लिए मीडिया घटकों के उच्च और निंन सांद्रता का चयन करें । यहां, घटक मीडिया घटकों के तीन विशिष्ट समूहों से चुना गया । प्रत्येक घटक के लिए जांच की कम और उच्च सांद्रता हैं:
    1. मानक नाइट्रोजन स्रोत: (NH4)2सू4 (8-32 g/ नाइट्रोजन स्रोत की भिंनता बायोमास-विशिष्ट GFP सिग्नल8के अनुकूलन के लिए होनहार होने की सूचना मिली थी ।
    2. तत्वों का पता लगाएं: FeSO4 ∙ 7 एच2ओ (4-16 mg/l), MnSO4 ∙ एच2ओ (4-16 मिलीग्राम/एल), ZnSO4 ∙ 7 ज2ओ (0.4-1.6 mg/l), CuSO4 ∙ 5 ज2o (125-501 µ g/l), NiCl2 ∙ 6 ज2ओ ( 8-32 µ g/l) व CoCl2 ∙ 6 ज2O (52-208 µ g/l). ट्रेस तत्वों की संरचना CgXII मीडियम४१के पहले प्रकाशन से इनहेरिट की गई है । इसके अलावा, Na2मू4 ∙ ज2ओ (26-104 µ g/l) और H3बो3 (20-80 µ g/l) को ट्रेस तत्वों के रूप में शामिल किया गया, क्योंकि वे CgXII मीडियम४२के प्रकाशित वैरिएंट में इस्तेमाल होते हैं ।
    3. स्थूल तत्वों: MgSO4 ∙ 7 एच2ओ (0.2-0.4 g/l), CaCl2 ∙ 2 एच2ओ (5.3-21.2 मिलीग्राम/एल) । ये अन्य divalent cations के बीच में पाए गए एक अन्य अध्ययन में स्रावी GFP उत्पादन को बढ़ाने के लिए14, जहां सी. glutamicum तनाव आर एक अलग माध्यम पृष्ठभूमि और CgR0949 जैसे संकेत पेप्टाइड के साथ इस्तेमाल किया गया था.
  3. सामग्री और परिभाषा प्रक्रियाओं की तैयारी
    नोट: यह एक विस्तृत स्तर पर प्रयोगात्मक तरीकों को परिभाषित करने और ठीक करने की सलाह दी है । यह मानकीकरण सुनिश्चित करता है कि विभिंन परिणामों को वापस आंतरिक जैविक परिवर्तनशीलता या विभिंन माध्यम रचनाओं को पता लगाया जा सकता है ।
    नोट: मीडिया स्टॉक समाधान: सभी जांचे गए मीडिया घटकों के लिए व्यक्तिगत स्टॉक समाधान तैयार करें । उच्च केंद्रित शेयर तैयार करने के लिए सभी घटकों के लिए विभिंन संस्करणों के कमजोर पड़ने के लिए अनुमति देते हैं । इसका मतलब यह है कि डिजाइन योजना के अनुसार अपने उच्चतम मात्रा में सभी स्टॉक समाधान के संयोजन के बाद, यह अंतिम खेती की मात्रा, cf. अनुच्छेद "जनरेशन मध्यम स्टॉक समाधान pipetting सूची" चरण 1.3.3 से अधिक नहीं हो सकता । यदि एक बहुत कम अतिरिक्त मात्रा में एक उच्च केंद्रित समाधान के परिणाम के अलावा, उदा & #60; अंतिम खेती की मात्रा के 1/100वें , शेयर समाधान तदनुसार पतला । उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में एक pipetting मात्रा से कम 10 µ एल के लिए व्यवहार्य होना परिभाषित किया गया था । आमतौर पर, ट्रेस तत्व समाधान के रूप में उच्च के रूप में केंद्रित कर रहे है 1, 000fold मध्यम में अंतिम मानक एकाग्रता के संबंध में । यह गुणक के रूप में मीडिया घटकों ध्यान केंद्रित करने के लिए लाभप्रद है (एक्स गुना) संदर्भ नुस्खा में सांद्रता के संबंध में । ऐसा करने से, भिन्नात्मक दशमलवों की साध्य pipetting मात्राएँ टाल दी जाती हैं. अनुपूरक दस्तावेज में CgXII माध्यम के सभी स्टॉक समाधानों के लिए विस्तृत व्यंजन दिए गए हैं ।
    1. वर्किंग सेल बैंक (डब्ल्यूसीबी)
      नोट: प्रत्येक विकास प्रयोग के लिए, एक डब्ल्यूसीबी aliquot का प्रयोग किया जाता है । यदि अधिक aliquots की जरूरत है, १,००० मिलीलीटर में १०० मिलीलीटर ब्रेन हार्ट इन्फ्यूश़न (BHI) मध्यम का उपयोग करें हिला कुप्पी या लगाना कई शेक कुप्पी, जो ग्लिसरॉल समाधान के अलावा पहले परित हैं ।
      1. संयोजक अभिव्यक्ति की एकल कालोनियों तैयार करें तनाव सी. glutamicum pCGPhoDबीएस-GFP४३ पर आगर प्लेट्स (३७ g/l BHI powder, 20 g/l आगर, 25 mg/l कनमीसिन). चढ़ाना सामग्री या तो ताजा परिवर्तन से या एक cryopreserved aliquot से आ सकते हैं ।
एकल कालोनियों की उपस्थिति तक 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन; यह आमतौर पर एक से दो दिन लगते हैं ।
  • लगाना एक शेखर कुप्पी संस्कृति (५० एमएल BHI मध्यम के साथ 25 मिलीग्राम/L कनमीसिन, ५०० मिलीलीटर चकरा कुप्पी, २५० rpm, 25 मिमी मिलाते हुए व्यास, 30 डिग्री सेल्सियस) के साथ कॉलोनी सामग्री और रात भर गर्मी (लगभग 16 एच) ।
  • ५०० g/L बाँझ ग्लिसरॉल समाधान की एक मात्रा के साथ परिणामी कक्ष निलंबन का एक खंड संयोजित करें और 2 मिलीलीटर aliquots में बाँझ cryopreservation शीशियों में वितरित । पर स्टोर-८० ° c ।
  • MBR खेती प्रोटोकॉल
    नोट: इस अध्ययन में कार्यरत BioLector MBR प्रणाली के लिए, बिखरे हुए प्रकाश (बायोमास) और GFP प्रतिदीप्ति तीव्रता माप है, जो एक निश्चित लाभ सौंपा मूल्य की जरूरत है । उच्च लाभ, उच्च ऑप्टिकल संकेत परिलक्षित होता है; यही कारण है कि बिखरे हुए प्रकाश और प्रतिदीप्ति मनमानी इकाइयों (a.u.) में मापा जाता है । प्रारंभिक प्रयोगों में बायोमास और GFP का पता लगाने के लिए उपयुक्त लाभ मूल्यों का निर्धारण, उपयुक्त मिलाते हुए आवृत्ति के साथ और बाद की प्रक्रिया चरणों के दौरान उच्च बायोमास सांद्रता पर ऑक्सीजन सीमा से बचने के लिए मात्रा भरना. रोजगार की खेती की स्थिति ("Flowerplates", यानी, फूल के आकार का ४८-अच्छी तरह से MTPs, १,२०० rpm की आवृत्ति मिलाते हुए, १,००० µ एल की मात्रा भरने, 10 ग्राम/एल ग्लूकोज मुख्य कार्बन स्रोत के रूप में) ऑक्सीजन असीमित खेती सुनिश्चित की । अधिकतम ऑक्सीजन हस्तांतरण मात्रा भरने और फूल के आकार का ४८-well MTPs, डेटा पत्रक आपूर्तिकर्ता से प्राप्त आवृत्तियों में मिलाते हुए के अन्य संयोजनों से जिसके परिणामस्वरूप दरों के लिए उपलब्ध हैं । इसके अलावा, व्यक्तिगत संस्कृतियों के विकास दोष माध्यमिक सब्सट्रेट (जैसे, नाइट्रोजन, तत्वों का पता लगाने) की कम मात्रा के कारण हो सकता है । इसलिए, खेती के अंत में बायोमास सांद्रता की जांच करें । इस अध्ययन में ऐसा कोई विकास प्रभाव नहीं देखा गया ।
    1. खेती प्रोटोकॉल MBR सिस्टम ("BioLector") के लिए निम्नानुसार परिभाषित करें:
    2. Filterset 1: बायोमास, लाभ 14 । Filterset 2: पीएच, लाभ पूर्व निर्धारित है । Filterset 3: pO2, लाभ पूर्व निर्धारित है । 4: GFP, लाभ ८० ।
    3. झटकों आवृत्ति: १,२०० rpm ।
    4. तापमान: 30 ° c ।
    5. चक्र समय: 15 min.
    6. प्रयोग समय: मैनुअल (खेती स्वचालित रूप से बंद नहीं किया जाएगा) ।
  • मध्यम स्टॉक समाधान pipetting सूची की जनरेशन
    नोट: लगभग किसी भी तरल हैंडलिंग रोबोट प्रणाली बाहरी फ़ाइलों से pipetting कार्रवाई को पढ़ने में सक्षम है । मूलतः, ंयूनतम जानकारी की जरूरत स्थानांतरण मात्रा और reagent स्रोत की स्थिति है, साथ ही साथ प्रत्येक के गंतव्य रोबोट डेक पर एक labware स्थिति और labware के भीतर एक विशेष गुहा द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । हालांकि, अलग तरल हैंडलिंग सिस्टम के लिए अलग वाक्यविंयास पर विचार किया जाना चाहिए । चित्रा 2 इस अध्ययन में कार्यरत pipetting प्रणाली के लिए एक उदाहरण फ़ाइल संरचना से पता चलता है ।
    1. स्टॉक समाधान के चार प्रकार के प्रत्येक खेती में अच्छी तरह से pipetted हैं:
      1. मीडिया घटकों के स्टॉक समाधान जो विविध हैं ("भिंनता स्टॉक्स") ।
      2. पानी के ऊपर स्टॉक के विभिंन संचई संस्करणों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए ।
      3. एक स्टॉक समाधान ("शेष स्टॉक") जिसमें सभी घटक निश्चित होते हैं । इस शेयर समाधान विभिंन घटकों है कि कर रहे हैं, उदा, विभिंन तापमान पर संग्रहीत या विभिंन तरीकों से निष्फल युक्त शेयरों से बना सकते हैं ।
      4. इनोक्युलम, जो पिछले घटक के रूप में जोड़ा जाना चाहिए और worktable पर डाल बस के अलावा पहले कोशिकाओं के बसने से बचने के लिए ।
    2. खेती के प्रति अच्छी तरह से, के अनुसार सभी मीडिया घटकों के लिए स्थानांतरित करने के लिए वॉल्यूम की गणना:
      Equation 1
      वॉल्यूम कुछ भिंनता स्टॉक के लिए जोड़ा जा सकता है शूंय, अर्थात, जब इस विशिष्ट घटक छोड़ा जाता है ।
    3. उपयुक्त संख्याओं के लिए सभी परिकलित वॉल्यूंस Vi को संशोधित करना । वॉल्यूम चरणों में Pipetting वॉल्यूम वृद्धि बहुत छोटा नहीं होना चाहिए । यदि आवश्यक हो, तो भिंनता स्टॉक्सकी सांद्रता समायोजित करें । उदाहरण के लिए, न्यूनतम pipetting वॉल्यूम यहाँ 10 µ l के रूप में परिभाषित किया गया था, और न्यूनतम वृद्धि 5 µ l के रूप में परिभाषित किया गया था. सामान्य रूप से, इन वॉल्यूंस प्रयोग किया जाता सटीक और सटीकता के आधार पर प्रयुक्त तरल हैंडलिंग स्टेशन15,४४के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए ।
    4. इस प्रकार सभी कुओं के लिए निश्चित घटकों वाले बाकी स्टॉक की मात्रा की गणना:
      Equation 2
      जहां भिंनता स्टॉक का अधिकतम संचई वॉल्यूम उपयोग किया जाता है । Equation 3 नतीजतन, इस प्रकार के रूप में बाकी स्टॉक में निश्चित घटकों की आवश्यक सांद्रता की गणना:
      Equation 4
      तदनुसार बाकी स्टॉक तैयार करें ।
    5. खेती के प्रति अच्छी तरह से, पानी की मात्रा की गणना के रूप में जोड़ा जा करने के लिए इस प्रकार है:
      Equation 5
    6. खेती के प्रति अच्छी तरह से, सूची सभी संस्करणों के अलावा के निंनलिखित क्रम में जोड़ा जा करने के लिए: vH2O, वीRestStock, वीमैं, वीInok। pipetting सूची को लिक्विड हैंडलिंग स्टेशन के विनिर्देशों के अनुसार स्वरूपित करें, जैसा कि आरेख 2में एक उदाहरण के लिए दिखाया गया है ।
  • बीज संस्कृति, स्वचालित मीडिया तैयारी, और मुख्य संस्कृति की शुरुआत
    1. तरल हैंडलिंग रोबोट के लिए एक प्रोटोकॉल बनाएं । चित्रा 3 और चित्रा 4 एक "जानुस्" प्रणाली, इसी "WinPREP" सॉफ्टवेयर में कार्यांवित के लिए एक उदाहरण के लिए प्रोटोकॉल देखें । प्रोटोकॉल निंनलिखित पहलुओं पर विचार करना चाहिए:
      1. बाँझ आवास के एक पर्याप्त रनटाइम मीडिया तैयार करने से पहले शामिल हैं ।
      2. एक प्रारंभिक अत्यधिक सफाई और सभी pipetting सुझावों और टयूबिंग की धुलाई शामिल हैं ।
      3. स्टॉक समाधानों के लिए उपयुक्त labware संग्राहक चुनें । यहां, गहरी अच्छी तरह से 12 कॉलम के साथ प्लेटें भिंनता शेयरोंके भंडारण के लिए उपयुक्त हैं, के रूप में सभी आठ pipetting युक्तियां एक समानांतर व्यवस्था में अच्छी तरह से कॉलम में डुबकी कर सकते हैं । यह बहुत मीडिया तैयारी को गति । यदि 15 मिलीलीटर या ५० मिलीलीटर एजेंट ट्यूबों जलाशयों के रूप में उपयोग किया जाता है, केवल एक pipetting टिप में एक बार में डुबकी कर सकते हैं ।
    • पानी और बाकी स्टॉकजैसे अंय शेयरों के लिए, १०० मिलीलीटर गर्त उपयोग किया जाता है, के रूप में इन स्टॉक समाधान कुल में उच्च मात्रा की आवश्यकता है ।
  • अपशिष्ट आयतन, ऊँचाई pipetting ऑफसेट आदि की क्षतिपूर्ति के लिए प्रत्येक स्टॉक समाधान के लिए पर्याप्त कुल मात्रा प्रदान करें .
  • टीका चरण से पहले एक उपयोगकर्ता प्रॉंप्ट संमिलित करें, यह सुनिश्चित करना कि यह चरण बीज culture कार्यविधि से तुरंत पहले किया जाता है ।
  • एक बाँझ तरीके से सभी स्टॉक समाधान तैयार करें और उपयोग जब तक स्टोर, उचित कंटेनरों में, जैसे, बाँझ 15 मिलीलीटर और ५० मिलीलीटर परीक्षण ट्यूबों.
  • एक worktable पर स्टॉक समाधान भंडारण के लिए गहरी अच्छी तरह से प्लेटें निष्फल, जैसे, ७०% इथेनॉल और बाद में एक लामिना प्रवाह हूड में सुखाने के साथ पोंछते से ।
  • inoculating द्वारा बीज संस्कृति शुरू ५० मिलीलीटर BHI मध्यम से युक्त 25 मिलीग्राम/L कनमीसिन से एक aliquot के साथ डब्ल्यूसीबी । MBR खेती से पहले, एक पर्याप्त राशि में तेजी से बढ़ती बीज संस्कृतियों से ताजा, महत्वपूर्ण इनोक्युलम तैयार करते हैं ।
  • रोबोट worktable पर सभी आवश्यक labware प्लेस और इसी labware में स्टॉक समाधान डालना ।
  • मीडिया की तैयारी के लिए रोबोट कार्यप्रवाह प्रारंभ करें, ताकि अंतिम चरण (टीका), बीज संस्कृति की शुरुआत के साथ समय में पहुँच गया है. रोबोट कार्यप्रवाह के कुल रनटाइम पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए । यहां, कुल रनटाइम लगभग १.५ ज था ।
  • लगभग 2 घंटे के बाद बीज संस्कृति का नमूना है, तो प्रत्येक घंटा, ऑप्टिकल घनत्व (OD६००) द्वारा वृद्धि की निगरानी करने के लिए । लगभग 5 ज के बाद, संस्कृति 3-4 आयुध डिपो६०० तक पहुंच जाता है और मुख्य संस्कृतियों लगाना करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  • तरल हेंडलर worktable पर बीज संस्कृति प्लेस और मीडिया तैयारी प्रोटोकॉल जारी है । सील खेती टीका के बाद एमटीपी ।
  • सीलबंद खेती एमटीपी को BioLector डिवाइस में लगाएं और पूर्व निर्धारित खेती प्रोटोकॉल को शुरू करें ।
  • शेष स्टॉक समाधान निपटान, अगर आवश्यक सुरक्षा नियमों के अनुसार, और बीज रोबोट worktable से संस्कृति । पुन: प्रयोज्य labware साफ और तरल हैंडलर दूषण प्रोटोकॉल प्रारंभ करें ।
  • उत्पाद ठहराव और विश्लेषण के लिए कच्चे डेटा की प्रक्रिया
    1. एक 17 एच रनटाइम के बाद मुख्य संस्कृति बंद करो ।
    2. माप डेटा BioLector MBR डिवाइस से कनेक्टेड कंप्यूटर के लिए निर्माता के उपयोगकर्ता मैन्युअल के अनुसार BioLection सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग कर स्थानांतरित करें ।
    3. raw डेटा फ़ाइल को एक आसान पहुंच स्प्रेडशीट स्वरूप में कनवर्ट करने के लिए MBR सिस्टम के साथ जुडा हुआ "BioLection" सॉफ़्टवेयर पैकेज़ का "डेटा प्रबंधन → ट्रांस्फ़ॉर्म डेटा" फ़ंक्शन का उपयोग करें । सभी खेती कुओं के लिए टाइमस्टैंप स्तंभ से निकटतम 17 h के लिए GFP संकेत डेटा की प्रतिलिपि बनाएं संदर्भ खेती कुओं और औसत से GFP संकेतों की पहचान करें । औसत संदर्भ संकेत द्वारा शेष सभी GFP संकेत को सामान्य ।
    4. GFP titer अतिरिक्त विधियों का उपयोग कर बढ़ाता है (यदि आवश्यक हो)
      1. सभी खेती कुओं से रिलेबल्ड रिएक्शन ट्यूब में सेल सस्पेंशन स्थानांतरण और एक benchtop केंद्रापसारक का उपयोग अधिकतम गति से 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक के बाद सेल मुक्त supernatant प्राप्त करें ।
      2. स्थानांतरण २०० प्रत्येक कोशिका के µ l एक काले ९६ में मुक्त supernatant-अच्छी तरह से पारदर्शी नीचे के साथ एमटीपी, और एक उपयुक्त microplate रीडर का उपयोग कर 488/520 एनएम पर GFP विशिष्ट प्रतिदीप्ति पढ़ें । संदर्भ खेती से औसत संकेत के साथ सभी कुओं से GFP संकेत सामान्य, चरण 1.5.3 में के रूप में.
        नोट: निरपेक्ष GFP प्रतिदीप्ति संकेतों की तुलना विभिन्न माप डिवाइसों के लिए नहीं की जा सकती. इसलिए, सभी मुख्य खेती से 5 संदर्भ उपभेदों एक आंतरिक मानक के रूप में सेवा करते हैं । GFP titer के सुधार को आंतरिक मानक के संबंध में व्यक्त किया जा सकता है. यह विभिंन प्रयोगों और विभिंन GFP ठहराव तरीकों से परिणामों की तुलना के लिए अनुमति देता है (अगले दो कदम देखें) ।
      3. मानक प्रोटोकॉल के साथ सेल मुक्त supernatants के प्रोटीन सामग्री का निर्धारण, जैसे, ब्रैडफोर्ड या बीसीए परख । चरण 2 से परिणामों के साथ संयोजन में, एक प्रोटीन विशिष्ट GFP titer के निर्धारण संभव है ।
        नोट: प्रतिदीप्ति माप के बाद, इस microplate से सीधे नमूना का उपयोग करें । मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग बहुत आवश्यक तरल हैंडलिंग कदम की सुविधा ।
      4. यह सत्यापित करने के लिए कि अधिकांश वृद्धि प्रोटीन सामग्री वृद्धि GFP स्राव के कारण है के लिए कक्ष-मुक्त supernatants निम्न मानक प्रोटोकॉल का एक एसडीएस-पृष्ठ दृश्य निष्पादित करें ।
        नोट: एसडीएस-पृष्ठ पहले उल्लेखित विधियों, विशेष रूप से एक उच्च नमूना लोड के साथ अधिक श्रमसाध्य है । सत्यापन प्रयोजनों के लिए, यह अक्सर संदर्भ मध्यम और अंतिम अनुकूलित मध्यम खेती15से सेल मुक्त supernatants के एसडीएस-पृष्ठों को चलाने के लिए पर्याप्त है ।

    • 2. संवेदनशीलता विश्लेषण (चित्रा 1: भाग बी)

    नोट: इस भाग का लक्ष्य उन महत्वपूर्ण कारकों की पहचान करना है जिनका उद्देश्य पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है ।

    1. मीडिया घटकों की प्रारंभिक एकाग्रता श्रेणी चुनें । संदर्भ मध्यम संरचना चुना एकाग्रता पर्वतमाला के अंदर झूठ बोलना चाहिए ।
    2. कोई उपयुक्त डो चुनें । इस तरह के डिजाइन साहित्य में पाया जा सकता है, उदाहरणके लिए, NIST/SEMATECH e-हैंडबुक सांख्यिकीय विधि (www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm पर उपलब्ध) से । चुना डिजाइन ब्याज की मीडिया घटकों की संख्या (यहां, 11) और प्रदर्शन प्रयोगों की संख्या पर निर्भर करता है (यहां, ३२) । दिए गए उदाहरण में, डिजाइन "2IV11-6" चुना गया था कि ३२ प्रयोगों में परिणाम और ब्याज के उद्देश्य पर ग्यारह घटकों में से एक की एकाग्रता में वृद्धि के प्रभाव का आकलन की अनुमति देता है. अधिक विशिष्ट होने के लिए, मुख्य प्रभाव जोड़ी-वार फैक्टर इंटरैक्शन के साथ नहीं पाए जाते हैं. वे उच्च क्रम बातचीत कर रहे है कि, तथापि, सबसे महत्वपूर्ण नहीं होने की संभावना के साथ स्थापित किया जा सकता है ।
    3. शेष कुओं का उपयोग करें (यहां, 16) प्रक्रिया की reproducibility का आकलन करने के लिए संदर्भ माध्यम के साथ एकाधिक प्रतिकृति प्रदर्शन के लिए । प्रतिकृति समान रूप से प्लेट पर प्रसार के लिए स्थिति प्रभाव की खोज होनी चाहिए । संदर्भ प्रयोगों से मापा आउटपुट का माध्य मान सामान्यीकरण के लिए उपयोग किया जाता है । यही है, संवेदनशीलता विश्लेषण के प्रत्येक मापा उत्पादन संदर्भ उत्पादन का मतलब मूल्य से विभाजित है ।
    4. मुख्य गणना और यदि संभव हो तो उचित आँकड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मिश्रित प्रभाव. प्रयोग के क्लासिक डिजाइन एक बहुपद सन्निकटन४५पर आधारित है । उदाहरण के लिए, MATLAB फ़ंक्शन mvregress बहुपद गुणांक के आकलन के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
    mvregress समारोह सांख्यिकी और मशीन लर्निंग toolbox का हिस्सा है ।
  • tपरीक्षण का उपयोग करके उद्देश्य पर विभिंन मीडिया घटकों के प्रासंगिक प्रभावों को पहचानें । उदाहरण में, एनएच4+ एक महत्वपूर्ण नकारात्मक प्रभाव है, और Ca2 + और मिलीग्राम2 + सबसे मजबूत सकारात्मक प्रभाव (चित्रा 5) दिखाओ । क्योंकि GFP संकेत सामान्यीकृत किया गया था, गुणांक अपने अधिकतम मान के लिए,, इसके केंद्र मान से विशेष घटक की एकाग्रता में वृद्धि करते समय GFP संकेत में औसत सापेक्ष परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं । Equation 7
  • एक प्रासंगिक प्रभाव के बिना फिक्स्ड घटकों अनुकूलन के दौरान उनके संदर्भ मूल्य पर हैं ।

    • 3. चलने अनुकूलन (चित्रा 1: भाग सी)

    नोट: MATLAB उपकरण KriKit का उपयोग व्याख्या और सांख्यिकीय डेटा विश्लेषण३६के लिए किया गया था । KriKit उपयोगकर्ता एक डेटा का निर्माण करने की अनुमति देता है संचालित Kriging मॉडल । यह Kriging मॉडल मीडिया घटकों और उद्देश्य के बीच कार्यात्मक संबंध का अनुमान लगाता है । यह पूर्वानुमान अनिश्चितता के बारे में भी जानकारी देता है । उच्च अनिश्चितता शोर डेटा इंगित करता है और/

    1. डीईओ
      नोट: पिछले रन के परिणामों के आधार पर नए प्रयोग iteratively डिजाइन किए गए हैं ।
      1. पहली पुनरावृत्ति में, ब्याज की पहचान की मीडिया घटकों की विस्तृत जांच के लिए नए प्रयोग डिजाइन । खंड 2 से प्रयोगात्मक परिणाम चलने अनुकूलन (धारा 3), प्रासंगिक प्रभाव के बिना घटकों की सांद्रता अब संबंधित संदर्भ मूल्य के लिए तय कर रहे है के रूप में हस्तांतरित नहीं किया जा सकता है । नतीजतन, संवेदनशीलता विश्लेषण और चलने अनुकूलन से प्रयोगों तुलनीय नहीं हैं ।
      2. अंयथा, आरेख 1, फ़्रेम "चलने ऑप्टिमाइज़ेशन" में सचित्र योजना का पालन करें । यदि संभावित इष्टतम परिभाषित एकाग्रता रेंज के अंदर निहित है, नए प्रयोगों की उंमीद सुधार४०,४६का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं । प्रयोगात्मक डिजाइन अपेक्षित सुधार के आधार पर KriKit toolbox में एकीकृत है । यदि इष्टतम सीमा पर है, एकाग्रता रेंज का विस्तार ।
    2. खंड 2 में परिभाषित प्रयोगात्मक तरीकों के अनुसार डिजाइन किए गए नमूना बिंदुओं पर प्रयोग करते हैं ।
    3. सांख्यिकीय विश्लेषण
      1. वर्तमान सहित सभी पुनरावृत्तियों से संयोजित डेटा का उपयोग करके एक Kriging मॉडल बनाएं ।
      2. KriKit के व्यापक उपकरण (2/3d प्रक्षेप, मूवी विश्लेषण, स्क्रीनिंग प्लाट आदि) का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा मॉडल आउटपुट की जांच करें ।
    4. एक इष्टतम क्षेत्र पर्याप्त सटीकता के साथ अनुमान लगाया गया था, तो अनुकूलन बंद करो । यदि नहीं, तो चरण ३.१ के साथ जारी रखें ।
      नोट: आरेख 6 परीक्षण अध्ययन के लिए चलने ऑप्टिमाइज़ेशन दिखाता है । एकाग्रता सीमा क्रमिक विस्तार किया गया था जब तक एक पठार पाया गया था (पुनरावृत्ति 1-6) । सातवीं चलना अधिक विस्तार में सीमाओं की खोज के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

    4. परिणामों का सत्यापन (चित्र 1: भाग D)

    नोट: चलने अनुकूलन परिष्करण के बाद, प्रारंभिक मांयताओं वैधता के लिए जांच की जरूरत है ।

    1. इष्टतम माध्यम रचना के लिए संवेदनशीलता विश्लेषण (धारा 2) फिर से करें । अर्थात, घटकों की सांद्रता जो चित्रा 1 (भाग C) में जांची जाती है उनके इष्टतम मूल्यों के लिए तय की जाती है । अंय घटकों की सांद्रता एक उपयुक्त डो के अनुसार विविध रहे हैं ।
      नोट: दोनों में समान परिणाम की जांच घटकों की एकाग्रता का स्तर अन्य घटकों के प्रभाव को बदल नहीं कि इंगित करता है । यदि स्क्रीनिंग भाग ख से परिणामों के लिए महत्वपूर्ण अंतर दिखाता है, एक परिवर्तित प्रभाव के साथ घटकों की जांच घटकों के पूल में जोड़ा जाना चाहिए और भाग सी दोहराया जाना चाहिए ।
    2. अप्रत्यक्ष मापन के मामले में (उदा., उत्पाद एकाग्रता के लिए संकेतक के रूप में प्रतिदीप्ति), ओर्थोगोनल माप दृष्टिकोण लागू करें (उदा., गतिविधि परख, ब्रैडफोर्ड या बीसीए प्रोटीन ठहराव, एसडीएस पृष्ठ) में परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए संदर्भ माध्यम से परिणामों की तुलना करके ब्याज का उद्देश्य और अनुकूलित माध्यम15.

    Representative Results

    प्रस्तुत प्रोटोकॉल गुप्त GFP के titer को अधिकतम करने के लिए लागू किया गया था । विशेष रूप से, खेती के 17 ज के बाद GFP titer अनुकूलन उद्देश्य के रूप में चुना गया था । ऑनलाइन प्रतिदीप्ति डिटेक्शन ऑफ GFP ने सिंपल प्रोडक्ट ठहराव की अनुमति दी । हालांकि, एक संदर्भ खेती से डेटा के साथ GFP संकेत के सामांय reproducibility और परिणामों की तुलना सुनिश्चित करने के लिए अपरिहार्य है । मीडिया घटकों के एक पूर्व चयन एक तर्कसंगत आधार पर किया गया था के रूप में खंड 1 में वर्णित है । प्रयोग खंड 1 के निर्देशों का पालन किया गया: गीले प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के मापदंडों के पूरे अध्ययन के लिए परिभाषित किया गया निरंतरता और परिणामों की reproducibility ।

    के रूप में खंड 2 में वर्णित है, एक प्रारंभिक जांच प्रासंगिक और अधिक विस्तृत अध्ययन के लिए अनुकूलन उद्देश्य पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव दिखा घटकों की पहचान के लिए प्रदर्शन किया गया । एमटीपी आधारित MBR सिस्टम ४८ प्रयोगों समानांतर में किया जा करने के लिए अनुमति देता है । खाते में एक एमटीपी (४८) पर समानांतर प्रयोगों की अधिकतम संभव संख्या लेने और मीडिया घटकों की कुल संख्या (11) 2IV11-6 आंशिक डिजाइन एक उपयुक्त विकल्प बनाता है । इस प्रायोगिक डिजाइन में ३२ प्रयोग शामिल है और जांच मीडिया घटकों में से प्रत्येक के लिए मुख्य प्रभाव के आकलन की अनुमति देता है । शेष खेती कुओं (16) reproducibility और स्थिति प्रभाव का आकलन करने के लिए संदर्भ माध्यम के साथ प्रयोगों के कई दोहराने के लिए इस्तेमाल किया गया । अर्थात, प्रत्येक प्रयोग एक बार (प्रतिकृति नहीं), संदर्भ प्रयोग के अलावा (पांच दोहराने) आयोजित किया जाता है ।

    तालिका 1 स्क्रीनिंग विश्लेषण के परिणामों को सारांशित करता है । माना एकाग्रता सीमा में, मीडिया घटकों के बहुमत अलग उद्देश्य पर एक नजर प्रभाव नहीं दिखा था । घटक एनएच4+ एक मजबूत नकारात्मक प्रभाव से पता चलता है, जबकि सीए2 + और मिलीग्राम2 + मजबूत सकारात्मक प्रवृत्ति दिखाओ । मिलीग्राम का प्रभाव2 + वर्तमान एकाग्रता सीमा के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन एक व्यापक एकाग्रता रेंज के लिए हो सकता है. नतीजतन, यह राजमार्ग4+ के माध्यम से छोड़ और आगे के प्रयोगों में सीए2 + और एमजी2 + के प्रभाव की जांच करने का फैसला किया गया था ।

    खंड 3 चलने ऑप्टिमाइज़ेशन प्रक्रिया का वर्णन करता है जो GFP प्रतिदीप्ति सिग्नल को अधिकतम करने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि Ca2 + और मिलीग्राम2 +की सांद्रता बदलती है । पुनरावृत्ति 1 में, परिकल्पना है कि एनएच4+ लोप किया जा सकता है परीक्षण किया गया । सीए2 + और एमजी2 + के लिए एकाग्रता रेंज स्क्रीनिंग विश्लेषण से अपनाया गया था । एनएच4की न्यूनतम एकाग्रता+ शून्य करने के लिए निर्धारित किया गया था और अधिकतम एकाग्रता स्क्रीनिंग प्रयोग से अपनाया गया था. निम्नलिखित प्रयोगों में, घटक सांद्रता परिभाषित एकाग्रता रेंज के अंदर एक 3 एक्स 3 एक्स 3 ग्रिड पर वितरित किया गया, 27 प्रयोगों में जिसके परिणामस्वरूप. सभी खेती के दौरान, संदर्भ माध्यम की पांच प्रतिकृतियां शामिल की गई थीं, जो आंतरिक मानक के रूप में कार्य करती थीं और यह सुनिश्चित करने के लिए कि एमटीपी पर कोई स्थिति प्रभाव न आए । शेष 16 कुओं के लिए, एनएच4की सांद्रता+, Ca2 +, और एमजी2 + बेतरतीब ढंग से दिए गए पर्वतमाला के अंदर वितरित किया गया ।

    चित्र 5 एक पहली पुनरावृत्तियों के परिणाम visualizes । अक्ष लेबल्स मूल संदर्भ मध्यम में उपयोग किए गए घटक सांद्रता को संदर्भित करते हैं, जो x Ref द्वारा दर्शाया गया है । नीली सतहों KriKit सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गणना की गई है कि Kriging इंटरपोल का प्रतिनिधित्व करते हैं । प्रत्येक सतह के लिए एक रिश्तेदार एकाग्रता स्तर के साथ जुड़ा हुआ है NH4+ (डार्क ब्लू: 0 x रेफरी, चेकर: 1 एक्स रेफरी, लाइट ब्लू: 2 एक्स रेफरी) । इस दृश्य निरूपण से पता चलता है कि यह एनएच4+छोड़ करने के लिए अनुकूल है । इंटरपोल सतहों भी दोनों मिलीग्राम2 + और सीए2 +के सकारात्मक प्रभाव दिखाने के लिए, के रूप में सभी विमानों बढ़ती सांद्रता के साथ वृद्धि ।

    पुनरावृत्ति 1 के परिणामों के आधार पर, यह Ca2 + की एकाग्रता सीमा का विस्तार करने का निर्णय लिया गया था और अधिकतम सांद्रता दोहरीकरण और ऊपरी दाएँ कोने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन विंडो स्थानांतरण द्वारा2 + मिलीग्राम, चित्रा 5 देखें Bइस श्रेणी के अंदर, सांद्रता 6 x 6 ग्रिड पर वितरित की गई थी । यह पूर्ण एकाग्रता रेंज पर एक भी वितरण सुनिश्चित करता है, इष्टतम Kriging प्रक्षेप परिणाम के लिए अग्रणी । चित्र 5 B दोनों पुनरावृत्तियों (लाल डॉट्स और पीले चौकोर) में मापा गया संयुक्त डेटा के आधार पर Kriging प्रक्षेपन प्लॉट दिखाता है । दोनों के लिए, Ca2 + और2 मिलीग्राम +, उनकी सांद्रता बढ़ाने के सकारात्मक प्रभाव जारी है । नतीजतन, प्रक्रिया अधिकतम एकाग्रता दोहरीकरण द्वारा दोहराया गया था और इस प्रकार, प्रयोगात्मक डिजाइन खिड़की ऊपरी दाहिने कोने की सीमाओं का पता लगाने के लिए ले जाया गया था ।

    चित्र 6 A शेष ऑप्टिमाइज़ेशन प्रक्रिया का ओवरव्यू देता है । एकत्र डेटा के विश्लेषण की स्थापना के लिए चलना 3 मिलीग्राम के सकारात्मक प्रभाव की एक सीमा का पता चला2 +, यानी, मिलीग्राम2 + की एक इष्टतम एकाग्रता रेंज की पहचान की थी । इसलिए यह केवल Ca के लिए एकाग्रता सीमा का विस्तार करने का फैसला किया गया था2 + (पुनरावृत्ति 4) । यह कार्यविधि दो बार (पुनरावृत्ति 5 और 6) GFP संकेत का एक संतृप्ति पाया गया था जब तक दोहराया गया था । यह संतृप्ति सीए की वर्षण से समझाया गया है-लवण की लागू सांद्रता के लिए ca2 +, जो कोशिकाओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं ।

    के रूप में प्रयोगात्मक परिणाम हमेशा शोर से परेशान हैं, जिसके परिणामस्वरूप Kriging इंटरपोल अनियमित प्रतीत होता है और दृश्य निरीक्षण झूठी निष्कर्ष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हालांकि, संतृप्त GFP संकेत के लिए मीडिया घटकों के इष्टतम एकाग्रता रेंज मज़बूती से सांख्यिकीय z-परीक्षण, जो भी KriKit में कार्यांवित किया जाता है के साथ पहचाना जा सकता है । z-परीक्षण सीधे आंतरिक सांख्यिकीय Kriging विधि, यानी, भविष्यवाणी मूल्यों और भविष्यवाणी अनिश्चितताओं द्वारा प्रदान की गई जानकारी का उपयोग करता है । चित्र 6 बी की पहचान की पठार से पता चलता है, के रूप में निर्धारित और KriKit उपकरण बॉक्स का उपयोग कर visualized ।KriKit toolbox३६ आज़ादी से उपलब्ध है और एक विस्तृत ट्यूटोरियल है कि कैसे अपनी सुविधाओं का उपयोग करने के लिए बताते हैं के साथ आता है ।

    यदि दो से अधिक प्रासंगिक घटक पाए जाते हैं, तो 3d विज़ुअलाइज़ेशन इसकी सीमा तक पहुंच जाता है. KriKit ऐसी फिल्मों या "स्क्रीनिंग साजिश" के रूप में कई अंय संभव दृश्य प्रतिनिधित्व तरीकों प्रदान करता है । यदि संभावित इष्टतम परिभाषित एकाग्रता सीमा के अंदर निहित है, नए प्रयोगों स्वचालित रूप से अपेक्षित सुधार का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं४०,४६. प्रयोगात्मक डिजाइन अपेक्षित सुधार के आधार पर KriKit toolbox में एकीकृत है । अधिक विस्तृत जानकारी सॉफ्टवेयर प्रलेखन में पाया जा सकता है ।

    चलने प्रक्रिया के बाद, परिणामों का सत्यापन किया गया, जैसा कि भाग D में वर्णित है । प्रारंभिक मांयताओं की वैधता इष्टतम माध्यम संरचना का उपयोग कर एक अतिरिक्त संवेदनशीलता विश्लेषण प्रदर्शन करके जांच की थी । यही है, ब्याज की सभी प्रारंभिक मीडिया घटकों विविध थे, लेकिन सीए2 + और एमजी2 + उनके इष्टतम एकाग्रता के स्तर पर सेट किया गया । इस अध्ययन में, इष्टतम सांद्रता = ३२ x ref और = ६.८ x ref चुना गया था । Equation 8 Equation 9 तालिका 2 सत्यापन स्क्रीनिंग के परिणाम दिखाता है । प्रारंभिक संवेदनशीलता स्क्रीनिंग (cf. Table 1) के समान, NH4+ अभी भी एक महत्वपूर्ण नकारात्मक प्रभाव है और शेष प्रभाव अभी भी नगण्य हैं.

    आसान पहुंच के कारण, खेती निलंबन से GFP प्रतिदीप्ति संकेत सभी प्रयोगों के दौरान extracellular GFP titer यों की मात्रा का इस्तेमाल किया गया था । सत्यापन कारणों के लिए, GFP प्रतिदीप्ति अन्य माप के खिलाफ मान्य किया गया था. क्योंकि GFP जैसे-मार्ग के माध्यम से स्रावित होता है, प्रतिदीप्ति संकेत अंतर और extracellular GFP के बीच भेदभाव नहीं कर सकते । इस प्रकार, खेती संदर्भ मध्यम और अनुकूलित माध्यम का उपयोग कर reproduced थे । सेल मुक्त खेती supernatants से प्रतिदीप्ति माप के अलावा, प्रोटीन सामग्री ब्रैडफोर्ड परख और (अर्द्ध) द्वारा मात्रा-गुणात्मक GFP सुधार visualized द्वारा एसडीएस-Page15था । सभी परिणामी माप संकेतों को लगभग संदर्भ माध्यम की तुलना में अनुकूलित माध्यम के साथ खेती के लिए दोगुनी कर रहे थे और अनुकूलित माध्यम के स्राव प्रदर्शन के लगभग १००% सुधार की पुष्टि की । नतीजतन, खेती के GFP विशिष्ट प्रतिदीप्ति निलंबन अनुकूलन उद्देश्य के लिए एक उपयुक्त मीट्रिक माना जा सकता है, यानी, extracellular GFP titer.

    Figure 2
    चित्र 2 : संवेदनशीलता विश्लेषण के लिए वॉल्यूम pipetting सूची से स्क्रीनशॉट । प्रथम स्तंभ में प्रविष्टियां एक पंक्ति के सभी संस्करणों के लिए एक अनंय पहचानकर्ता असाइन करें; यह पहचानकर्ता तरल हैंडलर worktable, cf. चित्रा 4Cपर लक्ष्य खेती एमटीपी की एमटीपी well संख्या है । शेष कॉलम अलग समाधान ("Sln-01" करने के लिए "Sln-15") के लिए pipetted किया जा करने के लिए खंड सांकेतिक शब्दों में बदलना । एक पंक्ति की संचई मात्रा संगत अच्छी तरह से अंतिम खेती की मात्रा से मेल खाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3 : तरल हैंडलिंग नियंत्रण सॉफ्टवेयर से स्क्रीनशॉट "WinPREP". बाएँ: pipetted होने के लिए प्रत्येक स्टॉक समाधान के लिए एक स्थानांतरण आदेश सहित पंक्ति-क्रमित आदेश,. इनोक्युलम अतिरिक्त के लिए अंतिम आदेश से पहले, एक उपयोगकर्ता शीघ्र बीज संस्कृति समय में मेज पर रखा गया है यह सुनिश्चित करने के लिए डाला जाता है । सही: भिंनता स्टॉक्स के लिए स्रोत labware सहित worktable की योजनाबद्ध, (12 कॉलम की तरह कुओं के साथ दो गहरे अच्छी तरह से प्लेटें), बाकी शेयर, पानी और इनोक्युलम के लिए रिएजेंट गर्त, और मीडिया की तैयारी लक्ष्य खेती एमटीपी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्र 4 : एक शेयर समाधान के pipetting के सेटअप के लिए विस्तृत स्क्रीनशॉट का संकलन । (क) Fe के शेयर के pipetting के लिए unwrapped आदेश । स्रोत labware और अच्छी तरह से स्रोत के भीतर पढ़ फ्रेम और इसी गहरी अच्छी तरह से थाली के लाल कॉलम द्वारा worktable पर चिह्नित कर रहे हैं । गंतव्य labware और गंतव्य कुओं के भीतर नीले फ्रेम के चारों ओर और लक्ष्य खेती एमटीपी के नीले कुओं के द्वारा चिह्नित कर रहे हैं । (B) इस चरण (Fe स्टॉक समाधान) के लिए pipetting वॉल्यूंस के असाइनमेंट पर विस्तृत उदाहरण देखें । गंतव्यों की संख्या pipetting सूची है, जो ४८ पंक्तियाँ है से पढ़ा है । सभी गंतव्य कुओं के लिए वितरण खंड Fe स्टॉक समाधान के लिए pipetting सूची में स्तंभ 4 में पाया जाता है । ध्यान दें कि pipetting सूची में पहले स्तंभ में पहचानकर्ता हैं और स्थानांतरित किए जाने वाले वॉल्यूम नहीं हैं, चित्र 2देखें । (ग) गंतव्य अच्छी तरह से क्रमांकन पर विवरण । इसी pipetting सूची की पंक्ति #1 में लिखे गए खंड में pipetted के रूप में अच्छी तरह से चिह्नित #1, और इतने पर होगा । वेल्स #01, #08, #41 और #48 अल्फा के लिए कुओं A01, A08, F01 और F08 के अनुरूप-संख्यात्मक कोडिंग, जो भी खेती में छपा है एमटीपी ही है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्र 5 : पहली पुनरावृत्ति से विस्तृत परिणाम. (क) पुनरावृत्ति 1 के प्रायोगिक आंकड़ों के आधार पर Kriging इंटरपोल. लाल डॉट्स डेटा सेट का संकेत देते हैं । तुलना के लिए, सभी तीन प्रक्षेप सतहों एक भूखंड (डार्क ब्लू: 0 एक्स रेफरी, चेकर: 1 एक्स रेफरी, लाइट ब्लू: 2 एक्स रेफरी) में ओवरले रहे हैं । परिणामों का एक वैकल्पिक प्रतिनिधित्व15कहीं और पाया जा सकता है । (B) पुनरावृत्ति 1 (लाल डॉट्स) और पुनरावृत्ति 2 (पीला वर्ग) में प्रदर्शन किए गए प्रयोगों के आधार पर Kriging इंटरपोल ।इस आंकड़े में प्रस्तुत आंकड़ों के कुछ हिस्सों को पहले15प्रकाशित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 6
    चित्र 6 : iteratively एकत्र अनुकूलन परिणामों का चित्रण । (A) अंतिम Kriging मॉडल पूर्वानुमान । (ख) इष्टतम क्षेत्र की सांख्यिकीय पहचान (लाल) सांख्यिकीय z-परीक्षण पर आधारित है, जो KriKit द्वारा प्रदान की जाती है. बक्से चलने डिजाइन और प्रयोगों के निष्पादन के क्रमिक कदम से संकेत मिलता है । इस आंकड़े में प्रस्तुत आंकड़ों के कुछ हिस्सों को पहले15प्रकाशित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    घटक सामान्यीकृत गुणांक माध्य मान
    Fe2 + -०.०८
    Mn2 + -०.०५
    Zn2 + -०.२१
    घन2 + -०.२१
    एनएच4+ -२.०४
    नी2 + -०.११
    सह2 + -०.१०
    मू42- ०.०३
    बो33- ०.०६
    Ca2 + १.००
    मिलीग्राम2 + ०.४५

    तालिका 1: संवेदनशीलता विश्लेषण के परिणाम. अपने केंद्र मान से अपने अधिकतम मान के लिए संबंधित मीडिया घटक एकाग्रता में वृद्धि करते समय औसत प्रभाव का प्रतिनिधित्व करने वाले गुणांक मान । इष्टतम प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए, के रूप में मानक साहित्य में पाया और यहां इस्तेमाल किया, मानक विचलन संदर्भ प्रयोग की पुनरावृत्ति के कारण सीधे प्रयोगात्मक भिंनता का प्रतिनिधित्व करता है । गुणांक मान maxium मान (घटक Ca2 +के लिए ०.०४२२) द्वारा सामान्यीकृत किए गए थे । सामान्यीकृत और पूर्ण गुणांक मानक विचलन क्रमशः ०.५४ और ०.०२२६ है ।

    घटक सामान्यीकृत गुणांक माध्य मान
    Fe2 + -१.००
    Mn2 + १.००
    Zn2 + -३.४८
    घन2 + -०.५२
    एनएच4+ -१५.९५
    नी2 + ०.६९
    सह2 + -०.५१
    मू42- -०.४५
    बो33- -१.११

    तालिका 2: अंतिम संवेदनशीलता विश्लेषण के परिणाम. अपने केंद्र मान से अपने अधिकतम मान के लिए संबंधित मीडिया घटक एकाग्रता में वृद्धि करते समय औसत प्रभाव का प्रतिनिधित्व करने वाले गुणांक मान । एक इष्टतम प्रयोगात्मक डिजाइन के रूप में इस्तेमाल किया गया था, मानक विचलन केवल प्रयोगात्मक अनुकूलित माध्यम संरचना का उपयोग कर भिन्नता पर निर्भर करता है. प्रयोगात्मक भिन्नता संदर्भ माध्यम का उपयोग कर भिन्नता की तुलना में थोड़ा बढ़ गया. गुणांक मान maxium मान (घटक Mn2 +के लिए ०.०१०६) द्वारा सामान्यीकृत किए गए थे । सामान्यीकृत और पूर्ण गुणांक मानक विचलन क्रमशः ३.६३ और ०.०३८५ है ।

    Discussion

    प्रस्तुत प्रोटोकॉल की जेनेरिक प्रकृति विभिंन रूपांतरों की अनुमति देता है, जैसे, अंय माइक्रोबियल अभिव्यक्ति मेजबान9,४७,४८,४९,५०, का अध्ययन करने के लिए ५१, या लक्ष्य प्रोटीन, ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न या disulphide बांड की तरह के अंय गुणों का अनुकूलन करने के लिए । प्रोटोकॉल भी उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरण के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है । एक MBR प्रणाली के एकीकरण प्रयोगात्मक प्रवाह को बढ़ाने की अनुमति देता है, जो समय में महान बचत में सक्षम बनाता है. हालांकि, MBR सिस्टम द्वारा पूरी तरह से लिखती और नियंत्रणीय प्रतिलेखनों की जगह जब, परिणाम की दरिद्रता8,३७,५२,५३माना जाना चाहिए । डो के तरीके और गणितीय मॉडलिंग का उपयोग कुशल प्रयोगात्मक योजना और मॉडल आधारित डेटा व्याख्या15द्वारा अध्ययन उद्देश्य५४ के संबंध में माप डेटा की सूचना सामग्री को अधिकतम करने में मदद करता है.

    विधि में संशोधन
    बहु उद्देश्य और विस्तार योग्य रोबोट इस अध्ययन में इस्तेमाल एक तरह से निपटने प्रणालियों के बगल में, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि वहां कई छोटे तरल हैंडलिंग सिस्टम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है जो इस कार्य को करने में सक्षम है और अंदर रखा जा सकता है च्या लामिना प्रवाह काम सत्तापक्ष करत आहे. यदि कोई स्वचालित pipetting प्रणाली उपलब्ध है, विभिंन मीडिया रचनाएं डो योजना के अनुसार भी मैनुअल pipetting द्वारा महसूस किया जा सकता है एकल और/ चूंकि मैनुअल तैयारी अधिक त्रुटि प्रवण है और काफी लंबे समय के लिए अत्यधिक ध्यान केंद्रित काम की आवश्यकता होगी, यह अलग मीडिया रचनाओं की एक कम संख्या तैयार करने की सिफारिश की है ।

    कार्यरत MBR प्रणाली की क्षमताओं पर निर्भर करते हुए, इसी खेती प्रोटोकॉल अलग होगा । उदाहरण के लिए, यदि बायोमास गठन की कोई ऑनलाइन माप उपलब्ध है, यह वृद्धि प्रयोग के पूरा होने के बाद बायोमास एकाग्रता को मापने के लिए पर्याप्त हो सकता है । पीएच और भंग ऑक्सीजन, जो कई MBR प्रणालियों में लागू किया जाता है की ऑनलाइन निगरानी के साथ संयोजन में, विकास संतृप्ति सुरक्षित रूप से निर्धारित कर सकते हैं । सिद्धांत रूप में, विकास प्रयोगों MTPs अकेले में आयोजित किया जा सकता है मिलाते हुए मशीन के अंदर रखा, एक MBR प्रणाली के उपयोग के बिना । इस मामले में, उचित खेती की स्थितियों को सुनिश्चित किया जाना है: (1) ऑक्सीजन-सीमित खेती उचित geometries के साथ संयोजन में उपयुक्त मिलाते हुए आवृत्तियों के साथ MTPs का उपयोग करके बचा जा सकता है और व्यास मिलाते हुए, उदा, स्क्वायर ९६ या 24 गहरी खैर 3 मिमी पर १,००० rpm पर संचालित प्लेटें फेंक या २५० rpm पर 25 mm फेंक, क्रमशः । महत्वपूर्ण बात, कम प्राप्त अधिक से अधिक ऑक्सीजन हस्तांतरण दर, कम मुख्य कार्बन स्रोत केंद्रित किया जाना चाहिए । जैसा कि ऊपर बताया गया है, इस अध्ययन के लिए, 10 ग्राम/एल ग्लूकोज का उपयोग नियोजित खेती की स्थिति के लिए ऑक्सीजन सीमा को रोकने के लिए उपयुक्त था; (२) बायोमास और उत्पाद ठहराव के लिए एमटीपी संस्कृतियों की सैंपलिंग कम से न्यूनतम की जानी चाहिए. हर बार एमटीपी मिलाना मशीन से हटा दिया जाता है, ऑक्सीजन हस्तांतरण तुरंत टूट जाएगा जो प्रतिकूल खेती की स्थिति में परिणाम हो सकता है; (३) लेखकों की राय में, खेती के उपकरणों के रूप में एमटीपी पाठकों का उपयोग अनुशंसित नहीं है क्योंकि इन उपकरणों को इस प्रयोजन के लिए विकसित नहीं किया गया था. उदाहरण के लिए, मिलाते यांत्रिकी microplates के कभी कभार मिश्रण के लिए बनाया गया है और इस तरह के बाद, अक्सर लगातार मिलाने के लंबे समय के लिए मजबूती कमी दिनों के लिए स्थाई मिलाते हुए । इसके अलावा, माइक्रोबियल खेती के लिए आवश्यक पर्याप्त शक्ति इनपुट इन पाठकों में महसूस नहीं किया जा सकता है । कम समय अंतराल में ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग के एकीकरण मिलाते हुए गति की रोक की आवश्यकता है, ऑक्सीजन सीमा की दोहराया अवधि में जिसके परिणामस्वरूप. इसके अलावा, लंबी खेती के समय इस तरह की प्रणालियों में वाष्पीकरण परिणाम विकृत हो जाएगा । माइक्रोबियल खेती के लिए MTPs के प्रयोग पर आश्चर्यजनक जटिल विषय पर अधिक जानकारी के लिए, पाठक उद्धृत साहित्य के लिए भेजा है22,23,24,25,26 और उसमें सन्दर्भ.

    आगे विचार
    गति-अप चलने ऑप्टिमाइज़ेशन चरणों के लिए, यह ध्यान से उत्पाद ठहराव के लिए विश्लेषणात्मक विधि का चयन करने के लिए सलाह दी जाती है । चलने प्रयोगात्मक डिजाइन रणनीति प्रयोगात्मक अशुद्धि बर्दाश्त के रूप में तेजी से और सरल तरीके परिशुद्धता और सटीकता की लागत पर पसंद किया जाना चाहिए । हालांकि, अंतिम परिणाम पर्याप्त सटीक और सटीक उत्पाद ठहराव तरीकों कि अधिक जटिल हो सकता है के खिलाफ सत्यापित किया जाना चाहिए । सामांय में, सावधान मूल्यांकन और अध्ययन प्रक्रियाओं के बारे में निर्णय लेने के अध्ययन की शुरुआत में प्रयास की आवश्यकता है, लेकिन लंबे समय में भुगतान करते हैं, के बाद नियमित तरीकों की स्थापना की गई है ।

    यह उच्च अनुकूलन के दौरान सभी प्रयोगों की तुलना में है कि एक संदर्भ प्रयोग को परिभाषित करने के लिए सिफारिश की है. यही कारण है कि, लागू मध्यम घटक सांद्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मापा उत्पादन संदर्भ मूल्यों से विभाजन के माध्यम से सामान्यीकृत हैं । इस तरह, प्रत्येक लागू किए गए और मापा मान संदर्भ मान के x-फ़ोल्ड के रूप में समझा जा सकता है । प्लेटों के बीच भिन्नता को ध्यान में रखने के लिए, प्रत्येक प्लेट पर पांच संदर्भ प्रयोग किए जाते हैं । मापा परिणाम का माध्य मान सामान्यीकरण के लिए उपयोग किया जाता है ।

    यह आम तौर पर गारंटी नहीं किया जा सकता है कि विकसित माध्यम भी अंय उपभेदों के लिए इष्टतम है । हालांकि, सुधार माध्यम सबसे अधिक संभावना भी छोटे आनुवंशिक मतभेदों के साथ अभिव्यक्ति उपभेदों खेती के लिए उपयुक्त होगा, जैसे, जब एकल एमिनो एसिड mutagenesis अध्ययन से प्राप्त प्रतिस्थापन के साथ एंजाइम वेरिएंट का निर्माण ( हालांकि एक भी बिंदु उत्परिवर्तनों सेलुलर चयापचय और heterologous अभिव्यक्ति प्रदर्शन५५,५६) प्रभाव के लिए वर्णित किया गया है । इस स्थिति में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक पहला चरण, उच्च-प्रवाह अभिव्यक्ति screenings५७के लिए प्रोटोकॉल द्वारा पीछा किया जा सकता है । यदि प्रोटोकॉल अनुवर्ती स्केल-फेड के लिए बैच खेती के साथ मध्यम विकास के लिए प्रयोग किया जाता है, अनुकूलित मध्यम इसी प्रक्रिया की स्थिति के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए, अतिसूक्ष्म पर क्लोन स्क्रीनिंग अभियानों के रूप में विभिंन शीर्ष पहचान विभिंन खिला रणनीतियों और खेती मीडिया५२,५८के लिए कलाकारों । इसके अलावा, शुरू KriKit३६ आम तौर पर बेहतर समग्र प्रक्रिया अनुकूलन में योगदान कर सकते हैं ।हाल ही में, उपकरण क्षमताओं को भी बहु का समर्थन उद्देश्य अनुकूलन४०, जो दोनों नदी के नीचे और बहाव प्रक्रियाओं को अनुकूलित५९,६०के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है विस्तारित किया गया ।

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    NRW-Strategieprojekt BioSC (No. 313/323-400-002 13) के ढांचे के भीतर अनुसंधान के वैज्ञानिक गतिविधियों को आर्थिक रूप से नवाचार, विज्ञान मंत्रालय द्वारा वित्तीय रूप से समर्थन किया गया है, और शोध । लेखक नवाचार, विज्ञान मंत्रालय का धंयवाद, और उत्तर राइन के अनुसंधान-Westphalia और हेनरिक Heine विश्वविद्यालय डसेलडोर्फ लार्स के भीतर Freier CLIB के लिए एक छात्रवृत्ति के लिए-स्नातक क्लस्टर औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी । इसके अलावा धन को सक्षम करने से प्राप्त किया गया था रिक्त स्थान कार्यक्रम "Helmholtz अभिनव लैब्स" जर्मन Helmholtz एसोसिएशन के "माइक्रोबियल जैविक प्रक्रिया लैब-एक Helmholtz नवाचार लैब" का समर्थन करने के लिए ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioLector m2p-labs G-BL-100
    Flowerplate m2p-labs MTP-48-BOH For cultivation in the BioLector device
    Sealing foil m2p-labs F-GP-10 Sterile sealing for Flowerplate
    MATLAB Mathworks 2016b
    KriKit Forschungszentrum Jülich n/a Freely available, MATLAB installation required
    Janus pipetting robot Perkin Elmer n/a Includes "WinPrep" software installation
    12-column deep well microplate E&K Scientific EK-2034 Container for medium stock solutions
    96 well microplates, transparent, F-bottom Greiner 655101 For Bradford protein assay
    µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom Greiner 655087 For flourescence measurement in cell-free supernatants
    Pipette Research plus multi-channel pipettes Eppendorf n/a Facilitates manual liquid handling with microplates
    TruPAG Precast Gels Sigma PCG2002 For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
    Bradford Reagent Sigma B6916
    C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP n/a n/a Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

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    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

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