Summary
Эта рукопись описывается общий подход для индивидуальный дизайн микробной культивирования СМИ. Это обеспечивается итеративный процесс, сочетая кригинг-экспериментальный дизайн и microbioreactor технологии для достаточно культивирования пропускной способности, которая поддерживается в лаборатории робототехники для повышения надежности и скорости в жидкости, обработка СМИ подготовка.
Abstract
Основной бизнес в промышленной биотехнологии с помощью микробных клеток заводов является итеративный процесс деформации инженерии и оптимизацию биопроцессов условий. Одним из важных аспектов является улучшение среды культивирования обеспечить оптимальные условия для микробной формирования продукта интерес. Также признается, что состав СМИ резко может повлиять на общую производительность Биопроцесс. Средний оптимизации питания, как известно, улучшения Рекомбинантный белок производства микробных систем и, таким образом, это является полезным шагом в развитии Биопроцесс. Однако очень часто стандартные СМИ рецепты взяты из литературы, так как индивидуальный дизайн среды выращивания является утомительной задачей, которая требует microbioreactor технологии для достаточно выращивания пропускную способность, быстрый продукт Google analytics, а также поддержка в лаборатории робототехники для включения надежность в жидкости обработка шаги. Кроме того расширенные математические методы необходимы для рационально анализа данных измерений и эффективно проектирования параллельных эксперименты, такие как добиться оптимального информационного содержания.
Общий характер представленных протокола позволяет легко адаптации различных лабораторное оборудование, других хранилищ выражений и белков-мишеней интерес, а также дальнейшего Биопроцесс параметров. Кроме того другие цели оптимизации как темп производства белка, конкретных урожайности или качество продукта может быть выбран для охвата других оптимизации исследований. Прикладной кригинга Toolbox (KriKit) является общий инструмент для дизайна из экспериментов (МЭ), способствует более целостный Биопроцесс оптимизации. Он также поддерживает многоцелевых оптимизации, которые могут иметь важное значение для оптимизации процессов вверх и вниз по течению.
Introduction
Рекомбинатные современной генной технологии позволяет широкое использование технических ферментов для различных применений в фармацевтической промышленности, животное питание, Органическая химия и пищевой1,2,3. Производство технических ферментов в больших количествах является главной темой для промышленной биотехнологии и оптимизированный Рекомбинантный белок производства и оба штамма и Биопроцесс инженерных необходима. Для поколения эффективно инженерии производства штаммов, имеются различные генетические библиотеки, например, для сбалансированного ген выражение4 или увеличение секреции эффективность5.
Corynebacterium glutamicum является крупным производителем аминокислот в промышленном масштабе6,7 и представляет хосту привлекательным нетрадиционных выражение для производства секреторную рекомбинантных белков8 ,9. Общие секреторной (Sec) и Твин аргинин транслокация (ТАТ) путь присутствуют в C. glutamicum и успешно применялись для рекомбинантных белков секрецию10. Обширный опыт в машиностроении Биопроцесс относительно аминокислота производства в промышленном масштабе, а также способность выделяют белки г/Л суммы11 и большой прочностью, относительно Биопроцесс неоднородностей в больших масштабах культивирования12,13, сделать C. glutamicum перспективной платформы организма для производства секреторную гетерологичных белков в промышленных масштабах.
Средний оптимизации питания, как известно, улучшить производство рекомбинантных белков с микробных систем14,,1516,17 и, следовательно, корректировка среднего Композиция представляет собой полезный шаг в Биопроцесс развития относительно оптимальной производительности18,19,,2021. Интенсивные исследования по применению микротитровальных пластин (ССП) для культивирования микроорганизмов22,,2324 проложили путь для разработки и проектирования ССП для культивирования микроорганизмов25 ,26 и развитие систем microbioreactor на основе ССП (MBR) с онлайн мониторинга и экологического контроля27,28. MBRs позволяют значительное увеличение пропускной способности экспериментального выращивания. Кроме того системы MBR, вытекающих из других видов биореакторов, например, Пузырьковые колонны или перемешивают танк реакторов, доступны для микробной Биопроцесс оптимизации29,,3031, 32.
В целом оптимизации исследований выгоду от расширения экспериментальной пропускной способности, которая становится еще более мощным в сочетании с Доу методологий, таких, как оценки взаимодействия между переменными дизайн или сокращению высокой мерный поиск пространства. Следовательно совместное использование систем MBR, лаборатории автоматизации и НОО оказался мощным методом в биотехнологии8,16,33,34,35.
Протокол для оптимизации средств массовой информации представлены сочетания современных лаборатории автоматизации, технологии MBR с онлайн процесса мониторинга и данных на основе кригинга анализ/экспериментальный дизайн. Кригинга методологии реализуется в MATLAB элементов («KriKit»), который может быть загружен и использоваться бесплатно бесплатно36. В качестве примера приложения максимизация производства секреторную зеленый fluorescent белка (ГПУП) с C. glutamicum показано путем оптимизации состава минимальный средний CgXII. GFP титр был выбран в качестве цели оптимизации, как она может быть легко количественно и широко применяется в качестве модели белка для исследования на MBR систем37,,3839.
Представлены рамки делится на четыре шага, которые приведены на рисунке 1. Шаги обозначаются поле кадры и соответствуют разделам протокола. Первый шаг (рис. 1A) является определение целей проекта и определить необходимые методы. Сочетание Доу методики, технологии MBR и лаборатории автоматизации позволяет повысить экспериментальной пропускную способность, которая требует мощной обработки данных. Второй шаг (рис. 1B) стремится обнаружить чувствительных дизайн переменные (например, компонентов среды) с высоким влиянием на цели оптимизации. Это приводит к уменьшение количества дизайн переменные, представляющие интерес. Третий этап (рис. 1 c) включает в себя итеративной оптимизации для более детального исследования функциональных связей между остальные переменные дизайн и цели интерес. С помощью последовательно расширенного набора данных, кригинга подход применяется для предсказания экспериментальный результат на неизмеримое местах. Итерационный цикл останавливается, как только модель кригинга предсказывает оптимальный или плато с достаточной точностью. Результаты проверяются на четвертом шаге (рис. 1 d), начиная с дальнейшего анализа чувствительности вокруг определены оптимальные. Если первоначально, нечувствительным компоненты оказались нечувствительны также в регионе оптимального, это разумно предположить, что это справедливо во время процедуры итеративной оптимизации на третьем шаге. После этого рекомендуется проверить результаты оптимизации, применение ортогональных методов, как assay деятельности или SDS-Page.
Общий характер представленных протокола позволяет легко адаптации различных лабораторное оборудование, других хранилищ выражений и белков-мишеней выбор, а также дальнейшие Биопроцесс переменные как pH значение или выращивания температуры.Кроме того другие цели оптимизации как темп производства белка, конкретных урожайности или качество продукта может быть выбран для охвата других оптимизации исследований.
Рисунок 1 : Рабочий процесс оптимизации исследования. Четыре рамка коробки соответствуют разделам протокола, «Зачатие и определения из методы изучения» (раздел 1), «Анализ чувствительности» (раздел 2), «Итеративной оптимизации» (раздел 3) и «Проверки» (раздел 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Protocol
1. зачатие, изучение и определение методов (Рисунок 1: часть А)
Примечание: Определение цели оптимизации: является время курс продукта формирования необходимых или соответствующих только ограниченный временной интервал или даже фиксированный момент? Кроме того рассмотреть потенциальные проблемы, такие, как стабильность, усилий аналитического количественного определения, или время выращивания. Как альтернатива окончательный белка титр другие цели может рассматриваться как время биомассы или выращивания. Биомасса отражается урожайность биомассы конкретного продукта, в то время как время культивирования отражается в пространстве-времени-выход. Качество продукции (минимум) также может быть целью. Многоцелевой оптимизации может потребоваться в некоторых ситуациях, как говорится в других40. В этом исследовании GFP титр после 17 ч культивирования был выбран в качестве цели оптимизации. GFP флюоресценции может следовать онлайн с использованием оборудования, доступных в этом исследовании, которое значительно упрощает определение концентрации белка модели.
Примечание: Определение параметров оптимизации: CgXII среда состоит из 16 отдельных компонентов41 и расследовать все эти полного факторного дизайна приведет к 216 ≈ 65 000 экспериментов. Следовательно пространство поиска необходимо сократить на основе рационального и опыт driven. Выбор компонентов средства массовой информации, которые считаются для оптимизации могут поддерживаться имеющихся экспертных знаний или литературные данные.
- Решите, какой средний компонент концентрации не должны быть изменены. Для оптимизации CgXII среды быть исправлены были выбраны следующие компоненты:
- Глюкоза является фиксированной на 10 г/л Эта оптимизация является тривиальным, потому что больше глюкозы дает больше GFP, секретирующих биомассы. Цель заключалась в том, чтобы выявить интуитивно-средние эффекты.
- 3-(N-Морфолино) propanesulfonic кислота (МОПЫ) фиксируется на 42 г/л. Это обеспечивает достаточной буферной емкости во время пакетного культивирования и не метаболизируется.
Примечание: Добавление MOPS на этой конечной концентрации обеспечивает начальное значение рН 7, даже с различными объемами запасов других решений, добавил, которые находятся не на рН 7. Однако чтобы исключить любое отклонение в начальных значений рН, pH должны быть проверены для средних композиции, где все биржевые решения добавляются в их максимальные и минимальные объемы. - KH2PO4 и K2HPO4 фиксируются в 1 г/Л. Они обеспечивают также буферной емкости и служат источником фосфатов.
- Мочевина фиксируется на 5 мкг/л. Это служит источник базальной азота и стабилизации рН агента, достаточно, чтобы предотвратить N-ограничение.
- Биотин является фиксированной на 0,2 мг/л ATCC13032 C. glutamicum ауксотрофных для биотин.
- Протокатеховая кислоты (PCA) фиксируется на уровне 30 мг/л Он служит железа хелатообразующий агент.
- Изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) фиксируется на 100 мкм. Он индуцирует экспрессию гена gfp .
- Выберите высоких и низких концентраций компонентов средств массовой информации для первоначального чувствительность показы. Здесь были выбраны компоненты из трех типичных групп СМИ компонентов. Исследованы низкой и высокой концентрации для каждого компонента являются:
- Стандартный азота источник: (NH4)2т4 (8-32 г/Л); Вариация источник азота было сообщено быть перспективным для оптимизации биомассы конкретных GFP сигнал8.
- Микроэлементы: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 мг/Л), MnSO4 ∙ H2O (4-16 мг/Л), ZnSO4 ∙ 7 H2O (0.4-1.6 мг/Л), CuSO4 ∙ 5 H2O (125-501 мкг/Л), NiCl2 ∙ 6 H2O ( 8-32 мкг/Л) и CoCl2 ∙ 6 H2O (52-208 мкг/Л). Состав микроэлементов наследуется от первой публикации CgXII средних41. Кроме того, Na2MoO4 ∙ H2O (26-104 мкг/Л) и H3Бо3 (20-80 мкг/Л) были включены в качестве микроэлементов, как они используются в опубликованном варианте CgXII средних42.
- Макроэлементы: MgSO4 ∙ 7 H2O (0,2-0,4 г/Л), CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3-21,2 мг/Л). Они были обнаружены среди других двухвалентной катионов активизировать секреторной GFP производства в другом исследовании14, где штамм C. glutamicum R был использован с другой фон средних и пептида сигнал CgR0949 тат.
- Подготовка материалов и определение процедур
Примечание: Рекомендуется определить и исправить экспериментальные методы на подробном уровне. Эта стандартизация гарантирует, что разные результаты может быть восходит к внутренней биологической вариативности или различных средних композиции.
Примечание: СМИ складе решения: подготовить индивидуальные запасов решения для всех исследованы компоненты средств массовой информации. Подготовка высококонцентрированных запасов для разбавления различных томов для всех компонентов. Это означает, что после объединения всех запасов решения в их высоком объеме согласно плану дизайн, это не может превышать объем окончательный культивирования, см. пункт «Поколение среднего Стоковый раствор дозирования списка» шаг 1.3.3. Если добавление высококонцентрированного раствора приводит к очень низкой дополнение тома, например <й 1/100 окончательного культивирования тома, разбавить раствор соответственно. Например в этом исследовании был определен дозирования количества менее 10 мкл нереализуемыми. Как правило, прослеживающего элемента решения как высоко концентрированный, как 1,000fold в отношении окончательного стандартной концентрации в среде. Это выгодно сосредоточиться компоненты средств массовой информации как кратные (X-фолд) в отношении концентрации в ссылка рецепт. Поступая таким образом, избежать неосуществимыми дозирования объемы дробные десятичные числа. В дополнительном документе приведены подробные рецепты для решения всех запасов CgXII среды.- Банк рабочих клеток (СКТ)
Примечание: Для каждого эксперимента по выращиванию, используется один из ДСП аликвота. Если необходимо больше аликвоты, использования 100 мл мозг сердца инфузии (BHI) средний в 1000 мл озадачен встряхнуть флакон или прививать несколько трясти колбы, которые объединяются перед добавлением раствора глицерина.- Подготовка единого колоний рекомбинантных выражение pCGPhoD штамм C. glutamicum Bs- GFP43 на плитах агара (37 г/Л BHI порошок, 20 г/Л агар, канамицин 25 мг/Л). Материал покрытия либо может прийти из свежих преобразования или криоконсервированных Алиготе.
- Банк рабочих клеток (СКТ)
Примечание: Для занятых BioLector MBR системы в этом исследовании, рассеянный свет (биомассы) и GFP флуоресценции являются интенсивности измерения, которые требуется определенное значение усиления назначен. Чем больше прибыль, тем выше оптический сигнал усиливается; Это также, почему рассеянного света и флуоресценции измеряются в произвольных единицах (а.е.). Определите значения подходящего прирост биомассы и обнаружения гена GFP в предварительные эксперименты, наряду с подходящим пожимая частоты и заполнения тома, чтобы избежать ограничения кислорода в более высоких концентрациях биомассы на более поздних этапах процесса. Условия занятости культивирования («Flowerplates», т.е., цветок образный 48-ну MTPs, пожимая частота 1200 об/мин, объем 1000 мкл, глюкозы 10 г/Л как источника основных углерода заполнения) обеспечивает кислорода неограниченное культивирования. Для максимальной кислорода скорости передачи, вытекающие из других комбинаций заполнения тома и покачивая частоты в форме цветка 48-ну MTPs доступны спецификаций от поставщика. Кроме того росту дефектов отдельных культур может возникнуть из-за низкого количества вторичных субстратов (например, азот, микроэлементы). Таким образом проверьте концентрация биомассы в конце культивирования. В этом исследовании такой рост эффекты не наблюдались.
- Определите протокол культивирования для MBR системы («BioLector») следующим образом:
- Filterset 1: Биомассы, получить 14. Filterset 2: рН, усиление пресет. Filterset 3: Ро2, усиление пресет. 4: GFP, получить 80.
- Покачивая частота: 1200 об/мин.
- Температура: 30 ° C.
- Время цикла: 15 мин.
- Время эксперимента: руководство (культивирования не будет автоматически остановлена).
Примечание: Почти любую жидкость, робот системы обработки способен читать дозирования действия из внешних файлов. В основном минимальной информации, необходимой является объем передачи и положение источника реагента, а также назначения каждого представленного лабораторное оборудование позиции на роботизированной палубы и конкретных полости внутри лабораторного оборудования. Однако необходимо учитывать различный синтаксис для различных жидких систем обработки. Рисунок 2 показывает структуру файл примера для занятых системы дозирования в этом исследовании.
- Четыре типа акций решений являются накапаны в каждом выращивания хорошо:
- Складе решения компоненты средств массовой информации, которые разнообразны («Вариации запасы»).
- Воды, чтобы компенсировать различные совокупные объемы выше запасов.
- Стоковый раствор («Отдых фондовой»), содержащий все компоненты, которые устанавливаются. Это Стоковый раствор может состоять из запасов, содержащих различные компоненты, которые являются, например, хранятся на разных температурах или стерилизовать различными методами.
- Посевным материалом, который должен быть добавлен в качестве последнего компонента и положить на Рабочий стол перед добавлением во избежание урегулирования клеток.
- В выращивании, вычислите тома, которые могут быть переданы на все компоненты средств массовой информации согласно:
Тома, чтобы быть добавлены для некоторых Вариантов запасов может быть нулевой, то есть, когда этот конкретный компонент пропускается. - Пересмотрите все расчетные тома V,я для подходящих номеров. Дозирования объем увеличивается в том шаги не должно быть слишком мал. При необходимости отрегулируйте концентрации Изменения запасов. Например минимальный объем дозирования здесь был определен как 10 мкл, и минимальный прирост был определен как 5 мкл. В общем эти тома должны определяться на основании экспериментально определяется точностью и точностью для обработки станции15,44используемые жидкости.
- Рассчитайте объем Остальных фондовых содержащие фиксированные компоненты для всех скважин следующим образом:
когда максимальный совокупный объем Запасов вариации
используется. Следовательно Рассчитайте необходимые концентрации фиксированных компонентов на Складе отдыха следующим образом:
Соответствующим образом подготовьте Остальные складе . - За культивирование хорошо, рассчитайте объем воды, чтобы добавить следующее:
- За культивирование хорошо, список всех томов будут добавлены в следующем порядке добавления: VH2O, VRestStock, Vя, Vинок. Формат дозирования список согласно спецификации жидкости, обработка станции, как показано в качестве примера на рисунке 2.
используется. Следовательно Рассчитайте необходимые концентрации фиксированных компонентов на Складе отдыха следующим образом:
- Создание протокола для обработки жидких робота. Рис. 3 и рис. 4 приведена пример протокола для системы «Янус», Реализовано соответствующее программное обеспечение «WinPREP». Протокол следует рассмотреть следующие аспекты:
- Включать достаточно выполнения стерильных жилья до подготовки средств массовой информации.
- Включать первоначальный чрезмерного очистка и промывка всех дозирования советы и труб.
- Выберите соответствующие лабораторное оборудование контейнеров для запасов решения. Здесь глубинно пластины с 12 столбцами подходят для хранения Запасов вариации, как все восемь дозирования советы могут окунуться в параллельный механизм в хорошо столбцы. Это значительно ускоряет подготовку средств массовой информации. Если 15 мл или 50 мл реактива трубы используются в качестве водохранилищ, только один подсказки дозирования может окунуться в его сразу.
- Остановите основной культуры после выполнения 17 h.
- Передача данных измерений с BioLector MBR устройства на подключенный компьютер, с помощью программного пакета BioLection по данным производителя руководство пользователя.
- Использование «управление данными → преобразования данных «функция пакета программного обеспечения «BioLection», который сопровождает MBR системы для преобразования файла необработанных данных в формате таблицы легкий доступ. Скопируйте данные сигнала GFP для всех скважин культивирования из столбца timestamp, ближе всего к 17 ч. выявлять GFP сигналы от ссылка выращивание скважин и средний. Нормализовать все оставшиеся GFP сигнала средняя опорного сигнала.
- Количественное определение титра GFP, используя дополнительные методы (если требуется)
- Передача клеточных суспензий от всех культивирования скважин в prelabeled реакции трубы и получить свободной ячейки супернатант после центрифугирования за 10 минут на максимальной скорости, используя настольная центрифуга.
- Перевести 200 мкл каждой свободной ячейки супернатант в черный 96-луночных ССП с прозрачным дном, и читать GFP конкретных флуоресценции в 488/520 Нм, используя читателя соответствующие микроплиты. Нормализовать GFP сигнала от всех скважин с Средний сигнал от культивирования ссылка, как шаг 1.5.3.
Примечание: Нельзя сравнить абсолютное GFP флуоресценции сигналов для различных измерительных устройств. Таким образом 5 эталонных штаммов из всех основных культивирования служат в качестве внутреннего стандарта. Повышение титра GFP могут быть выражены по отношению к внутреннему стандарту. Это позволяет для сравнения результатов различных экспериментов и различные методы количественной оценки GFP (см. следующие два шага). - Определите содержание белка supernatants клетки бесплатно стандартных протоколов, например, assay Брадфорд или BCA. В сочетании с результатами из шага 2 Возможен определение титра конкретных GFP белка.
Примечание: После измерения флуоресценции, используйте образец непосредственно из этой микроплиты. Использование многоканальных пипеток значительно облегчает необходимые жидкости, обработка шагов. - Выполнить визуализацию SDS-Page в supernatants клетки бесплатно следующие стандартные протоколы для проверки что большинство содержание белка увеличение объясняется повышенной секреции GFP.
Примечание: SDS-Page является более трудоемким, чем ранее упомянутые методы, особенно с высоким образец нагрузкой. Для целей проверки часто бывает достаточно для запуска SDS-страницы supernatants клетки бесплатно из ссылки среднесрочной и окончательной оптимизированный средних культивирования15.
2. анализ чувствительности (Рисунок 1: часть B).
Примечание: Цель этой части является определить важные факторы, которые оказывают значительное влияние на цель.
- Выберите диапазон начальной концентрации компонентов, средств массовой информации. Средний состав ссылка должна лежать внутри выбранной концентрации диапазонов.
- Выберите соответствующий Доу. Такие конструкции можно найти в литературе, например, от NIST/SEMATECH-e Справочник статистических методов (имеется на www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). Выбранный дизайн зависит количество СМИ компонентов интерес (здесь, 11) и количество выполненных экспериментов (здесь, 32). В данном примере дизайн «2IV11-6» был выбран, приводит к 32 экспериментов и позволяет оценки влияния повышения концентрации одного из одиннадцати компонентов на цели интерес. Чтобы быть более конкретным, основные эффекты не путать с парой фактор взаимодействия. Они могут быть confounded с выше порядок взаимодействия, которые, однако, скорее всего не значительные.
- Используйте остальные скважины (здесь, 16) для выполнения нескольких реплицирует со ссылкой среднесрочной оценки воспроизводимости процесса. Реплицирует одинаково должна распространяться через пластину для себя позиционные эффекты. Среднее значение измеренной вывода из экспериментов ссылка используется для нормализации. То есть каждая измеренная вывода анализа чувствительности делится на среднее значение ссылка выхода.
- Рассчитать основные и если возможно комбинаторной эффекты с помощью программного обеспечения соответствующей статистики. Классический дизайн эксперимента на основе Полиномиальная аппроксимация45. К примеру MATLAB функция mvregress может использоваться для оценки коэффициентов полинома.
, его максимальное значение.3. итеративной оптимизации (Рисунок 1: часть C)
Примечание: средство MATLAB KriKit был использован для интерпретации и анализа статистических данных36. KriKit позволяет построить модель с данными кригинга. Эта модель кригинга предсказывает функциональные взаимоотношения между компонентами СМИ и цель. Она также предоставляет информацию о неопределенности прогноза. Высокая степень неопределенности указывает зашумленных данных и/или плотность данных недостаточно.
- ДОУ
Примечание: Новые эксперименты итеративно предназначены, по результатам предыдущего выполнения.- В первой итерации дизайн новых экспериментов для подробного расследования выявленных СМИ компонентов интерес. Экспериментальные результаты от раздела 2, не может быть передана итеративной оптимизации (раздел 3), как концентрации компонентов без соответствующих эффект теперь крепятся к значению соответствующих ссылок. Следовательно эксперименты с анализа чувствительности и итеративной оптимизации не сопоставимы.
- В противном случае следуйте схеме показано на рисунке 1, кадр «Итеративной оптимизации». Если оптимальный потенциал находится внутри диапазона определенной концентрации, новые эксперименты разработаны с использованием ожидаемого улучшения40,46. В панели KriKit интегрирован экспериментальный дизайн, основанный на ожидаемого улучшения. Если оптимум лежит на границе, раскройте диапазон концентраций.
- Проводить эксперименты на разработан образец очков согласно экспериментальные методы, определенные в разделе 2.
- Статистический анализ
- Постройте модель кригинга, используя объединенные данные из всех итераций, включая текущий.
- Исследовать модель вывода, визуализации, с помощью всеобъемлющих инструментов KriKit (2/3D интерполяции, анализ кино, скрининг участок и т.д.).
- Если оптимальное области оценивалась с достаточной точностью, остановите оптимизации. Если нет, перейдите к шагу 3.1.
Примечание: Рисунок 6 иллюстрирует итеративной оптимизации для изучения теста. Диапазон концентраций последовательно была расширена до плато был найден (Итерация 1-6). Седьмой итерации был использован для изучения границ более подробно.
4. Проверка результатов (Рисунок 1: часть D)
Примечание: После окончания итеративной оптимизации, первоначальные предположения должны быть проверены на достоверность.
- Повторить анализ чувствительности (раздел 2) для оптимального среднего состава. То есть концентрации компонентов, которые исследуются в Рисунок 1 (часть C) крепятся к их оптимальные значения. Концентрации других компонентов различаются согласно соответствующим Доу.
Примечание: Аналогичные результаты в обоих фильмов показывают, что уровни концентрации исследованных компонентов не изменяет эффект других компонентов. Если проверка показывает значительные различия в результатах из части B, компоненты с эффектом изменения следует добавить в пул исследуемых компонентов и часть C следует повторить. - В случае косвенного измерения (например, флуоресценции как индикатор для концентрации продукта) применяются подходы ортогональные измерения (например, деятельности пробирного, Брэдфорд или BCA белка количественной оценки, страница SDS) для подтверждения изменений в Цель интереса путем сравнения результатов от среднего ссылки и оптимизированный средних15.
Representative Results
Представил протокол был применен для максимального титра секретируемые GFP. В частности GFP титр после 17 ч культивирования был выбран в качестве цели оптимизации. Онлайн флуоресцентным обнаружением GFP допускается простой продукт количественной оценки. Однако нормализация GFP сигнал с данными от выращивания ссылка является необходимым обеспечить воспроизводимость и сопоставимости результатов. Предварительный отбор компонентов, средств массовой информации была проведена на рациональной основе, как описано в разделе 1. Эксперименты были проведены следуя инструкциям раздела 1: параметры процедур мокрые лаборатории были определены для всего исследования, обеспечивая согласованность и воспроизводимость результатов.
Как описано в разделе 2, первоначальная проверка была выполнена для выявления соответствующих компонентов, показывая значительное влияние на цели оптимизации для дальнейшего, более подробного изучения. Система на базе МТЗ MBR позволяет 48 экспериментов, чтобы выполняться параллельно. Принимая во внимание максимальное возможное количество параллельных экспериментов на одном MTP (48) и общее количество СМИ компонентов (11) делает 2IV11-6 дробных дизайн подходящим выбором. Этот экспериментальный дизайн включает в себя 32 эксперименты и позволяет оценки основной эффект для каждого из компонентов исследуемых СМИ. Оставшиеся культивирования скважин (16) были использованы для несколько реплицирует экспериментов с среднего ссылки для оценки воспроизводимости и позиционные эффекты. То есть, каждый эксперимент проводится один раз (не реплицирует), за исключением ведения эксперимента (пять репликация).
В таблице 1 приведены результаты анализа скрининга. В диапазоне считаются концентрации различной большинство СМИ компонентов не показали заметное влияние на цель. Компонент NH4+ показывает сильный отрицательный эффект, в то время как Ca2 + и Mg2 + показывают сильные позитивные тенденции. Эффект мг2 + не имеет важное значение для текущего диапазона концентрации, но может быть для более широкого диапазона концентрации. Следовательно было решено опустить NH4+ от носителя и исследовать эффект Ca2 + и Mg2 + в дальнейших экспериментов.
Раздел 3 описывает итеративной оптимизации процедура, которая используется для максимального сигнала флуоресценции GFP при различной концентрации Ca2 + и Mg2 +. В итерации 1 был испытан гипотеза, что NH4+ может быть пропущен. Диапазон концентраций Ca2 + и Mg2 + был принят от проверки анализа. Минимальная концентрация NH4+ был равным нулю и максимальная концентрация был принят от скрининга эксперимент. В следующих экспериментах концентрации компонента были распределены по 3 x 3 x 3 сетки внутри диапазона определенной концентрации, что приводит к 27 экспериментов. Во время всех культур, пять реплицирует ссылку среды были включены, который служил как внутренний стандарт и обеспечить, что не позиционные эффекты над ССП произошло. Для оставшихся 16 скважин концентрация NH4+, Ca2 +и Mg2 + были случайным образом распределены внутри заданного диапазона.
Рисунок 5 A визуализирует результаты первых итераций. Метки оси относятся к концентрации компонент, используемый в оригинальной среде ссылка, обозначенный x Ref. Синей поверхности представляют собой интерполяции кригинга, которые были рассчитаны с использованием программного обеспечения KriKit. Каждая поверхность ассоциируется с уровень относительной концентрации для NH4+ (темно-синий: 0 x Ref, клетчатый: 1 x Ref, светло-голубой: 2 x Ref). Это визуальное представление показывает, что это благоприятные опустить NH4+. Интерполяции поверхности также показывают положительные эффекты мг2 + и Ca2 +, как все самолеты рост с ростом концентрации.
На основании результатов итерации 1, было принято решение расширить концентрация диапазон Ca2 + и Mg2 + , удвоение максимальной концентрации и ветра экспериментальный дизайн окна в верхнем правом углу, см. Рисунок 5 Б. внутри этот ряд, концентрации были распределены на сетке 6 x 6. Это гарантирует равномерное распределение в диапазоне полной концентрации, ведущих к оптимальных результатов интерполяции кригинга. Рисунок 5 B показывает сюжет интерполяции кригинга на основе комбинированных данных измеряется в обоих итераций (красные точки и желтые квадраты). Для обоих, Ca2 + и Mg2 +, по-прежнему положительный эффект увеличения их концентрации. Следовательно процедура была повторена путем удвоения максимальная концентрация и таким образом, окно экспериментальный дизайн был перемещен изучить границы правом верхнем углу.
Рисунок 6 A дает обзор оставшихся процедуры оптимизации. Анализ собранных данных набора до итерация 3 показали, что было определено ограничение положительный эффект мг2 +, то есть, оптимальная концентрация диапазон мг2 + . Поэтому было решено расширить диапазон концентраций только Ca2 + (Итерация 4). Эта процедура повторяется дважды (итерация 5 и 6) пока не было найдено насыщение сигнала GFP. Это насыщенность объясняется осадков солей Ca для прикладной концентрации Ca2 +, которые не доступны для ячейки.
Экспериментальные результаты всегда возмущенного шум, результате интерполяции кригинга появляется нерегулярные и визуальный осмотр может привести к ложным выводам. Однако оптимальная концентрация спектр компоненты средств массовой информации для насыщенных GFP сигнала могут быть надежно идентифицированы с статистики z -тест, который также реализуется в KriKit. Z -тест непосредственно использует встроенные статистическую информацию, представленную кригинга метод, то есть, предсказание ценности и прогнозирования неопределенности. Рисунок 6 B показывает выявленных плато, как определяется и визуализировать с помощью панели KriKit.Панель KriKit свободно доступных36 и поставляется с подробный учебник, который объясняет, как использовать ее возможности.
Если найдено более двух соответствующих компонентов, 3D-визуализация достигает своего предела. KriKit предоставляет несколько других возможных визуальное представление методы, такие как фильмы или «скрининг сюжет». Если оптимальный потенциал находится внутри диапазона определенной концентрации, новые эксперименты автоматически разработаны с использованием ожидаемого улучшения40,46. В панели KriKit интегрирован экспериментальный дизайн, основанный на ожидаемого улучшения. Более подробную информацию можно найти в документации по программному обеспечению.
После итерационной процедуры была проведена проверка результатов, как описано в части D. Срок действия первоначальных предположений была проверена путем выполнения дополнительных чувствительность анализа с помощью оптимального среднего состава. То есть все компоненты первоначальных средств массовой информации, интерес были разнообразны, но Ca2 + и Mg2 + были установлены для их оптимальной концентрации. В этом исследовании, оптимальные концентрации 
= 32 x Ref и 
= 6,8 x Ref были выбраны. Таблица 2 показывает результаты проверки скрининга. Похож на первоначальный чувствительности скрининга (см. таблицу 1), NH4+ по-прежнему имеет значительное отрицательное влияние и остаточное влияние по-прежнему незначительны.
Благодаря легкий доступ GFP флуоресценции сигнал от выращивания подвеска была использована для количественно внеклеточного титр GFP во всех экспериментов. Для проверки причин GFP флуоресценции был апробирован против других измерений. Потому что GFP выделяется через ТАТ путь, флуоресценции сигнал не может различать внутри - и внеклеточной GFP. Таким образом культивирования были воспроизведены с помощью ссылки средних и оптимизированный среднего. Помимо измерения флуоресценции от культивирования клеток бесплатно supernatants, содержание белка был количественно assay Брадфорд и (полу)-качественное улучшение КГВ визуализированы SDS-Page15. Все результирующие измерения сигналов были примерно в два раза для культивирования с оптимизированной среде по сравнению с ссылкой среднего и проверены примерно 100% улучшение показателей секрецию оптимизации среды. Следовательно GFP конкретных флуоресценции выращивания подвески можно считать подходящим метрики для оптимизации цели, т.е., внеклеточная GFP титр.
Рисунок 2 : Скриншот из списка объем дозирования для анализа чувствительности. Уникальный идентификатор записи в первом столбце назначить всех томов строки; Этот идентификатор является хорошо количество целевых культивирования ССП на Рабочий стол жидкого обработчика, см. рис. 4CССП. Оставшиеся столбцы кодировать томов для различных решений («СЛН-01» для «СЛН-15»), чтобы быть накапаны. Совокупный объем одной строке соответствует объему окончательный выращивания соответствующих хорошо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Скриншот из жидкости, обработки программного обеспечения управления «WinPREP». Слева: Приказал строки команд, включая команды передачи для каждого штока решения быть накапаны. До окончательного команды для добавления посевным материалом пользователю запрос вставляется чтобы убедиться, что семя культуры помещается за столом как раз вовремя. Справа: Схема рабочего стола, включая лабораторное оборудование источник для изменения запасов (два глубоких скважин пластины с 12 столбцов подобных скважин), желоб реагент для отдыха фондовой, воды и посевным материалом и культивирования целевой подготовки СМИ ССП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Составление подробных скриншоты для установки дозирование раствора запасов. (A) убрать команду для пипетирования Fe запасов. Лабораторное оборудование источник и источник хорошо в пределах отмечены на Рабочий стол чтения рамы и красных столбца соответствующего глубинно пластины. Лабораторное оборудование назначения и назначения скважин в пределах отмечены синяя рамка вокруг и синий скважин выращивания цели ССП. (B) подробный пример вид на уступки объемов дозирования для этого шага (Fe Стоковый раствор). Количество направлений считывается из списка дозирования, который имеет 48 строк. Объемы дозировки для всех назначения скважин для Fe Стоковый раствор находится в колонке 4 в списке дозирования. Обратите внимание, что первый столбец в списке дозирования содержит идентификаторы и не томов передаваться, смотрите Рисунок 2. (C) Подробная информация о назначения хорошо нумерации. Тома, написанные в строке #1 соответствующего дозирования списка будут накапаны в колодец, помеченные как #1 и так далее. Уэллс #01, #08, #41 и #48 соответствуют скважин A01, A08, F01 и F08 для кодирования буквенно цифровой, который также напечатаны в культивирование самом ССП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Подробные результаты от первой итерации. (A) интерполяции кригинга на основе экспериментальных данных итерации 1. Красные точки обозначают набор данных. Для сравнения, все три интерполяции поверхности наложение в одном сюжете (темно-синий: 0 x Ref, клетчатый: 1 x Ref, светло-голубой: 2 x Ref). Альтернативное представление результатов можно найти в других15. (B) интерполяции кригинга на основе экспериментов выполнена итерация 1 (красные точки) и Итерация 2 (желтые квадраты).Часть данных, представленных на этом рисунке была ранее опубликованных15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Изображение результатов итеративно собирать оптимизации. (A) окончательный кригинга модель прогнозирования. (B) статистические определения оптимальной области (красный) на основе статистики z-тест, который обеспечивается KriKit. Прямоугольники указывают последовательные шаги итеративной разработки и выполнения экспериментов. Часть данных, представленных на этом рисунке была ранее опубликованных15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Компонент | Среднее значение нормализованных коэффициент |
| FE2 + | -0.08 |
| MN2 + | -0,05 |
| Zn2 + | -0.21 |
| Cu2 + | -0.21 |
| NH4+ | -2.04 |
| Ni2 + | -0.11 |
| CO2 + | -0.10 |
| MoO42- | 0,03 |
| Бо33- | 0,06 |
| CA2 + | 1.00 |
| MG2 + | 0,45 |
Таблица 1: результаты анализа чувствительности. Значения коэффициента, представляющих средний эффект при увеличении концентрации компонента соответствующих средств массовой информации от ее центра значения его максимальное значение. Для оптимального экспериментальные проекты, как в стандартной литературе и используется здесь, представляющее стандартное отклонение непосредственно экспериментальный вариант из-за репликации эксперимента ссылку. Значения коэффициента были нормализованы на максимальное значение (0.0422 для компонента Ca2 +). Нормализованные и абсолютный коэффициент стандартное отклонение — 0,54 и 0.0226, соответственно.
| Компонент | Среднее значение нормализованных коэффициент |
| FE2 + | -1.00 |
| MN2 + | 1.00 |
| Zn2 + | -3.48 |
| Cu2 + | -0.52 |
| NH4+ | -15.95 |
| Ni2 + | 0,69 |
| CO2 + | -0.51 |
| MoO42- | -0.45 |
| Бо33- | -1.11 |
Таблица 2: результаты анализа чувствительности заключительного. Значения коэффициента, представляющих средний эффект при увеличении концентрации компонента соответствующих средств массовой информации от ее центра значения его максимальное значение. Как был использован оптимальный экспериментальный дизайн, стандартное отклонение зависит только от экспериментальный вариант, с помощью оптимизированного среднего состава. Экспериментальный вариант несколько увеличилась по сравнению с вариации, используя ссылку среды. Значения коэффициента были нормализованы на максимальное значение (0.0106 для компонента Mn2 +). Нормализованные и абсолютный коэффициент стандартное отклонение-3.63 и 0.0385, соответственно.
Discussion
Универсальный характер представленных протокола позволяет различные приспособления, например, для изучения других микробов выражение хостов9,47,48,49,50, 51, или для оптимизации других свойств целевого белка, как шаблон или дисульфида облигации гликозилирования. Протокол может также должны быть адаптированы к доступных лабораторное оборудование. Интеграция системы MBR позволяет увеличить экспериментальной пропускной способности, которая дает большую экономию времени. Однако при замене полностью инструментальной и controllable биореакторов MBR систем, масштабируемость результаты должны рассматриваться8,37,52,53. Использование МЭ методологий и математическое моделирование помогает увеличить информативность данных измерений в отношении изучал объективные54 эффективного планирования экспериментальных и данных на основе модели интерпретации15.
Изменения в метод
Рядом с универсальная и расширяемая роботизированной жидкости, обработки систем, как он используется в настоящем исследовании следует отметить, что есть несколько меньше жидкости, коммерчески доступных систем, которые способны выполнять эту задачу и могут быть размещены внутри обработки Ламинарный поток работы скамейки. Если не автоматизированная система дозирования, композиции различных средств массовой информации в соответствии с планом Доу также могут быть реализованы путем ручной дозирование с помощью единого или многоканальных пипеток. Поскольку ручной подготовки более подверженным ошибкам и потребует целенаправленных работы довольно долгое время, рекомендуется подготовить меньшее количество композиций различных средств массовой информации.
В зависимости от возможностей системы занятых MBR будет меняться соответствующий протокол культивирования. Например если не онлайн измерение биомассы формирования доступен, он может быть достаточно для измерения концентрации биомассы после окончания эксперимента роста. В сочетании с онлайн мониторинг pH и растворенного кислорода, который реализуется в нескольких системах MBR, насыщения роста может быть достоверно определен. В принципе рост эксперименты могут проводиться в ССП, только размещены внутри автоклавы-смесители, без использования системы MBR. В этом случае, должны обеспечиваться надлежащее выращивание условия: (1) кислорода ограниченной культивирования можно избежать с помощью MTPs с подходящим геометрией, в сочетании с надлежащей пожимая частоты и покачивая диаметров, например, площадь 96 или 24 глубокую хорошо пластины работали на 1000 об/мин на 3 мм броска или 250 об/мин на 25 мм броска, соответственно. Важно отметить, что чем ниже достижимых кислорода Максимальная скорость передачи, тем меньше углерода основной источник следует сосредоточить. Как упоминалось выше, для этого исследования, использование глюкозы 10 г/Л был подходящим для предотвращения ограничение кислорода для занятых культивирования условий; (2) выборки ССП культур для количественной оценки биомассы и продукта должны быть сведены к минимуму. Каждый раз, когда ССП удаляется от тряски инкубатора, передачи кислорода будет немедленно поломки которого может привести к неблагоприятным культивирования условий; (3) по мнению авторов не рекомендуется использовать ССП читателей как выращивания устройств, как эти устройства не были разработаны для этой цели. Например пожимая механики были построены для случайного смешивания планшет после добавления реагента и таким образом, часто не хватает надежности для длинных продолжительностью дней непрерывной тряски. Кроме того достаточного питания, необходимые для культивирования микроорганизмов не могут быть реализованы в этих читателей. Интеграция оптической плотности чтений в короткие интервалы времени требует остановки пожимая движения, привело неоднократные периоды ограничения кислорода. Кроме того испарения в таких системах течение длительного культивирования периодов будут исказить результаты. Для более подробной информации о удивительно сложной темы по использованию ССП для культивирования микроорганизмов читатель отсылался к литературы22,23,24,25,26 и ссылки на них.
Дополнительные соображения
Для ускорения итеративной оптимизации шаги рекомендуется тщательно выбрать аналитического метода для количественной оценки продукта. Быстрые и простые методы должны быть предпочтительным за счет точности и аккуратности, как итеративный экспериментальный дизайн стратегия допускает экспериментальной неточность. Однако окончательные результаты должны проверяться против продукт достаточно точной и точные методы количественной оценки, которые могут быть более сложными. В целом тщательной оценки и принятия решений о процедурах исследования требуют усилий в начале исследования, но платить в долгосрочной перспективе, после того, как обычные методы были созданы.
Настоятельно рекомендуется определить ссылку эксперимент, который сравнивается все эксперименты во время оптимизации. То есть прикладной компонент средней концентрации, а также измеренных вывода нормализуются через деления значения ссылки. Таким образом, каждый применяется и измеренное значение может интерпретироваться как x сложить значения ссылки. Принимать во внимание различия между пластинами, пять ссылки являются эксперименты на каждой табличке. Среднее значение результатов измерений используется для нормализации.
Это правило не может быть гарантировано что развитые среды является также оптимальным решением для других штаммов. Однако улучшение средних скорее всего будет также подходит для выращивания выражение штаммы с небольшой генетические различия, например, когда производить фермент варианты с одной аминокислотных замен полученные от мутагенеза исследования ( Хотя даже точечные мутации были описаны эффект клеточный метаболизм и гетерологичных выражение производительности55,56). В этом случае представленный протокол может быть первым шагом, затем протоколы для высокой пропускной способности выражение показы57. Если протокол используется для среднего развития с последующим масштаба до ФРС партии культивирования, оптимизированной среде должны быть проверены для соответствующих условий биопроцессов, как клон, скрининг в кампании на микромасштабной определены различные Топ исполнителей для различных стратегий кормления и культивирования СМИ52,58. Кроме того введен KriKit36 вообще может способствовать более целостный Биопроцесс оптимизации.Только недавно инструмент способности были расширены также поддерживать40многоцелевых оптимизации, которые могут быть важны для оптимизации как первичные и вторичные процессы59,60.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Научная деятельность центра науки биоэкономики были финансовой поддержке Министерство инноваций, науки и исследований в рамках NRW-Strategieprojekt BioSC (№ 313/323-400-002 13). Авторы благодарят Министерство инноваций, науки и исследования Северный Рейн-Вестфалия Heinrich Heine Университета Дюссельдорфа для стипендию Ларс Freier в рамках промышленной биотехнологии кластера CLIB-выпускник. Дополнительное финансирование было получено от программы запрещено включение «Гельмгольца инноваций лаборатории «Гельмгольц-Объединение немецких поддержать «Микробного Биопроцесс лаборатории – Гельмгольца инновационная лаборатория».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLector | m2p-labs | G-BL-100 | |
| Flowerplate | m2p-labs | MTP-48-BOH | For cultivation in the BioLector device |
| Sealing foil | m2p-labs | F-GP-10 | Sterile sealing for Flowerplate |
| MATLAB | Mathworks | 2016b | |
| KriKit | Forschungszentrum Jülich | n/a | Freely available, MATLAB installation required |
| Janus pipetting robot | Perkin Elmer | n/a | Includes "WinPrep" software installation |
| 12-column deep well microplate | E&K Scientific | EK-2034 | Container for medium stock solutions |
| 96 well microplates, transparent, F-bottom | Greiner | 655101 | For Bradford protein assay |
| µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom | Greiner | 655087 | For flourescence measurement in cell-free supernatants |
| Pipette Research plus multi-channel pipettes | Eppendorf | n/a | Facilitates manual liquid handling with microplates |
| TruPAG Precast Gels | Sigma | PCG2002 | For SDS-Page analysis of cell-free supernantants |
| Bradford Reagent | Sigma | B6916 | |
| C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP | n/a | n/a | Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007) |
References
- Choi, J. -M., Han, S. -S., Kim, H. -S. Industrial applications of enzyme biocatalysis: Current status and future aspects. Biotechnol Adv. 33 (7), 1443-1454 (2015).
- Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., Wang, X. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), (2012).
- Adrio, J. L., Demain, A. L. Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules. 4 (1), 117-139 (2014).
- Yim, S. S., An, S. J., Kang, M., Lee, J., Jeong, K. J. Isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 2959-2969 (2013).
- Hemmerich, J., et al. Use of a Sec signal peptide library from Bacillus subtilis.for the optimization of cutinase secretion in Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 15 (1), 208 (2016).
- Wendisch, V. F. Microbial production of amino acids and derived chemicals: synthetic biology approaches to strain development. Curr Opin Biotechnol. 30, 51-58 (2014).
- Lee, J. -Y., Na, Y. -A., Kim, E., Lee, H. -S., Kim, P. The Actinobacterium Corynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. J Microbiol Biotechnol. 26 (5), 807-822 (2016).
- Rohe, P., Venkanna, D., Kleine, B., Freudl, R., Oldiges, M. An automated workflow for enhancing microbial bioprocess optimization on a novel microbioreactor platform. Microb Cell Fact. 11 (1), 144 (2012).
- Liu, X., et al. Expression of recombinant protein using Corynebacterium glutamicum.: progress, challenges and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 652-664 (2016).
- Freudl, R. Corynebacterium glutamicum as a Platform Organism for the Secretory Production of Heterologous Proteins. Corynebacterium glutamicum: From systems biology to biotechnological applications. Burkovski, A. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. 161-177 (2015).
- Yim, S. S., et al. Development of a new platform for secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 113 (1), 163-172 (2015).
- Limberg, M. H., et al. Metabolic profile of 1,5-diaminopentane producing Corynebacterium glutamicum under scale-down conditions: Blueprint for robustness to bioreactor inhomogeneities. Biotechnol Bioeng. 114 (3), 560-575 (2016).
- Käβ, F. Assessment of robustness against dissolved oxygen/substrate oscillations for C. glutamicum DM1933 in two-compartment bioreactor. Bioprocess Biosyst Eng. 37 (6), 1151-1162 (2014).
- Teramoto, H., Watanabe, K., Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. High yield secretion of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum.using its own Tat-type signal sequence. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 677-687 (2011).
- Freier, L., Hemmerich, J., Schöler, K., Wiechert, W., Oldiges, M., von Lieres, E. Framework for Kriging-based iterative experimental analysis and design: Optimization of secretory protein production in Corynebacterium glutamicum. Eng Life Sci. 16 (6), 538-549 (2016).
- Huber, R., Roth, S., Rahmen, N., Büchs, J. Utilizing high-throughput experimentation to enhance specific productivity of an E. coli. T7 expression system by phosphate limitation. BMC Biotechnol. 11 (1), 22 (2011).
- Kottmeier, K., Müller, C., Huber, R., Büchs, J. Increased product formation induced by a directed secondary substrate limitation in a batch Hansenula polymorpha culture. Appl Microbiol Biotechnol. 86 (1), 93-101 (2010).
- Kennedy, M. J., Krouse, D. Strategies for improving fermentation medium performance: A review. J Ind Microbiol Biotechnol. 23 (6), 456-475 (1999).
- Kleman, G. L., Strohl, W. R. Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation. Curr Opin Biotechnol. 5 (2), 180-186 (1994).
- Jones, R., Gadd, G. Ionic nutrition of yeast: Physiological mechanisms involved and implications for biotechnology. Enzy Microb Technol. 12 (6), 402-418 (1990).
- Zhang, J., Greasham, R. Chemically defined media for commercial fermentations. Appl Microbiol Biotechnol. 51 (4), 407-421 (1999).
- Kensy, F., et al. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates: Determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time measurement during microbial growth. Biotechnol Bioeng. 89 (6), 698-708 (2005).
- Hermann, R., Lehmann, M., Büchs, J. Characterization of gas-liquid mass transfer phenomena in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 81 (2), 178-186 (2002).
- Duetz, W. A. Microtiter plates as mini-bioreactors: Miniaturization of fermentation methods. Trends Microbiol. 15 (10), 469-475 (2007).
- Funke, M., Diederichs, S., Kensy, F., Müller, C., Büchs, J. The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations. Biotechnol Bioeng. 103 (6), 1118-1128 (2009).
- Lattermann, C., Funke, M., Hansen, S., Diederichs, S., Büchs, J. Cross-section perimeter is a suitable parameter to describe the effects of different baffle geometries in shaken microtiter plates. J Biol Eng. 8, 18 (2014).
- Samorski, M., Müller-Newen, G., Büchs, J. Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 92 (1), 61-68 (2005).
- Kensy, F., Zang, E., Faulhammer, C., Tan, R. -K., Büchs, J. Validation of a high-throughput fermentation system based on online monitoring of biomass and fluorescence in continuously shaken microtiter plates. Microb Cell Fact. 8 (1), 31 (2009).
- Puskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. Development, parallelization, and automation of a gas-inducing milliliter-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng. 89 (5), 512-523 (2005).
- Bareither, R., Pollard, D. A review of advanced small-scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: Current state and future need. Biotechnol Prog. 27 (1), 2-14 (2011).
- Hortsch, R., Stratmann, A., Weuster-Botz, D. New milliliter-scale stirred tank bioreactors for the cultivation of mycelium forming microorganisms. Biotechnol Bioeng. 106 (3), 443-451 (2010).
- Isett, K., George, H., Herber, W., Amanullah, A. Twenty-four-well plate miniature bioreactor high-throughput system: Assessment for microbial cultivations. Biotechnol Bioeng. 98 (5), 1017-1028 (2007).
- Motta Dos Santos, L. F., Coutte, F., Ravallec, R., Dhulster, P., Tournier-Couturier, L., Jacques, P. An improvement of surfactin production by B. subtilis BBG131 using design of experiments in microbioreactors and continuous process in bubbleless membrane bioreactor. Bioresour Technol. 218, 944-952 (2016).
- Islam, R. S., Tisi, D., Levy, M. S., Lye, G. J. Framework for the Rapid Optimization of Soluble Protein Expression in Escherichia coli Combining Microscale Experiments and Statistical Experimental Design. Biotechnol Prog. 23 (4), 785-793 (2007).
- Huber, R., et al. Robo-Lector: A novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact. 8 (1), 42 (2009).
- Freier, L., von Lieres, E. Kriging toolKit (KriKit). , Available from: https://github.com/modsim/KriKit (2017).
- Kensy, F., Engelbrecht, C., Büchs, J. Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli.and Hansenula polymorpha fermentations. Microb Cell Fact. 8 (1), 68 (2009).
- Lu, C., Bentley, W. E., Rao, G. A high-throughput approach to promoter study using green fluorescent protein. Biotechnol Prog. 20 (6), 1634-1640 (2004).
- Zanzotto, A., Boccazzi, P., Gorret, N., van Dyk, T. K., Sinskey, A. J., Jensen, K. F. In situ measurement of bioluminescence and fluorescence in an integrated microbioreactor. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 40-47 (2006).
- Freier, L., von Lieres, E. Multi-Objective Global Optimization (MOGO): Algorithm and Case Study in Gradient Elution Chromatography. Biotechnol J. , (2016).
- Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol. 175 (17), 5595-5603 (1993).
- Weuster-Botz, D., Kelle, R., Frantzen, M., Wandrey, C. Substrate Controlled Fed-Batch Production of L-Lysine with Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Prog. 13 (4), 387-393 (1997).
- Meissner, D., Vollstedt, A., van Dijl, J. M., Freudl, R. Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 76 (3), 633-642 (2007).
- Morschett, H., Wiechert, W., Oldiges, M. Automation of a Nile red staining assay enables high throughput quantification of microalgal lipid production. Microb Cell Fact. 15, 34 (2016).
- Fisher, R. A. The design of experiments. , Oliver & Boyd. Edinburgh. (1935).
- Morschett, H., Freier, L., Rohde, J., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. A framework for accelerated phototrophic bioprocess development: Integration of parallelized microscale cultivation, laboratory automation and Kriging-assisted experimental design. Biotechnol Biofuels. 10, 26 (2017).
- Le Loir, Y., et al. Protein secretion in Lactococcus lactis: An efficient way to increase the overall heterologous protein production. Microb Cell Fact. 4 (1), 2 (2005).
- Anné, J., Vrancken, K., van Mellaert, L., van Impe, J., Bernaerts, K. Protein secretion biotechnology in Gram-positive bacteria with special emphasis on Streptomyces lividans. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1750-1761 (2014).
- Gupta, S. K., Shukla, P. Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications. Crit Rev Biotechnol. 36 (6), 1089-1098 (2016).
- Fu, L. L., Xu, Z. R., Li, W. F., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: implication for optimization of heterologous protein secretion. Biotechnol Adv. 25 (1), 1-12 (2007).
- Yoon, S., Kim, S., Kim, J. Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Rec Pat Biotechnol. 4 (1), 23-29 (2010).
- Hemmerich, J., et al. Comprehensive clone screening and evaluation of fed-batch strategies in a microbioreactor and lab scale stirred tank bioreactor system: application on Pichia pastoris producing Rhizopus oryzae lipase. Microb Cell Fact. 13 (1), 36 (2014).
- Glazyrina, J., Krause, M., Junne, S., Glauche, F., Strom, D., Neubauer, P. Glucose-limited high cell density cultivations from small to pilot plant scale using an enzyme-controlled glucose delivery system. New Biotechnol. 29 (2), 235-242 (2012).
- Gernaey, K. V., et al. Monitoring and control of microbioreactors: An expert opinion on development needs. Biotechnol J. 7 (10), 1308-1314 (2012).
- Rahmen, N., Fulton, A., Ihling, N., Magni, M., Jaeger, K. -E., Büchs, J. Exchange of single amino acids at different positions of a recombinant protein affects metabolic burden in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 14, 10 (2015).
- Rahmen, N., et al. A particular silent codon exchange in a recombinant gene greatly influences host cell metabolic activity. Microb Cell Fact. 14, 156 (2015).
- Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in E. coli. J Vis Exp. (89), e51464 (2014).
- Scheidle, M., et al. High-throughput screening of Hansenula polymorpha clones in the batch compared with the controlled-release fed-batch mode on a small scale. FEMS Yeast Res. 10 (1), 83-92 (2010).
- Baumann, P., Bluthardt, N., Renner, S., Burghardt, H., Osberghaus, A., Hubbuch, J. Integrated development of up- and downstream processes supported by the Cherry-Tag™ for real-time tracking of stability and solubility of proteins. J Biotechnol. 200, 27-37 (2015).
- Baumann, P., Hahn, T., Hubbuch, J. High-throughput micro-scale cultivations and chromatography modeling: Powerful tools for integrated process development. Biotechnol Bioeng. 112 (10), 2123-2133 (2015).
