Summary
Этот протокол направлен для описания метода для изучения Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +- срабатывает митохондриальной отек изолированных митохондриях SH-SY5Y клеток, шаг за шагом.
Abstract
Производства АТФ, окислительное фосфорилирование является основной функцией митохондрий. Митохондрий у высших эукариот также участвуют в цитозольной Ca2 + буферизации, и производства АТФ в митохондриальной может быть опосредовано intramitochondrial бесплатно Ca2 + концентрации. CA2 + водоудерживающего потенциала может рассматриваться как митохондрии возможность сохранить кальция в матрице митохондриальной. Накопленные внутриклеточных Ca2 + приводит к проницаемости внутренней митохондриальной мембраны, назвал открытие митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP), что приводит к утечке молекул с молекулярной массой менее 1,5 кДа. CA2 +-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Здесь мы описываем двух анализов для изучения Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях. После определенного количества Ca2 + добавляются все шаги можно завершить за один день и записан Считыватель микропланшетов. Таким образом, эти два простых и эффективных анализов могут быть приняты для оценки Ca2 +-связанных митохондриальной функции.
Introduction
Митохондрии являются основной сотовой органов производить почти 95% АТФ, используемые окислительного фосфорилирования в mammalian клетках. Сообщается, что поглощенных всех концентрации Ca2 + , митохондрии, присутствие ADP и неорганического фосфата может использоваться для фосфорилировать ADP синтеза АТФ1. Когда концентрация цитозольной Ca2 + идет выше порога, митохондрии можно поглощение Ca2 + быстро и измеряем его медленно. Таким образом функционирования митохондрий может приток увеличение цитозольной Ca2 +. Отношения к участию в окислительного фосфорилирования, митохондриальных Ca2 + также принимают участие в цитозольной кальция сигналов и активировать механизм митохондриальной apoptotic, вызывая открытие mPTP в внутренней митохондриальной 2мембраны. Широко признано, что аномальные повышение внутриклеточной Ca2 + может вызвать митохондриальной массивные отеки, открыв mPTP3. Таким образом, этот протокол призван оценить функцию митохондрий путем определения количественных показателей митохондриальной Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +-trigged митохондриальной отек.
CA2 + водоудерживающего потенциала является измерение способности митохондрий цитозольной поглощение кальция. Митохондрий может регулировать кальций зависимых клеточных процессов поглощения кальция в виде неактивных преципитаты и буфере цитозольной свободного кальция. Нарушением Ca2 + водоудерживающего потенциала происходит в стресс явления, связанные с ограничением энергии и даже нейродегенеративных заболеваний4,5. Изолированных митохондриях или digitonin-permeabilized клетки могут использоваться для идентификации Ca2 + водоудерживающего потенциала, и повышенной способностью накапливать Ca2 + , изолированных митохондриях с дополнительная глутамата и малат не осуществляется митохондриальной изоляции процедура6. Титруемая количество digitonin должен быть использован для разрушения мембран плазмы из различных типов клеток. Hexapotassium соль Ca2 +-привязка зеленого флуоресцентного красителя, Ca2 +-чувствительных клеток impermeant видимый свет возбудимых индикатор, был широко используется7. CA2 +-привязки зеленого флуоресцентного красителя является показателем низкого сродства и используется, чтобы показать, что внутриклеточные бесплатно Ca2 + концентрации продолжать расти в течение длительного (5 мин) стимуляцию8. Этот метод был менее чувствительны, чем метод радиоактивных фильтр, но была значительно упрощена. Дополнительные Ca2 + возвышает кальция Зеленая Флуоресценция и Ca2 + поглощение митохондрий возвращает флюоресценция базовой линии. Последовательных добавлений Ca2 + были сделаны до тех пор, пока митохондрии не поглощения extramitochondrial Ca2 + 9. Считыватель микропланшетов флюоресценции может использоваться непрерывно доклад кальция зеленой флуоресценцией.
После Ca2 + накопления митохондрии деполяризованный, выпущенный Ca2 + в среду и начал набухать. CA2 +-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Электронная микроскопия и уменьшение поглощения света на 540 Нм может использоваться для измерения Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек10,11. Митохондрии тома можно непосредственно определяется Форвард угол рассеяния света12, где уменьшение поглощения отражают пассивной отек митохондриальной матрицы.
Здесь, мы иллюстрируем методологии для изучения митохондриальной Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях от SH-SY5Y клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. изоляция митохондрий
Примечание: Все решения и оборудование следует охладить до 0 - 4 ° C и хранится на льду.
- Семя клетки6 SH-SY5Y около 3 x 10 на 10 см клетки культуры блюдо. Культура клетки в высоких глюкозы Дульбекко модифицированная среднего орла с 10% плода бычьим сывороточным, пенициллин (100 ед/мл)-стрептомицином (100 мкг/мл). Сохранять при 37 ° C в инкубаторе, содержащей 5% CO2 на ночь.
Примечание: по крайней мере 1-2 x 107 SH-SY5Y клетки необходимы для калибровочных изоляции. - Удаление среды и вымыть клетки с около 1 мл холодного льда PBS в блюдо культуры клеток 10 см 3 раза.
- Добавить новый 1 мл холодного льда PBS в 10 см клетки культуры блюдо и скрип адэрентных клеток в новой 1,5 мл трубки. Центрифуга на 800 x g 10 мин при 4 ° C.
- Во время центрифугирования Подготовьте 5 мл митохондриальной изоляции буфера (250 мм сахарозы, 10 мм HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-пиперазина ethanesulfonic кислоты), 10 мм KCl, 1,5 мм MgCl2, 1 мм ЭДТА) дополнены 50 мкл акций ингибиторы протеазы решение (100 x концентрации; 1 ЭДТА бесплатные таблетки растворяют в 500 мкл ddH2O).
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 1 мл буфера митохондриальной изоляции. Инкубируйте 1,5 мл на льду за 30 мин.
- Лизируйте подвесной клетки с стекла гомогенизатора (15-25 штрихи) вверх и вниз вручную на льду.
Примечание: Убедитесь, что есть никаких пузырей, когда гомогенизированные клетки. Граф нетронутым клеток и обнажённая ядер Микроскоп визуально и подтвердить, что > 90% клеток поломка произошла. - Перенесите огневки в 1,5 мл трубки и центрифуги на 1000 x g 5 минут при температуре 4 ° C для удаления мусора (ядер и оставшихся нетронутыми клетки).
- Перевести супернатант в новой 1,5 мл трубки и центрифуги на 1000 x g 5 минут 4 ° C.
- Супернатант передать новой трубки и центрифуги в 14.000 x g 15 мин 4 ° C.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы, содержащие митохондрии с 1 мл буфера митохондриальной изоляции.
- Центрифуга решение для 15 мин на 14 000 x g 4 ° C для митохондрий.
- Результате гранулы митохондрий должны хранится на льду и высокомобильна в 50-100 мкл KCl СМИ (125 мм KCl, 2 мм K2HPO4, 1 мм MgCl2, 20 мм HEPES, 5 мм глутамата, малат 5 мм и 2 мкм ротенон, рН 7,4) согласно Пелле тома перед любой осел Ай.
- Используйте 5 мкл митохондриальной решения для измерения концентрации митохондриальных белок стандартного анализа BCA, измерения OD562 с помощью пластины читатель13.
2. Определение митохондриальной Ca2 + водоудерживающего потенциала
- Подготовить KCl СМИ и добавить Ca2 +-привязка зеленого флуоресцентного красителя до конечной концентрации 0,5 мкм до эксперимента.
- Передача 1 мл изолированных митохондриях (0,4 мг/мл) в СМИ KCl, содержащий 0,5 мкм Ca2 +-привязка зеленый Люминесцентную краску в каждом 6-ну пластины хорошо.
- Инкубировать митохондрии и Ca2 +-привязка зеленого флуоресцентного красителя в пластину 6-ну при комнатной температуре в защищенном от окружающего света за 1 мин добавить 4 мкл аликвоты 20 мм CaCl решение2 (20 мм CaCl2, 127 мм KCl, 1 MgCl2 20 мм HEPES, 5 мм глутамата, 5 мм малат, рН 7,4) для каждой пластины 6-Ну хорошо, с помощью автоматического обойтись параметр ввести 200 нмоль Ca2 +/mg митохондриальных белок.
- Используйте спектрометр флюоресценции для мониторинга флуоресценции изменений каждые 3 s 2 мин с волны возбуждения 506 Нм и длина волны излучения 531 Нм. Пластины оснащен встряхивания на 600 об/мин для 3 s между чтений, контролируемых программного обеспечения (рис. 1).
- Добавьте дополнительные 4 мкл Алиготе 20 мм CaCl2 решения для каждой скважины и отслеживать изменения флюоресценции каждые 3 s 2 мин повторить этот шаг до тех пор, пока флюоресценция увеличивается с течением времени.
Примечание: Митохондрий оспариваются с добавил Ca2 + свидетельствует увеличение записи флуоресценции. При открытии mPTP флюоресценция возрастает со временем. - Интерпретируйте общее количество Ca2 + добавлены до тех пор, пока mPTP открывается как Ca2 + водоудерживающего потенциала.
3. Определение Ca 2 +-индуцированной митохондриальной опухоль
- Подготовьте KCl СМИ до эксперимента.
- Передача 1 мл изолированных митохондриях (0,4 мг/мл) в СМИ KCl в каждом 6-ну пластины хорошо.
- Добавьте 10 мкл 20 мм CaCl2 водный раствор (500 нмоль/мг митохондриальных белок) в митохондриальных белок, чтобы вызвать митохондриальной отек.
- Запись уменьшение поглощения на 540 Нм каждые 3 s на Считыватель микропланшетов контролируемых программного обеспечения для 10 мин (рис. 2). Флуоресценции изменения были вызваны притоком растворенных веществ через внутреннюю мембрану митохондрий.
Примечание: Снижение поглощения на 540 Нм соответствует опухшие митохондрий. Если читатель не наблюдать уменьшение поглощения, больше читать интервал или читая время может быть принят.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результаты Ca2 + водоудерживающего потенциала:
Результаты были высказаны как флуоресценции значения. С дополнительные импульсы Ca2 + (200 nmols/мг митохондриальных белок), увеличилось на двойной выше базовой линии с открытием mPTP флуоресценции. 5 мкм Bongkrekate (BKA), ингибитор Ca2 +-индуцированной mPTP открытия, или 1 мкм atractyloside (ATR), активатор Ca2 +-индуцированной mPTP открытия, были добавлены в изолированных митохондриях. Количество общего добавлен Ca2 + до открытия mPTP обозначается двойной увеличение выше базовых флуоресценции было истолковано как Ca2 + водоудерживающего потенциала. Наши данные показали, что митохондриальной Ca2 + сохранение потенциала в лечении BKA было намного выше, чем в группе ATR. Эти данные подтверждают подходящие измерения митохондриальной Ca2 + водоудерживающего потенциала (рис. 3).
Представитель результаты Ca2 +-индуцированной митохондриальной отек:
Результаты были высказаны как процент изменения в поглощения на 540 Нм против первоначального поглощения в течение 10 минут после добавления CaCl2. Вызванные добавлением Ca2 + (500 нмоль/мг митохондриальных белок), снижение поглощения, мониторинг на 540 Нм указал митохондриальной отеки. С обращения с BKA или ATR Калибровочная кривая показал незначительное или резкое снижение по сравнению с первоначальной поглощения, указав, что BKA может препятствовать mPTP открытия в то время как ATR может облегчить mPTP открытия (рис. 4).
Рисунок 1: параметры программного обеспечения для митохондриального Ca2 + сохранение потенциала assay. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: параметры программного обеспечения для митохондриального Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек пробирного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Измерение Ca2 + водоудерживающего потенциала. Загородный митохондриальной Ca2 + в изолированных митохондриях измерялась fluorometrically с Ca2 +-привязка зеленый Люминесцентную краску при наличии 5 мкм bongkrekate (BKA), 1 мкм atractyloside (ATR) или пустой элемент управления (кон). Следы Ca2 + удержания изолированных митохондриях с BKA, ATR и CON были измерены в 506 Нм (Ex) и 531 Нм (Em) на Считыватель микропланшетов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Измерение Ca2 +-индуцированной митохондриальной припухлость. CA2 +-индуцированного митохондриальной отек SH-SY5Y присутствии 5 мкм bongkrekate (BKA), 1 мкм atractyloside (ATR) или пустой элемент управления (кон) было выражено как процент снижение Калибровочная кривая начального поглощения на 540 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь, мы описали простой и эффективный протокол для митохондриального Ca2 + сохранение потенциала пробирного и Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек пробирного.
Для митохондриального изоляции убедитесь, что все материалы и трубы находятся на льду, особенно когда гомогенизации клетки. трипсин 0.25%-ЭДТА может также использоваться для отсоединения клетки от блюдо для 5 минут при 37 ° C. После 15-25 ударов необходимо соблюдать нетронутыми мембраны клетки под микроскопом и избежать поломки мембраны митохондрий. Однако, изолированных митохондриях, которые мы получили сырой митохондрии и очищенного митохондрий могут быть получены через 1,0 М / 1,5 м разрывными сахарозы градиент. Биологические характеристики митохондрий в живых клетках больше похожи на те в естественных условиях чем в изолированных митохондриях из-за концентрации компонентов среды, которые окружают митохондрий. Митохондриальной Ca2 + водоудерживающего потенциала или Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек пробирного был определен напряжением условиях. Для определения функционирования митохондрий 5 мм сукцината могут быть добавлены как респираторные субстратов вместо глутамата и малат6.
CA2 +-привязка зеленого флуоресцентного красителя (связывает Ca2 + с сродство 4.29 ± 0,67 мм), больше подходит для измерения концентрации всех Ca2 + чем выше сродство красителей, например фура-2 7. После добавления Ca2 +-привязка зеленого флуоресцентного красителя, инкубации должна быть меньше, чем 240 s. последовательных добавлений Ca2 + (колеблется от 25-200 нмоль) вводили каждые 1-3 мин. Калибровочные кривые показывают концентрации Ca2 + что митохондрии неспособны поглощать, указывающее митохондриальной поглощение импульсов Ca2 +. В противном случае Ca2 +-привязка зеленого флуоресцентного красителя также используется в кальция, сигнализации расследований, например внутриклеточных бесплатные Ca2 + концентрации измерения, следующие Ca2 + приток и выпуска и multiphoton возбуждения Визуализационная диагностика Ca2 + в живых тканях.
Для определения Ca2 + -индуцированной митохондриальной припухлость, отек может также быть наведено с добавлением ATR и CaCl 200 мм2. Как элемент управления митохондрии можно инкубировали с 1 мм CsA для 5 минут перед измерением, которое препятствует открытию mPTP. Предыдущие исследования показали калибровочных кривых поглощения как функция процент опухшие митохондрий14. Было сообщено, что 1 мм CsA, 0,1 мм рутений красный, и равный объем свежего митохондрий (0.5 мг/мл) могут быть добавлены в реакции, когда опухоль была завершена. Потому что CsA и рутений красный может помешать mPTP, открытие в свеже добавлен митохондрий, калибровочных кривых указывают как опухшие митохондрий, так и не распухли митохондрий15. Протокол о митохондриальной припухлость на Ca2 + перегрузки также является эффективным и прямые измерения Ca2 +-индуцированной mPTP открытия.
С момента открытия транспорта Ca2 + в митохондриях из млекопитающих и других высших позвоночных более чем 50 лет тому назад было много исследований о механизмов и функций митохондрий кальция измеряем и приток. Митохондриальной Ca2 + усвоение механизмов содержат митохондриальной Ca2 + Унипорт, быстрого режима или ОЗУ и рианодиновыми рецептор (mRyR)16. Анализов, мы описали выше может оценить Ca2 +-связанные функции митохондрий, просто и эффективно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X. Sun руководил экспериментов. Wei Li выполняются экспериментов. Чэнь Чжан и X. солнца написал бумагу.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантов Грант Грант от NSFC (81371226) и выдающийся ученый Шаньдун (JQ201421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
- Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).
- Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).
- Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
- Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).
- Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).
- Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).
- Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).
- Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).
- Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).
- Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).
- Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).
- Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).
- Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).
