Summary
Ce protocole a pour but de décrire une méthode afin d’examiner la capacité de rétention en Ca2 + et Ca2 +- déclenchée mitochondrial gonflement des mitochondries isolées de SH-SY5Y cellules étape par étape.
Abstract
La production d’ATP par phosphorylation oxydative est la principale fonction des mitochondries. Les mitochondries chez les eucaryotes supérieurs participent également à cytosolique Ca2 + mise en mémoire tampon, et la production d’ATP dans les mitochondries peut être véhiculée par intramitochondrial Ca2 + concentration libre. Capacité de ca2 + rétention peut être considérée comme la capacité des mitochondries pour retenir le calcium dans la matrice mitochondriale. Ca intracellulaire accumulé2 + conduit à la perméabilité de la membrane mitochondriale interne, appelé l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP), ce qui conduit à la fuite des molécules avec un moléculaire poids moins de 1,5 kDa. Ca2 +-a déclenché des mitochondries gonflement est utilisé pour indiquer l’ouverture du mPTP. Nous décrivons ici deux essais afin d’examiner la capacité de rétention en Ca2 + et Ca2 +-a déclenché un gonflement mitochondrique en mitochondries isolées. Après certains montants de Ca2 + sont ajoutés, toutes les étapes peuvent être remplies en une seule journée et enregistrés par un lecteur de microplaques. Ainsi, ces deux tests simples et efficaces peuvent être adoptées pour évaluer le Ca2 +-fonctions mitochondriales liées.
Introduction
Les mitochondries sont les principaux organes cellulaires pour produire près de 95 % de l’ATP utilisé dans les cellules de mammifère par la phosphorylation oxydative. Il est signalé que la concentration micromolaire séquestrée de Ca2 + par les mitochondries, la présence d’ADP et de phosphate inorganique peut être utilisé pour phosphoryler l’ADP à la synthèse d’ATP1. Quand la concentration cytosolique Ca2 + va au-delà d’un seuil, les mitochondries peuvent absorption Ca2 + rapidement et l’efflux il lentement. Ainsi, les mitochondries de fonctionnement peuvent afflux l’augmentation Ca cytosolique2 +. Sans rapport avec la participation de la phosphorylation oxydative, la mitochondrial Ca2 + également prendre part à des signaux de calcium cytosolique et activer le mécanisme apoptotique mitochondriale en provoquant l’ouverture de la PFMP en interne mitochondriale membrane2. Il a été largement reconnu qu’élévation anormale de la Ca intracellulaire2 + peut induire mitochondrial enflure massive en ouvrant le mPTP3. Ainsi, le présent protocole a pour but d’évaluer la fonction mitochondriale en quantifiant la capacité mitochondriale de Ca2 + rétention et Ca2 +-trigged gonflement mitochondrial.
Capacité de rétention en ca2 + est la mesure de la capacité des mitochondries de calcium cytosolique de l’absorption. Mitochondries peuvent mettre en mémoire tampon le calcium libre cytosolique et régulent les processus cellulaires dépendant du calcium par l’absorption de calcium sous forme de précipités inactives. Capacité altérée de Ca2 + rétention se produit dans les phénomènes de stress associés à la limitation de l’énergie et de4,maladies neurodégénératives voire5. Les mitochondries isolées ou cellules perméabilisées digitonine peuvent être utilisés pour identifier la capacité de rétention Ca2 + , et la capacité élevée d’accumuler Ca2 + par les mitochondries isolées avec le glutamate supplementaires et le malate n’est pas effectuée par le procédure d’isolement mitochondrial6. Une quantité titrée de digitonine devrait être utilisée pour permeabilize les membranes plasmiques des différents types de cellules. Le sel de hexapotassium de Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert, un Ca2 +-cellule-imperméants sensible indicateur visible de la lumière-excitables, a été largement utilisé7. Ca2 +-vert colorant fluorescent est un indicateur de faible affinité et utilisée pour montrer que des concentrations2 + Ca libre intracellulaires continuent d’augmenter au cours de reliure prolongée de stimulations (5 min)8. Cette méthode était moins sensible que la technique du filtre radioactif, mais a été grandement simplifiée. Les autres Ca2 + élève fluorescence verte de calcium et l’absorption de Ca2 + par les mitochondries retourne la fluorescence au niveau de référence. Des additions séquentielles de Ca2 + ont été faites jusqu'à ce que les mitochondries n’a pas d’absorption extramitochondrial Ca2 + 9. Un lecteur de microplaques de fluorescence peut être utilisé pour signaler en permanence la fluorescence verte de calcium.
Après accumulation de Ca2 + , les mitochondries dépolarisé, libéré Ca2 + dans le milieu et a commencé à enfler. Ca2 +-a déclenché des mitochondries gonflement est utilisé pour indiquer l’ouverture du mPTP. La microscopie électronique et la diminution de lumière absorbance à 540 nm peut être utilisé pour mesurer le Ca2 +-déclenchée mitochondrial gonflement10,11. Volume de mitochondries peut être directement déterminé par l’angle avant diffusion de la lumière12, où la diminution de l’absorbance reflète gonflement passif de la matrice mitochondriale.
Ici, nous illustrons la méthodologie afin d’examiner la capacité mitochondriale de Ca2 + rétention et Ca2 +-a déclenché un gonflement mitochondrique en mitochondries isolées des cellules SH-SY5Y.
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Protocol
1. isolation des mitochondries
Remarque : Toutes les solutions et les équipements doivent être prérefroidir 0 - 4 ° C et gardés sur glace.
- Semences environ 3 x 106 SH-SY5Y cellules / boîte de Petri de cellule 10 cm. Des cellules de culture en haute-glucose Dulbecco modifiée milieu Eagle avec 10 % sérum de veau fœtal, la pénicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 µg/mL). Maintenir à 37 ° C dans un incubateur contenant 5 % de CO2 pendant la nuit.
NOTE : au moins 1-2 x 107 SH-SY5Y cellules sont nécessaires pour chaque dosage d’isolement. - Retirez le support et laver les cellules avec environ 1 mL de PBS froid glace dans une boîte de Petri de cellulaire de 10 cm 3 fois.
- Ajouter de nouveau 1 mL de PBS froid glace en boîte de Petri de cellule 10 cm et racler les cellules adhérentes dans un nouveau tube de 1,5 mL. Centrifuger à 800 x g pendant 10 min à 4 ° C.
- Au cours de la centrifugation, préparer 5 mL de tampon d’isolement mitochondriale (250 mM saccharose, 10 HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-pipérazine ethanesulfonic acide), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) additionné de 50 μL de stock d’inhibiteurs de la protéase solution (concentration de x 100 ; 1 comprimé sans EDTA dissous dans 500 µL de ddH2O).
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot avec 1 mL de tampon d’isolement mitochondriale. Incuber le tube 1,5 mL sur la glace pendant 30 min.
- Lyser les cellules les suspension avec un homogénéisateur de verre (15 à 25 coups) monter et descendre manuellement sur la glace.
Remarque : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles lorsque les cellules sont homogénéisés. Compter les cellules intactes et les noyaux mis à nu par microscope visuellement et confirmer que > rupture cellulaire 90 % s’est produite. - Transférer l’homogénat dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer les débris (noyaux et des cellules intactes restantes).
- Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min 4 ° C.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube et centrifuger à 14 000 x g pendant 15 min 4 ° C.
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot contenant des mitochondries avec 1 mL de tampon d’isolement mitochondriale.
- Centrifuger la solution pendant 15 min à 14 000 x g 4 ° C pour précipiter les mitochondries.
- Le culot de mitochondries qui en résultent doit être conservé dans la glace et resuspendu dans médias KCl 50-100 μL (KCl 125 mM, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, glutamate de 5 mM, malate de 5 mM et la 2 μM roténone, pH 7,4) selon le volume de granulés avant n’importe quel cul Ay.
- 5 μL de solution mitochondriale permet de mesurer la concentration de protéines mitochondriales de l’essai normalisé de BCA, mesurant OD562 à l’aide d’un lecteur de plaque13.
2. détermination des mitochondries Ca2 + capacité de rétention
- Préparer les médias de KCl et ajouter le Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert à une concentration finale de 0,5 μM avant l’expérience.
- Transférer 1 mL de mitochondries isolées (0,4 mg/mL) dans des milieux de KCl contenant 0,5 μM Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert dans chaque boîte de 6 puits bien.
- Incuber les mitochondries et le Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert dans la plaque de 6 puits à température ambiante, abrie de la lumière ambiante pour 1 min. Ajouter 4 μL aliquotes d’un 20 mM CaCl2 solution (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 20 mM HEPES, glutamate de 5 mM, malate de 5 mM, pH 7,4) à chaque plaque 6 puits, puits à l’aide de la boîte automatique distribuer réglage d’introduire 200 nmol Ca2 +/mg protéine mitochondriale.
- Utiliser un spectromètre à fluorescence pour surveiller les changements de fluorescence toutes les 3 s pendant 2 min avec une longueur d’onde d’excitation de 506 nm et une longueur d’onde d’émission de 531 nm. La plaque est équipée d’agitation à 600 tr/min pour 3 s entre lecture commandée par le logiciel (Figure 1).
- Ajouter une aliquote de 4 μL supplémentaires de 20 mM CaCl2 solution dans chaque puits et surveiller les changements de fluorescence toutes les 3 s pour 2 min. Répétez cette étape jusqu'à ce que la fluorescence augmente avec le temps.
Remarque : Les mitochondries sont mis au défi avec l’addition Ca2 + indiquée par la fluorescence d’enregistrement accrue. Lorsque le mPTP s’ouvre, la fluorescence augmente avec le temps. - Interpréter la quantité totale de Ca2 + ajoutés jusqu'à ce que le mPTP s’ouvre comme la capacité de rétention en2 + Ca.
3. détermination du Ca 2 +-induite de gonflement Mitochondrial
- Préparer les médias KCl avant l’expérience.
- Transférer 1 mL de mitochondries isolées (0,4 mg/mL) dans les médias de KCl dans chaque boîte de 6 puits bien.
- Ajouter 10 μL de 20 mM CaCl2 solution aqueuse (500 nmol/mg de protéine mitochondriale) dans les protéines mitochondriales pour déclencher le gonflement mitochondrial.
- Enregistrer la diminution de l’absorbance à 540 nm toutes les 3 s sur un lecteur de microplaques, commandé par le logiciel pendant 10 min (Figure 2). Les changements de fluorescence sont provoquées par un afflux de solutés à travers la membrane mitochondriale interne.
Remarque : La diminution absorbance à 540 nm correspond aux mitochondries gonflées. Si le lecteur ne respecte pas une diminution de l’absorbance, un plus long intervalle de lecture ou du temps de lecture peuvent être adoptées.
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Representative Results
Représentant les résultats de Ca2 + capacité de rétention :
Les résultats ont été exprimés en valeurs de fluorescence. Avec les impulsions supplémentaires du Ca2 + (200 nmols/mg protéine mitochondriale), la fluorescence a augmenté de double au-dessus de référence avec l’ouverture du mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inhibiteur de Ca2 +-induite par le mPTP ouverture ou 1 μM atractyloside (RTA), un activateur de Ca2 +-induite par le mPTP ouverture, ont été ajoutés dans les mitochondries isolées. Le montant de total Ca2 + jusqu'à ce que l’ouverture du mPTP indiquée par une double augmentation au-dessus de la fluorescence de base a été interprété comme la capacité de rétention en Ca2 + . Nos résultats montrent que la mitochondrial Ca2 + capacité de rétention en traitement de la BKA a été beaucoup plus élevée que dans le groupe de l’ATR. Ces données ont confirmé la mesure appropriée de mitochondrial Ca2 + capacité de rétention (Figure 3).
Résultats de représentant du Ca2 +-induite de gonflement Mitochondrial :
Les résultats ont été exprimés en variation de l’absorbance à 540 nm contre absorbance initiale au cours d’une période de 10 min après l’addition de CaCl2. Déclenchée par l’ajout de Ca2 + (500 nmol/mg protéine mitochondriale), l’absorbance une baisse contrôlée à 540 nm indique le gonflement mitochondrique. Avec le traitement de la BKA ou ATR, la courbe d’étalonnage a montré une diminution légère ou forte par rapport à l’absorbance initiale, indiquant que le BKA peut inhiber mPTP ouverture alors que les ATR peut faciliter le mPTP ouverture (Figure 4).
Figure 1 : les paramètres du logiciel pour mitochondrial Ca2 + rétention capacité dosage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : les paramètres du logiciel pour mitochondrial Ca2 +-déclenchée essai de gonflement mitochondrique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La mesure de la capacité de rétention en Ca2 + . Extra-mitochondrial Ca2 + dans les mitochondries isolées a été mesurée manière fluorométrique avec le Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert en présence de 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) ou contrôle à blanc (CON). Traces de Ca2 + rétention par les mitochondries isolées avec le BKA, ATR et CON ont été mesurées à 506 nm (Ex) et 531 nm (Em) sur un lecteur de microplaques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : La mesure de Ca2 +-induite de gonflement mitochondrial. Ca2 +-gonflement mitochondrial induit de SH-SY5Y en présence de 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) ou contrôle à blanc (CON) était exprimé en une courbe d’étalonnage une diminution de pourcentage de l’initiale absorbance à 540 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole simple et efficace pour le mitochondrial Ca2 + rétention capacité dosage et Ca2 +-déclenchée essai de gonflement mitochondrique.
Pour l’isolement mitochondriale, assurez-vous que tous les matériaux et les tubes sont sur la glace, surtout quand les cellules de l’homogénéisation. 0,25 % de trypsine-EDTA peut également servir pour détacher les cellules du plat pendant 5 min à 37 ° C. Après les coups de 15-25, il est nécessaire d’observer la membrane de la cellule intacte sous le microscope et d’éviter la rupture de la membrane de la mitochondrie. Toutefois, les mitochondries isolées que nous avons obtenus sont des mitochondries bruts et mitochondries purifiés peuvent être obtenus par 1,0 M / 1,5 m gradient discontinu de saccharose. Les caractéristiques biologiques des mitochondries dans les cellules vivantes ressemblent davantage à ceux en vivo que dans les mitochondries isolées en raison des concentrations des composantes moyennes qui entourent les mitochondries. La capacité mitochondriale de Ca2 + rétention ou Ca2 +-essai de gonflement mitochondrial déclenchée a été déterminée dans les conditions sous tension. Pour la détermination du fonctionnement des mitochondries, succinate de 5 mM peut être ajoutée comme substrats respiratoires au lieu de glutamate et malate de6.
Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert (lie Ca2 + avec une affinité de 4,29 ± 0,67 mM), est plus approprié mesurer les concentrations micromolaires de Ca2 + que supérieur affinité colorants tels que fura-2, 7. Après l’ajout du Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert, l’incubation doit être inférieure à 240 s. ajouts successifs de Ca2 + (variant de 25 à 200 nmol) ont été injectés à des intervalles de 1-3 min. Les courbes d’étalonnage montrent les concentrations de Ca2 + que les mitochondries sont incapables de séquestrer, indiquant l’absorption mitochondrique d’impulsions de Ca2 +. Dans le cas contraire, le Ca2 +-liaison vert colorant fluorescent a également été utilisé en calcium signalisation des enquêtes, comme intracellulaire libre Ca2 + mesure de la concentration, influx de Ca2 + suivant et libération et excitation multiphotonique imagerie de Ca2 + dans les tissus vivants.
Pour la détermination du Ca2 + -induite par gonflement mitochondrial, gonflement peut également être induit avec l’ajout de 200 mM ATR et CaCl2. Comme contrôle, mitochondries pourraient être incubés avec 1 mM CsA pendant 5 min avant la mesure, qui inhibe le mPTP ouverture. Recherches antérieures ont montré des courbes d’étalonnage de l’absorbance en fonction du pourcentage de gonflement des mitochondries,14. Il a été signalé que 1 mM CsA, rouge de ruthénium de 0,1 mM, et un volume égal de mitochondries fraîches (0,5 mg/mL) peut être ajouté dans la réaction lorsque gonflement était complète. Parce que le CsA et le rouge de ruthénium peuvent inhiber le mPTP ouvrant dans les mitochondries fraîchement ajoutés, les courbes d’étalonnage indiquent les mitochondries gonflées et mitochondries non bombées15. Le protocole de gonflement mitochondrial lors de surcharge de Ca2 + est également une mesure efficace et directe de Ca2 +-induite par le mPTP ouverture.
Depuis la découverte du transport de Ca2 + par les mitochondries des mammifères et autres vertébrés supérieurs il y a plus de 50 ans, il y a eu beaucoup de recherches sur les mécanismes et les fonctions du flux calcique mitochondriale et afflux. Les mitochondries Ca2 + mécanismes d’absorption contiennent le Ca2 + Uniport mitochondriale, le mode rapid ou RaM et la ryanodine receptor (mRyR)16. Les dosages nous décrit ci-dessus peut évaluer Ca2 +-associés de la fonction mitochondriale simplement et efficacement.
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Disclosures
X. Sun supervisé les expériences. Li Wei a effectué des expériences. Chen Zhang et X. soleil a écrit le livre.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par des subventions de l’attribution de le scientifique exceptionnelle du Shandong (JQ201421) et la subvention de la NSFC (81371226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
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