Neuroscience

Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת Assay ו- Ca^{2 +}-עוררה Assay נפיחות מיטוכונדריאלי

Published: May 1, 2018 doi: 10.3791/56236

¹Department of Neurology, Qilu Hospital of Shandong University, ²Department of Neurology, Qingdao Municipal Hospital, ³Brain Research Institute, Qilu Hospital of Shandong University

Summary

פרוטוקול זה שואפת לתאר שיטה לבחון על Ca^{2 +} שמירה קיבולת ו^{2 +}Ca - עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות של המיטוכונדריה מבודד של SH-SY5Y תאים צעד אחר צעד.

Abstract

הפקת ATP על ידי זרחון חמצוני הוא התפקיד העיקרי של המיטוכונדריה. במיטוכונדריה פרוקריוטים גבוה יותר גם להשתתף cytosolic Ca^{2 +}אגירה, ייצור ATP ב מיטוכונדריאלי יכול להיות מתווכת על-ידי intramitochondrial חינם Ca^{2 +} ריכוז. Ca^{2 +} שמירה קיבולת יכול היה להיחשב ליכולת של המיטוכונדריה לשמור על הסידן המטריצה מיטוכונדריאלי. שהצטברו תאיים Ca^{2 +} מוביל החדירות של קרום מיטוכונדריאלי הפנימי, כינה את הפתיחה של חדירות מיטוכונדריאלי המעבר נקבובית (mPTP), כשבסופו לדליפת של מולקולות עם מולקולרית משקל kDa פחות מ- 1.5. Ca^{2 +}-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. כאן, אנו מתארים שני מבחני לבחון על Ca^{2 +} שמירה קיבולת ו^{2 +}Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד. לאחר כמויות מסוימות של Ca^{2 +} מתווספים, כל השלבים ניתן יהיה להשלים ביום אחד, שהוקלט על ידי קורא microplate. לפיכך, מבחני שני אלה פשוט ויעיל ניתן לאמץ להעריך Ca^{2 +}-הקשורים פונקציות מיטוכונדריאלי.

Introduction

המיטוכונדריה הם האיברים הסלולר העיקרי לייצר כמעט 95% מ- ATP המשמש בתאים בתרבית של זרחון חמצוני. הוא דיווח כי הריכוז micromolar מוחרמת של Ca^{2 +} על ידי המיטוכונדריה, הנוכחות של ADP, פוספט אורגניים ניתן להשתמש כדי phosphorylate ADP סינתזת ATP¹. כאשר הריכוז של Ca cytosolic^{2 +}עובר מעל לסף מסוים, המיטוכונדריה יכול ספיגת Ca^{2 +} במהירות, בזרימת אותו לאט לאט. לפיכך, המיטוכונדריה מתפקדת יכול זרם מוגברת cytosolic Ca^{2 +}. לא רלוונטי-ההשתתפות זרחון חמצוני, מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} גם לקחת חלק אותות cytosolic סידן ו להפעיל את מנגנון מיטוכונדריאלי אפופטוטיים להיפגע על ידי גרימת הפתח של mPTP הפנימי מיטוכונדריאלי ממברנה². זה הוכרה נרחב חריג על ידי העלאת Ca תאיים^{2 +} יכול לגרום נפיחות מסיבית מיטוכונדריאלי על-ידי פתיחת mPTP³. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הפונקציה מיטוכונדריאלי מאת לכימות על Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת ו Ca^{2 +}-trigged מיטוכונדריאלי נפיחות.

Ca^{2 +} שמירה התפוסה היא מידת היכולת של המיטוכונדריה ספיגת הסידן cytosolic. המיטוכונדריה ניתן מאגר הסידן חינם cytosolic, לווסת סידן תלוית תהליכים תאיים על ידי ספיגת הסידן בצורה של פוחת משקעים לא פעיל. Ca לקוי^{2 +} שמירה קיבולת מתרחשת מתח תופעות הקשורות באנרגיה הגבלה,⁴^,של מחלות ניווניות אפילו⁵. המיטוכונדריה מבודד או תאים digitonin permeabilized יכול לשמש כדי לזהות את Ca^{2 +} השמירה קיבולת, ואת היכולת מוגברות לצבור Ca^{2 +}על ידי המיטוכונדריה מבודד עם נוספים גלוטמט, בנויים לא מושפע על ידי בידוד מיטוכונדריאלי נוהל⁶. כמות titrated של digitonin צריך לשמש permeabilize של ממברנות פלזמה של סוגי תאים שונים. Hexapotassium מלח Ca^{2 +}-איגוד ירוק הפלורסנט, Ca^{2 +}-אינדיקטור רגיש תא-impermeant אור-טמפרמנט גלוי, היה בשימוש נרחב⁷. Ca^{2 +}-איגוד ירוק הפלורסנט מחוון נמוך-זיקה ולא להשתמש בו כדי להראות כי תאיים חינם Ca^{2 +}ריכוזים ימשיכו לעלות במהלך ממושך (5 דקות) stimulations⁸. שיטה זו היה פחות רגיש יותר הטכניקה מסנן רדיואקטיבי, אולם היה לפשוט מאוד. נוספים Ca^{2 +}מעלה סידן ירוק פלורסצנטיות, Ca^{2 +}תפיסה על ידי המיטוכונדריה ומחזירה את קרינה פלואורסצנטית בסיסית. תוספות רציפים של Ca^{2 +} נעשו עד המיטוכונדריה נכשלה ספיגת extramitochondrial Ca^{2 +} ⁹. קורא microplate קרינה פלואורסצנטית ניתן לדווח באופן רציף על ידי קרינה פלואורסצנטית סידן ירוק.

לאחר צבירת^{2 +}Ca, המיטוכונדריה depolarized שוחרר Ca^{2 +} לתוך המדיום, החלה להתנפח. Ca^{2 +}-עוררה המיטוכונדריה נפיחות משמש לציון פתיחת mPTP. מיקרוסקופ אלקטרוני ו של הפחתת ספיגת האור-540 nm יכול לשמש כדי למדוד את Ca^{2 +}-עוררה מיטוכונדריאלי נפיחות¹⁰^,¹¹. המיטוכונדריה נפח יכול להיקבע באופן ישיר על ידי קדימה זווית פיזור אור¹², איפה ירידות ספיגת לשקף פסיבית נפיחות של המטריקס מיטוכונדריאלי.

כאן, אנחנו להמחיש את המתודולוגיה לבחון על Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת ו^{2 +}Ca-עוררה נפיחות מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד מתאי SH-SY5Y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד של המיטוכונדריה

הערה: כל פתרונות וציוד צריך להיות precooled 0 - 4 מעלות צלזיוס, נשמרים על קרח.

זרעי בערך 3 x 10⁶SH-SY5Y תאים לכל מאכל תרבות תא 10 ס מ. התרבות התאים Dulbecco גבוהה-גלוקוז המתואמת של הנשר בינוני עם סרום שור עוברית 10%, פניצילין (100 U/mL)-סטרפטומיצין (100 µg/mL). לשמור על 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור המכילה 5% CO₂ בן לילה.
הערה: לפחות 1-2 x 10 תאים⁷SH-SY5Y יש צורך בכל assay בידוד.
להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS קר קרח בצלחת תרבות תא 10 ס מ 3 פעמים.
הוסף חדש 1 מ"ל של PBS קר קרח לתוך צלחת תרבות תא 10 ס מ, לגרד את תאים חסיד לתוך צינור 1.5 mL החדש. צנטריפוגה ב 800 x g דקות 10-4 מעלות צלזיוס.
במהלך צנטריפוגה, להכין מאגר בידוד מיטוכונדריאלי 5 מ"ל (250 מ מ סוכרוז, 10 מ מ HEPES (חומצה ethanesulfonic-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine 4), 10 מ מ אשלגן כלורי, 1.5 mM MgCl₂, 1 מ מ EDTA) בתוספת μL 50 מניות מעכבי פרוטאז פתרון (100 x ריכוז; 1 טבליה נטולת EDTA מומס µL 500 של ddH₂O).
הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר עם 1 מ"ל בידוד מיטוכונדריאלי המאגר. דגירה הצינור 1.5 mL על קרח למשך 30 דקות.
Lyse התאים מושעה עם מהמגן זכוכית (15-25 משיכות) למעלה ולמטה באופן ידני על קרח.
הערה: ודא כי קיימים אין בועות כאשר התאים הם הומוגני. לספור את התאים שלם ואת הגרעינים חשופות על ידי מיקרוסקופ מבחינה ויזואלית, לאשר את זה > 90% תא שבירה אירעה.
להעביר את homogenate לתוך צינור 1.5 mL צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C לפנות את הפסולת (גרעינים, התאים שנותרו ללא פגע).
להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 mL החדש צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות 4 ° C.
להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש ו צנטריפוגה ב 14,000 x g למשך 15 דקות 4 ° C.
הסר את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה המיטוכונדריה עם 1 מ"ל בידוד מיטוכונדריאלי המאגר.
Centrifuge הפתרון למשך 15 דקות ב g 14,000 x 4 ° C, כדי לזרז את המיטוכונדריה.
בגדר המיטוכונדריה וכתוצאה מכך חייב להיות כל הזמן על קרח, resuspended בתקשורת 50-100 μL אשלגן כלורי (125 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ K₂HPO₄, 1 מ MgCl₂, 20 מ מ. HEPES, גלוטמט 5 מ"מ, 5 מ"מ בנויים, ו- 2 μM rotenone, pH 7.4) על פי האחסון גלולה לפני כל התחת אחד בשני.
השתמש μL 5 של פתרון מיטוכונדריאלי כדי למדוד את ריכוז חלבון מיטוכונדריאלי על ידי תקן assay BCA, מדידה OD562 באמצעות קורא¹³לצלחת.

2. קביעת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} השמירה קיבולת

להכין כלי התקשורת אשלגן כלורי ולהוסיף Ca^{2 +}-איגוד הפלורסנט ירוק ריכוז סופי של 0.5 μM לפני הניסוי.
העברת 1 מ"ל של המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג/מ"ל) באשלגן כלורי המדיה המכילה 0.5 μM Ca^{2 +}-איגוד ירוק הפלורסנט לתוך כל צלחת 6-ובכן, ובכן.
דגירה המיטוכונדריה ו- Ca^{2 +}-איגוד הפלורסנט ירוקים בצלחת 6-ובכן בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור מקיף עבור aliquots μL להוסיף 4 1 מינימלית של 20 מ מ פתרון₂ CaCl (20 מ מ CaCl₂, 127 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl₂ 20 מ מ HEPES, גלוטמט 5 מ"מ, 5 מ"מ בנויים, pH 7.4) כל צלחת 6-ובכן ובכן באמצעות האוטומטי לוותר על הגדרת להציג 200 nmol Ca מיטוכונדריאלי^{2 +}/mg/חלבון.
להשתמש ספקטרומטר פלורסצנטיות לעקוב אחר שינויים פלורסצנטיות כל 3 s למשך 2 דקות עם אורך גל עירור של 506 ננומטר, אורך גל של פליטה של 531 ננומטר. הצלחת מצויד רועד ב 600 סל ד 3 s בין קריאות נשלט על ידי תוכנה (איור 1).
להוסיף על aliquot 4 μL נוספים של 20 מ מ CaCl₂ פתרון טוב לכל ולעקוב אחר השינויים פלורסצנטיות כל 3 s עבור 2 דק. חזור על שלב זה עד זריחה עולה עם הזמן.
הערה: המיטוכונדריה מאותגרים עם מוסף Ca^{2 +}שצוין על-ידי קרינה פלואורסצנטית ההקלטה מוגברת. עם פתיחת mPTP, זריחה עולה עם הזמן.
לפרש את הסכום הכולל של Ca^{2 +} להוסיף עד mPTP פותח לקיבולת Ca^{2 +} השמירה.

3. קביעה של Ca ^{2 +}-induced נפיחות מיטוכונדריאלי

להכין כלי התקשורת אשלגן כלורי לפני הניסוי.
1. להעביר 1 מ"ל של המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג/מ"ל) בתקשורת אשלגן כלורי לתוך כל צלחת 6-טוב טוב.
להוסיף 10 μL של 20 מ מ CaCl₂ תמיסה מימית (500 nmol/mg מיטוכונדריאלי חלבון) לתוך חלבון מיטוכונדריאלי לעורר מיטוכונדריאלי נפיחות.
שיא הירידה ספיגת-540 nm כל 3 s על קורא microplate נשלט על ידי תוכנה עבור 10 דקות (איור 2). השינויים פלורסצנטיות נגרמות על ידי זרם של מומסים בגבול על פני קרום פנימי מיטוכונדריאלי.
הערה: ספיגת ירד ב- 540 nm מקביל המיטוכונדריה נפוחות. אם הקורא לא לצפות לירידה ספיגת, יותר זמן קריאה מרווח או זמן קריאה יכול להיות מאומץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות נציג של Ca^{2 +} שמירה קיבולת:
התוצאות היו הביע כערכים זריחה. עם פולסים נוספת של Ca^{2 +} (200 nmols/mg מיטוכונדריאלי חלבון), ידי קרינה פלואורסצנטית מוגברת על ידי כפול מעל הבסיס עם פתיחת mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), מעכב של Ca^{2 +}-induced mPTP הפתיחה, או atractyloside μM 1 (ATR), activator Ca^{2 +}-induced mPTP הפתיחה, נוספו המיטוכונדריה מבודד. כמות סה כ הוסיף Ca^{2 +} עד mPTP הפתיחה שמסומן על ידי עלייה כפול מעל ידי קרינה פלואורסצנטית בסיסית היה מתפרש כ- Ca^{2 +} שמירה קיבולת. הנתונים שלנו הראו מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} השמירה הקיבולת בטיפול BKA היה גבוה בהרבה מאשר ב- ATR קבוצה. נתונים אלה אישר את המדידה מתאימים של מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} שמירה קיבולת (איור 3).

התוצאות נציג של Ca^{2 +}-induced מיטוכונדריאלי נפיחות:
התוצאות היו המבוטא באחוזים לשינויים ספיגת-540 nm לעומת ספיגת הראשונית במהלך תקופה של 10 דקות לאחר התוספת של CaCl₂. המופעלות על-ידי התוספת של Ca^{2 +}(500 nmol/mg מיטוכונדריאלי חלבון), ספיגת ירד למצלמות 540 nm המצוין של נפיחויות מיטוכונדריאלי. עם הטיפול BKA או ATR, עקומת כיול הראה ירידה קלה או חדה לעומת ספיגת הראשונית, המציין כי BKA יכול לעכב mPTP פתיחת בזמן ATR יכול להקל את mPTP פתיחה (איור 4).

איור 1: הגדרות התוכנה עבור מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} שמירה קיבולת assay. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: הגדרות התוכנה עבור Ca מיטוכונדריאלי^{2 +}-עוררה מיטוכונדריאלי assay נפיחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: המדד של Ca^{2 +} שמירה קיבולת. תוספת-מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} בתוך המיטוכונדריה מבודד נמדדה fluorometrically עם Ca^{2 +}-איגוד ירוק הפלורסנט בנוכחות μM 5 bongkrekate (BKA), μM 1 atractyloside (ATR) או בקרה הריק (קון). עקבות של Ca^{2 +} שמירה על ידי המיטוכונדריה מבודד עם BKA, ATR קון נמדדו ב- 506 nm (לשעבר) ו 531 nm (Em) על קורא microplate. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: המדד של Ca^{2 +}-induced נפיחות מיטוכונדריאלי. Ca^{2 +}-נפיחות מיטוכונדריאלי המושרה של SH-SY5Y בנוכחות 5 μM bongkrekate (BKA), μM 1 atractyloside (ATR) או בקרה הריק (קון) בא לידי ביטוי כמו עקומת כיול ירד אחוז של ספיגת הראשונית-540 nm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו המתואר פרוטוקול פשוטה ויעילה מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} שמירה קיבולת assay, Ca^{2 +}-עוררה מיטוכונדריאלי assay נפיחות.

הבידוד מיטוכונדריאלי, ודא כי כל חומרי, צינורות הם על קרח, במיוחד כאשר homogenizing את התאים. 0.25% טריפסין-EDTA יכול לשמש גם כדי לנתק תאים מן המנה למשך 5 דקות ב 37 º C. לאחר 15-25 משיכות, יש צורך לבחון את קרום התא שלם תחת המיקרוסקופ ולהימנע הנזק של קרום המיטוכונדריה. עם זאת, המיטוכונדריה מבודד כי השגנו הם המיטוכונדריה גולמי, המיטוכונדריה מטוהרים ניתן לקבל באמצעות 1.0 M / 1.5 m סוכרוז מקוטע הדרגתי. המאפיינים הביולוגיים של המיטוכונדריה בתאים חיים דומים יותר האלה אין ויוו מאשר בתוך המיטוכונדריה מבודד בשל הריכוזים של הרכיבים בינוני המקיפים המיטוכונדריה. Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} שמירה קיבולת או^{2 +}Ca-מופעלות assay נפיחות מיטוכונדריאלי נקבע בתנאים אנרגיה. לקביעת המיטוכונדריה מתפקדת, ניתן להוסיף 5 מ מ succinate בשם דיאלקטריים הנשימה במקום גלוטמט, בנויים⁶.

Ca^{2 +}-איגוד הפלורסנט ירוק (נקשר Ca^{2 +} עם זיקה של 4.29 ± 0.67 מ מ), היא מתאימה יותר למדידת ריכוזי micromolar של Ca^{2 +} מאשר צבעי זיקה גבוהה יותר כגון fura-2 ⁷. לאחר התוספת של Ca^{2 +}-איגוד הפלורסנט ירוק, הדגירה חייבת להיות פחות מ-240 ש תוספות רצופים של Ca^{2 +} (שונים, מ 25-200 nmol) הוזרקו במרווחים 1-3 דקות. עקומות כיול הצג את ריכוזי Ca^{2 +}להם המיטוכונדריה אין אפשרות לבודד, המציין את ספיגת מיטוכונדריאלי של פולסים של Ca^{2 +}. אחרת, Ca^{2 +}-איגוד ירוק הפלורסנט שימש גם סידן איתות חקירות, כגון תאיים חינם Ca^{2 +} ריכוז למדידה, Ca^{2 +} זרם הבאים, שחרור, עירור multiphoton הדמיה של Ca^{2 +} ברקמות החי.

לקביעת Ca^{2 +}-induced הנפיחות מיטוכונדריאלי, נפיחות יכולה להיגרם גם עם התוספת של 200 מ"מ ATR ו CaCl₂. כפקד, המיטוכונדריה יכול להיות מודגרות עם 1 מ מ CsA במשך 5 דקות לפני המדידה, אשר עכבות mPTP את הפתיחה. מחקרים קודמים הראו עקומות כיול של ספיגת כפונקציה של אחוז המיטוכונדריה נפוחות¹⁴. דווח כי 1 מ מ CsA, רותניום 0.1 מ מ אדום, ניתן להוסיף אמצעי שווה של המיטוכונדריה טריים (0.5 מ"ג/מ"ל) בהתגובה כאשר הנפיחות הושלמה. כי CsA, רותניום אדום יכול לעכב את mPTP פתיחת בתוך המיטוכונדריה הוסיף טרי, עקומות כיול מציינים המיטוכונדריה נפוחות והן נפוחות ללא המיטוכונדריה¹⁵. הפרוטוקול של נפיחות מיטוכונדריאלי על Ca^{2 +} עומס הוא גם מדידה ישירה ויעילה של Ca^{2 +}-induced mPTP הפתיחה.

הגילוי של תחבורה של Ca^{2 +} על ידי המיטוכונדריה של יונקים ו חולייתנים הגבוהים אחרים לפני יותר מ-50 שנה, מאז הרבה מחקר על מנגנוני והפונקציות של סידן מיטוכונדריאלי בזרימת, זרם. מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} ספיגת המנגנונים להכיל את Ca^{2 +}uniporter מיטוכונדריאלי, את מצב מהירה או RaM ו ה-קולטן (mRyR) ryanodine¹⁶. מבחני שהסברנו לעיל יכול להעריך Ca^{2 +}-הקשורים פונקציה מיטוכונדריאלי בפשטות וביעילות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אקס השמש פיקח הניסויים. ויי לי לבצע את הניסויים. חן ג'אנג, אקס שמש כתבה בעיתון.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מענק של מדען מצטיין של שאנדונג (JQ201421), מענק NSFC (81371226).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca²⁺-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl₂	Sigma-Aldrich	00457
K₂HPO₄	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl₂	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001