이 프로토콜 Ca2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로-트리거 SH-SY5Y의 고립 된 미토 콘 드리 아의 붓기 미토 콘 드리 아 세포 단계.
산화 인 산화에 의해 ATP의 생산은 미토 콘 드리 아의 주 기능은 이다. 더 높은 진핵생물의 미토 콘 드리 아도 참여할 cytosolic 캘리포니아2 + 버퍼링, 그리고 미토 콘 드리 아에서 ATP 생산 intramitochondrial 무료 캘리포니아2 + 농도 의해 중재 될 수 있다. 캘리포니아2 + 보존 용량 미토 콘 드 리아 매트릭스에 칼슘을 유지 하는 미토 콘 드리 아의 기능으로 간주 될 수 있습니다. 축적 된 세포내 캘리포니아2 + 리드 안 미토 콘 드리 아 막의 침투성을 미토 콘 드리 아 침투성 전환 기 공 (mPTP)는 분자와 분자의 유출에는 리드 무게 1.5 kDa의 개통 되 나. 캘리포니아2 +-트리거 미토 콘 드리 아 붓기 mPTP 개방을 나타내는 데 사용 됩니다. 여기, 우리가 설명 하는 Ca2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사를 두 분석-고립 된 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 붓기를 트리거. 특정 양의 캘리포니아2 + 추가 후 모든 단계는 하루에 완료 고 microplate 리더에 의해 기록 될 수 있습니다. 따라서,이 두 가지 간단 하 고 효과적인 분석 평가 Ca2 +채택 될 수-미토 콘 드 리아 기능 관련.
미토 콘 드리 아 ATP 산화 인 산화에 의해 포유류 세포에서 사용의 거의 95%를 생산 주요 세포 기관 이다. 그것은 그의 캘리포니아2 + 미토 콘 드리 아에 의해 분리 된 micromolar 집중, ADP와 무기 인산 염의 존재를 사용할 수 있는 합성 ATP1ADP phosphorylate 보고. Cytosolic 캘리포니아2 + 의 농도 임계값 이상 되 면 미토 콘 드리 아 수 이해 캘리포니아2 + 급속 하 게 경과 하 고 그것은 천천히. 따라서, 작동 미토 콘 드리 아 수 유입 증가 cytosolic 캘리포니아2 +. 없는 산화 인 산화에 참여 하는 미토 콘 드 리아 Ca2 + 또한 cytosolic 칼슘 신호에 참여 및 미토 콘 드리 아 내에는 mPTP의 개방을 유도 하 여 미토 콘 드 리아 apoptotic 메커니즘을 활성화 막2. 그것은 널리 인정 되었습니다 세포내 캘리포니아2 + 의 비정상적인 상승 mPTP3여 미토 콘 드리 아 대규모 붓기를 일으킬 수 있다. 따라서,이 프로토콜 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 평가 하는 것을 목표로-유혹 trigged 미토 콘 드 리아 붓기.
캘리포니아2 + 보존 용량 글귀 cytosolic 칼슘을 미토 콘 드리 아의 능력의 측정입니다. 미토 콘 드리 아 무료 cytosolic 칼슘을 버퍼링 하 고 비활성 침전의 형태로 칼슘 통풍 관에 의해 칼슘-의존 세포질 과정을 조절 수 있습니다. 장애인된 캘리포니아2 + 보존 용량 에너지 제한 및 심지어 neurodegenerative 질병4,5와 관련 된 스트레스 현상에서 발생 합니다. 고립 된 미토 콘 드리 아 또는 셀 digitonin permeabilized Ca2 + 보존 용량, 식별 하는 데 수 고 축적 캘리포니아2 + 추가 조미료와 malate 고립 된 미토 콘 드리 아에 의해 상승 된 능력에 의해 영향을 받지는 합니다 미토 콘 드리 아 격리 절차6. 적정 한 양의 digitonin 플라즈마 막 종류의 다른 세포를 permeabilize를 사용 해야 합니다. 캘리포니아2 +의 hexapotassium 소금-녹색 형광 염료, 캘리포니아2 +바인딩-민감한 셀 impermeant 표시 빛 고르기 표시기, 널리7되었습니다. 캘리포니아2 +-(5 분) stimulations8연장 바인딩 녹색 형광 성 염료는 낮은 선호도 표시기 이며 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도 동안 상승 계속 표시 하는 데 사용. 이 방법은 방사성 필터 기법 보다 덜 민감한 하지만 매우 간단 하 게 했다. 추가 Ca2 + 칼슘 녹색 형광을 끌어올리고 고 미토 콘 드리 아에 의해 Ca2 + 통풍 관 기준선에 형광을 반환 합니다. 캘리포니아2 + 의 순차적 추가 mitochondria 통풍 관 extramitochondrial Ca2 + 9실패까지 했다. 형광 microplate 리더는 지속적으로 칼슘 녹색 형광을 보고 사용할 수 있습니다.
캘리포니아2 + 축적, 후 미토 콘 드리 아 depolarized, 캘리포니아2 + , 매체에 발표 고 팽창 하기 시작 했다. 캘리포니아2 +-트리거 미토 콘 드리 아 붓기 mPTP 개방을 나타내는 데 사용 됩니다. 전자 현미경 및 측정 캘리포니아2 +데 540 nm 수에 빛 흡 광도 감소-미토 콘 드 리아 붓기10,11을 실행. 앞으로 각 산란12, 흡수도 감소 미토 콘 드 리아 매트릭스의 수동 붓기를 반영 미토 콘 드리 아 볼륨을 직접 확인할 수 있습니다.
여기, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사 방법론 설명-SH-SY5Y 세포에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 붓기를 트리거.
여기, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +에 대 한 간단 하 고 효과적인 프로토콜을 설명-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 유발.
미토 콘 드리 아 격리에 대 한 모든 자료와 튜브는 얼음, 특히 때 세포 조직 확인 하십시오. 37 ° c.에 5 분 동안 접시에서 세포를 분리 하 0.25% trypsin EDTA는 사용할 수 있습니다. 후에 15-25 선, 그?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 산동의 뛰어난 과학자 (JQ201421)와 NSFC (81371226)에서 부여의 부여에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |