Summary
Denne protokollen skal beskriver en metode for å undersøke Ca2 + varmekapasitet og Ca2 +- utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier av SH-SY5Y celler trinnvis.
Abstract
Produksjon av ATP ved oxidative fosforylering er den primære funksjonen av mitokondrier. Mitokondrier i høyere eukaryoter også delta i cytosolic Ca2 + bufring og ATP produksjonen i mitokondrie kan være formidlet av intramitochondrial gratis Ca2 + konsentrasjon. Ca2 + oppbevaring kapasitet kan betraktes som evnen til mitokondrier beholde kalsium i mitokondrie matrisen. Akkumulert intracellulær Ca2 + fører til permeabilitet av interne mitokondrie membran, kalt åpningen av mitokondrie permeabiliteten overgangen pore (mPTP), noe som fører til lekkasje av molekyler med en molekylær vekt mindre enn 1,5 kDa. Ca2 +-utløst mitokondrier hevelse brukes til å angi mPTP åpningen. Her beskriver vi to analyser for å undersøke Ca2 + varmekapasitet og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier. Etter visse mengder av Ca2 + er lagt, kan alle trinnene fullført i en dag og registrert av en microplate-leser. Dermed disse to enkle og effektive analyser kan bli vedtatt for å vurdere Ca2 +-relaterte mitokondrie funksjoner.
Introduction
Mitokondrier er de viktigste cellulære organene å produsere nesten 95% av ATP brukes i pattedyrceller av oxidative fosforylering. Det er rapportert at sequestered micromolar konsentrasjonen av Ca2 + av mitokondrier, ADP, og uorganiske fosfat kan brukes til å phosphorylate ADP syntese ATP1. Når konsentrasjonen av cytosolic Ca2 + går over en viss grense, mitokondrier kan uptake Ca2 + raskt og middelklasseinnbyggere det sakte. Dermed kan fungerende mitokondrier tilstrømningen av økt cytosolic Ca2 +. Irrelevant for deltakelse i oxidative fosforylering, den mitokondrie Ca2 + også ta del i cytosolic kalsium signaler og aktivere mitokondrie apoptotisk mekanismen av inducing åpningen av mPTP i indre mitokondrie membran2. Det har vært anerkjent at unormal rettighetsutvidelse intracellulær Ca2 + kan indusere mitokondrie massiv hevelse ved å åpne mPTP3. Derfor denne protokollen skal vurdere funksjonen mitokondrie av kvantifisere mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet og Ca2 +-trigged mitokondrie hevelse.
Ca2 + oppbevaring kapasitet er måling av evnen til mitokondrier til opptak cytosolic kalsium. Mitokondrier kan bufre cytosolic gratis kalsium og regulere kalsium-avhengige mobilnettet prosesser av kalsium opptak i form av inaktive precipitates. Nedsatt Ca2 + varmekapasitet oppstår i stress fenomener forbundet med energi begrensning og selv nevrodegenerative sykdommer4,5. Isolert mitokondrier eller digitonin-permeabilized celler kan brukes til å identifisere Ca2 + oppbevaring kapasitet og forhøyet muligheten til å samle Ca2 + av isolerte mitokondrier med ytterligere glutamat og malate påvirkes ikke av de Mitokondrielt isolasjon prosedyren6. En titrerte mengde digitonin skal brukes til å permeabilize plasma membraner av forskjellige celletyper. Hexapotassium salt av Ca2 +-bindende grønne fluorescerende farge, en Ca2 +-sensitive celle-impermeant synlig lys-nervøs indikator, har vært mye brukt7. Ca2 +-bindende grønn fluorescerende fargestoff er en lav-affinitet indikator og brukes til å vise at intracellulær gratis Ca2 + konsentrasjoner fortsetter å stige under langvarig (5 min) stimulations8. Denne metoden ble mindre sensitive enn radioaktivt filter teknikken, men ble sterkt forenklet. Den ekstra Ca2 + løfter kalsium grønne fluorescens og Ca2 + opptaket av mitokondrier returnerer fluorescensen som opprinnelig plan. Sekvensielle filer av Ca2 + ble gjort til mitokondrier kunne opptak extramitochondrial Ca2 + 9. En fluorescens microplate leser kan brukes kontinuerlig rapportere kalsium grønne fluorescens.
Etter Ca2 + opphopning, mitokondrier depolarized, utgitt Ca2 + til medium, og begynte å svelle. Ca2 +-utløst mitokondrier hevelse brukes til å angi mPTP åpningen. Elektronmikroskop og nedgangen i lys absorbans ved 540 nm kan brukes til å måle Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse10,11. Mitokondrier volum kan direkte bestemmes av fremover vinkel lysspredning12, der nedgang i absorbansen gjenspeiler passiv hevelse i mitokondrie matrix.
Her vi illustrere metodikk for å undersøke mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier fra SH-SY5Y celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolering av mitokondrier
Merk: Alle løsninger og utstyr skal være forkjøles og lagres til 0 - 4 ° C og holdt på is.
- Frø ca 3 x 106 SH-SY5Y celler per 10 cm celle kultur parabol. Kultur celler i høy-glukose Dulbecco modifiserte Eagle medium med 10% fosterets bovin serum, penicillin (100 U/mL)-streptomycin (100 µg/mL). Opprettholde på 37 ° C i en inkubator inneholder 5% CO2 over natten.
Merk: minst 1-2 x 107 SH-SY5Y celler kreves for hver isolasjon analysen. - Fjerne mediet og vask cellene med ca 1 mL av is kaldt PBS i 10 cm celle kultur parabol 3 ganger.
- Legg til ny 1 mL av is kaldt PBS i 10 cm celle kultur parabol og skrape tilhenger cellene til en ny 1,5 mL tube. Sentrifuger 800 x g i 10 min på 4 ° C.
- Under sentrifugering, forberede 5 mL mitokondrie isolasjon buffer (250 mM sukrose, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin ethanesulfonic acid), 10 mM KCl, 1, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) med 50 μL av protease hemmere lager løsning (100 x konsentrasjonen, 1 EDTA-fri tavle oppløst i 500 µL ddH2O).
- Fjern nedbryting og resuspend pellets med 1 mL av mitokondrie isolasjon buffer. Inkuber 1,5 mL røret på is 30 min.
- Lyse suspendert cellene med et glass homogenizer (15-25 slag) opp og ned manuelt på is.
Merk: Kontroller at det ikke er noen bobler når celler er homogenisert. Telle intakt celler og bared kjerner av mikroskopet visuelt og bekrefte at > 90% celle brudd har oppstått. - Overføre til homogenate i en 1,5 mL tube og sentrifuge 1000 x g for 5 min på 4 ° C fjerne rusk (kjerner og gjenværende intakt celler).
- Overføre nedbryting i en ny 1,5 mL tube og sentrifuge 1000 x g for 5 min 4 ° C.
- Overføre nedbryting til en ny rør og sentrifuger 14.000 x g i 15 min 4 ° C.
- Fjern nedbryting og resuspend pellets inneholder mitokondrier med 1 mL av mitokondrie isolasjon buffer.
- Sentrifuge løsningen for 15 min 14.000 x g 4 ° C for å utløse mitokondrier.
- Den resulterende mitokondrier pellet må holdes på is og resuspended i 50-100 μL KCl media (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM glutamat, 5 mM malate, og 2 μM rotenon, pH 7.4) ifølge pellet volumet før noen ass ay.
- Bruke 5 μL mitokondrie løsning for å måle mitokondrie protein konsentrasjonen av standard BCA analysen, måle OD562 bruker en plate leser13.
2. fastsettelse av mitokondrie Ca2 + varmekapasitet
- Forberede KCl media og legge den Ca2 +-binding grønne fluorescerende fargestoff til en siste konsentrasjon på 0,5 μM før eksperimentet.
- Overføre 1 mL av isolerte mitokondrier (0,4 mg/mL) i KCl mediet som inneholder 0,5 μM Ca2 +-bindende grønne fluorescerende fargestoff inn hver 6-vel plate også.
- Inkuber mitokondrier og Ca2 +-bindende grønne fluorescerende fargestoff i 6-vel platen ved romtemperatur beskyttes omgivelseslys for 1 min. legge 4 μL dele en 20 mm CaCl2 løsning (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 20 mM HEPES, 5 mM glutamat, 5 mM malate, pH 7.4) til hver 6-vel plate godt bruke automatisk dispensere innstillingen å innføre 200 nmol Ca2 +/mg mitokondrie protein.
- Bruk en fluorescens spectrometer overvåke endres fluorescens hver 3 s 2 min med en eksitasjon bølgelengde 506 nm og et utslipp bølgelengden til 531 nm. Platen er utstyrt med skjelvende på 600 rpm for 3 s mellom målinger kontrollert av programvare (figur 1).
- Legge til en ekstra 4 μL aliquot 20 mM CaCl2 løsning i hver brønn og overvåke endres fluorescens hver 3 s 2 min. Gjenta dette trinnet til fluorescensen øker med tiden.
Merk: Mitokondrier blir utfordret med den ekstra Ca2 + angitt av økt opptak fluorescens. Når du mPTP åpner, øker fluorescensen med tiden. - Tolke den totale mengden av Ca2 + lagt til mPTP åpnes som Ca2 + oppbevaring kapasitet.
3. fastsettelse av Ca 2 +-indusert mitokondrie hevelse
- Forberede KCl media før eksperimentet.
- Overføre 1 mL av isolerte mitokondrier (0,4 mg/mL) i KCl medier til hver 6-vel plate også.
- Tilsett 10 μL 20 mm CaCl2 vandig løsning (500 nmol/mg mitokondrie protein) til mitokondrie protein utløser mitokondrie hevelse.
- Ta opp nedgangen i absorbans ved 540 nm hver 3 s på en microplate leser kontrollert av programvare for 10 min (figur 2). Fluorescens endringene er forårsaket av en strøm av solutes over mitokondrie interne membran.
Merk: Redusert absorbansen på 540 nm tilsvarer hovne mitokondrier. Hvis leseren ikke overholder en nedgang i absorbansen, kan en lengre lesing intervall eller lesetiden vedtas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant resultatene av Ca2 + oppbevaring kapasitet:
Resultatene ble uttrykt som fluorescens verdier. Med de ekstra pulser av Ca2 + (200 nmols/mg mitokondrie protein), fluorescens økte med dobbel over grunnlinjen med mPTP åpningen. 5 μM Bongkrekate (BKA), en inhibitor av Ca2 +-indusert mPTP åpning eller 1 μM atractyloside (ATR), en aktivator av Ca2 +-indusert mPTP åpning, ble lagt til i isolerte mitokondrier. Mengden totalt lagt Ca2 + til mPTP åpner angitt med en dobbel økning over grunnlinjen fluorescens ble tolket som Ca2 + oppbevaring kapasitet. Våre data viste at mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet i BKA behandling var mye høyere enn i ATR-gruppen. Disse dataene bekreftet egnet måling av mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet (Figur 3).
Representant resultatene av Ca2 +-indusert mitokondrie hevelse:
Resultatene ble uttrykt som prosent endringer i absorbans ved 540 nm versus første absorbansen i en periode på 10 min etter at CaCl2. Utløst av tillegg av Ca2 + (500 nmol/mg mitokondrie protein), redusert absorbansen overvåket på 540 nm angitt i mitokondrie swellings. Med behandlingen av BKA eller ATR, kalibreringskurven viste en svak eller skarp nedgang sammenlignet med første absorbansen, indikerer at BKA kan hemme mPTP åpne mens ATR kan rette mPTP åpning (Figur 4).
Figur 1: for for mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: for for mitokondrie Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Måling av Ca2 + varmekapasitet. Ekstra-Mitokondrielt Ca2 + i isolerte mitokondrier ble målt fluorometrically med Ca2 +-bindende grønne fluorescerende fargestoff i nærvær av 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) eller tom kontroll (CON). Spor av Ca2 + oppbevaring av isolerte mitokondrier BKA, ATR og CON ble målt på 506 nm (Ex) og 531 nm (Em) på en microplate leser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Måling av Ca2 +-indusert mitokondrie hevelse. Ca2 +-indusert mitokondrie hevelse av SH-SY5Y i nærvær av 5 μM bongkrekate (BKA), 1 μM atractyloside (ATR) eller tom kontroll (CON) ble uttrykt som en prosentandel redusert kalibreringskurven av den første absorbansen ved 540 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her vi beskrev en enkel og effektiv protokoll for mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet analysen og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse analysen.
For mitokondrie isolasjon, sikre at alle materialer og rør er på is, spesielt når homogenisere cellene. 0.25% trypsin-EDTA kan også brukes til å koble celler fra parabolen for 5 min på 37 ° C. Etter 15-25 slag er det nødvendig å observere intakt cellemembranen under mikroskopet og unngå brudd på mitokondrier membranen. Men isolert mitokondrier vi fikk er råolje mitokondrier og renset mitokondrier kan oppnås gjennom 1,0 M / 1.5M usammenhengende sukrose gradering. Biologiske egenskapene til mitokondrier i levende celler er mer lik de i vivo enn i isolerte mitokondrier grunn av konsentrasjonen av middels komponentene som omgir mitokondrier. Mitokondrielt Ca2 + oppbevaring kapasitet eller Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse analysen identifiserte under energi forhold. For fastsettelse av fungerende mitokondrier legges 5 mM succinate til som åndedretts underlag i stedet for glutamat og malate6.
Ca2 +-bindende grønne fluorescerende farge (binder Ca2 + med tilhørighet i 4.29 ± 0.67 mM), er mer egnet til å måle micromolar konsentrasjoner av Ca2 + enn høyere affinitet fargestoffer som fura-2 7. Etter tillegg av Ca2 +-bindende grønne fluorescerende farge, inkubering må være mindre enn 240 s. påfølgende tillegg av Ca2 + (varierer fra 25-200 nmol) ble injisert i 1-3 min intervaller. Kalibrering kurver viser konsentrasjonen av Ca2 + som mitokondrier ikke å beslaglegge, indikerer mitokondrie opptaket av pulser av Ca2 +. Ellers Ca2 +-bindende grønn fluorescerende fargestoff ble også brukt i kalsium signalering undersøkelser, som intracellulær gratis Ca2 + konsentrasjon måling, følgende Ca2 + tilstrømningen og løslate og multiphoton eksitasjon bildebehandling av Ca2 + i levende vev.
For fastsettelse av Ca2 + -indusert mitokondrie hevelse, hevelse kan også bli satt med tillegg av 200 mM ATR og CaCl2. Som en kontroll, kan mitokondrier være inkubert med 1 mM CsA i 5 minutter før måling, som hemmet mPTP åpne. Tidligere forskning viste kalibrering kurver av absorbansen som en funksjon av andelen hovne mitokondrier14. Det ble rapportert at 1 mM CsA, 0,1 mM ruthenium rød, og en lik mengde frisk mitokondrier (0,5 mg/mL) kan legges i reaksjonen hevelse var ferdig. Fordi CsA og selskapets røde kan hemme mPTP åpner i den nylig lagt mitochondria, angir kalibrering kurvene både hovne mitokondrier og ikke-hovne mitokondrier15. Protokollen for mitokondrie hevelse på Ca2 + overbelastning er også en effektiv og direkte måling av Ca2 +-indusert mPTP åpning.
Siden oppdagelsen av Ca2 + av mitokondrier fra pattedyr og andre høyere virveldyr mer enn 50 år siden, har det vært mye forskning på mekanismer og mitokondrie kalsium middelklasseinnbyggere og tilstrømningen funksjonene. Mitokondrielt Ca2 + opptaket mekanismer inneholder mitokondrie Ca2 + uniporter, rask modus eller RaM og ryanodine reseptor (mRyR)16. Analyser vi beskrevet ovenfor kan evaluere Ca2 +-relaterte mitokondrie funksjonen bare og effektivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
X. solen overvåket eksperimenter. Wei Li utført eksperimenter. Chen Zhang og X. solen skrev papiret.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra grant fremragende vitenskapsmann Shandong (JQ201421) og støtte fra NSFC (81371226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
- Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).
- Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).
- Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
- Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).
- Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).
- Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).
- Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).
- Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).
- Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).
- Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).
- Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).
- Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).
- Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).
